姜洋 劉煥臻 李開(kāi)隆

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

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大青楊再生體系的優(yōu)化1)

姜洋 劉煥臻 李開(kāi)隆

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究不同培養(yǎng)基和不同激素質(zhì)量濃度配比對(duì)大青楊無(wú)菌苗葉片植株再生體系的影響，優(yōu)化大青楊植株再生體系。結(jié)果表明：對(duì)大青楊不定芽誘導(dǎo)的影響最大為激素NAA，其次是培養(yǎng)基類(lèi)型，最后是激素6-BA；不定芽增殖的影響最大是NAA，其次是培養(yǎng)基類(lèi)型，最后是6-BA；對(duì)叢生苗生根的影響最大是激素類(lèi)型，然后是培養(yǎng)基類(lèi)型；培養(yǎng)基類(lèi)型和激素的質(zhì)量濃度對(duì)大青楊再生體系有著較明顯的影響。最適宜大青楊分化的培養(yǎng)基為：WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)100%；最適宜大青楊叢生芽增殖的培養(yǎng)基為：MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，芽健壯；最適宜大青楊生根的培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1 mg/L IBA，經(jīng)過(guò)14 d生根，生根率達(dá)100%。

大青楊；再生體系；培養(yǎng)基；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

大青楊(PopulusussuriensisKom.)是東北林區(qū)的鄉(xiāng)土樹(shù)種[1]，耐寒、速生，是分布區(qū)內(nèi)山地營(yíng)造速生豐產(chǎn)用材林的主要樹(shù)種之一[2]。其木質(zhì)較軟，韌性好，材質(zhì)潔白而致密，耐腐朽，是造紙及膠合板材極好的原料。隨著東北天然林的停止采伐，可用于營(yíng)造大青楊人工林的林地多是荒山荒地和退耕還林地等。地條件就需要抗旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)的大青楊新品種。分子育種與常規(guī)育種相比，具有目的性強(qiáng)、育種周期短、可以打破物種間雜交不親和的界限等優(yōu)點(diǎn)[3]。大青楊抗逆基因工程育種逐漸引起人們重視[4]。

建立高效的再生體系是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)[5]。盡管?chē)?guó)內(nèi)外對(duì)青楊的組織培養(yǎng)進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)大青楊的再生體系的研究卻鮮有報(bào)道。僅李世承[6]以大青楊嫩葉、新梢為材料進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，而對(duì)影響不定芽誘導(dǎo)分化主要因子則沒(méi)有進(jìn)行相應(yīng)的研究。郭斌[7]以美洲黑楊×大青楊的5個(gè)雜種無(wú)性系為對(duì)象建立離體培養(yǎng)體系及葉片再生體系，各個(gè)無(wú)性系的葉片再生能力差異顯著，特別適合于177無(wú)性系，靳春蓮對(duì)大青楊建立了組培體系，并對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化作了研究，但其建立的組培體系轉(zhuǎn)化率低，并對(duì)組培體系缺乏系統(tǒng)的研究。鑒于此，為了得到大青楊植株高效的再生體系。本文以大青楊無(wú)菌苗葉片為外植體，研究不同培養(yǎng)基類(lèi)型、不同激素組合配比對(duì)其不定芽誘導(dǎo)、增殖和生根能力的影響，以期獲得大量的優(yōu)質(zhì)的無(wú)菌苗，為大青楊遺傳改良和快速繁育提供依據(jù)。

1 材料與方法

以東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的大青楊組培苗為材料，開(kāi)展大青楊再生體系研究。

不定芽誘導(dǎo)：取生長(zhǎng)3周的大青楊組培苗，用解剖刀把葉片組織切成0.5～1.0 cm2的小塊，然后葉片背面向下接種在分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基的種類(lèi)和添加激素的配比按照三因素(培養(yǎng)基類(lèi)型為第一因素A、6-BA不同質(zhì)量濃度為第二因素B、NAA不同質(zhì)量濃度為第三因素C)三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行。培養(yǎng)基類(lèi)型包括，MS、WPM、B5；激素6-BA設(shè)計(jì)3種不同質(zhì)量濃度(0.3、0.5和0.8 mg/L)，激素NAA設(shè)計(jì)3種不同質(zhì)量濃度(0.02、0.05、0.10 mg/L)(表1)。每種處理接種6～10個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)3次。2周后觀(guān)察并記錄不定芽的生長(zhǎng)狀況。

表1 不同培養(yǎng)基及激素配比對(duì)大青楊葉片不定芽誘導(dǎo)情況

注：表中同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

不定芽增殖：依據(jù)不定芽增殖(表2)在MS和WPM分別加入質(zhì)量濃度為0.05、0.06、0.08、0.10 mg/L 6-BA和0.01、0.02、0.03、0.04 mg/L NAA(培養(yǎng)基類(lèi)型為第一因素A、6-BA不同質(zhì)量濃度為第二因素B、NAA不同質(zhì)量濃度為第三因素C)配制培養(yǎng)基。將不定芽團(tuán)接種于上述按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同處理組合培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基放在3個(gè)不定芽增殖的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種2個(gè)不定芽團(tuán)，置于組培室中進(jìn)行培養(yǎng)。2周后觀(guān)察不定芽的增殖的情況。

表2 不同培養(yǎng)基及激素配比對(duì)大青楊不定芽增殖的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

叢生苗生根培養(yǎng)：將經(jīng)過(guò)不定芽增殖培養(yǎng)的大青楊，用消毒后的剪子剪下，轉(zhuǎn)移到以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基并附加IBA和NAA 2種激素的培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基類(lèi)型為第一因素A、IBA不同質(zhì)量濃度為第二因素B、NAA不同質(zhì)量濃度為第三因素C)(表3)，處理組合按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)施，每個(gè)處理配制10瓶，在每瓶中接種3棵大青楊幼苗，置于組培室中進(jìn)行培養(yǎng)，2周之后統(tǒng)計(jì)大青楊組培苗的生根數(shù)量。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：采用EXECL進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和平均數(shù)的計(jì)算，采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多重比較分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為百分?jǐn)?shù)，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)反正弦轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行方差分析和多重比較，篩選適合大青楊再生體系每個(gè)時(shí)期適宜的培養(yǎng)基和激素配比。

不定芽誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生的不定芽的葉片數(shù)/接種的葉片總數(shù))×100%；

生根率=(生根的組培苗數(shù)/全部的組培苗數(shù))×100%。

表3 同培養(yǎng)基及激素配比對(duì)大青楊生根的影響

注：表中部分?jǐn)?shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 大青楊葉片誘導(dǎo)不定芽組培體系

將帶有傷口的大青楊無(wú)菌苗葉片接種到三因素、三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基上，14 d后記錄觀(guān)察試驗(yàn)結(jié)果(表1和圖1)，結(jié)果說(shuō)明，9個(gè)試驗(yàn)處理組合不定芽誘導(dǎo)率差異達(dá)到顯著水平(0.05水平)，其中L2、L4和L5組合最好，不定芽的誘導(dǎo)率達(dá)到100%。極差分析說(shuō)明，NAA對(duì)大青楊葉片分化的影響最大，其次是6-BA，再次是培養(yǎng)基的種類(lèi)。

方差分析(表4)說(shuō)明，培養(yǎng)基種類(lèi)激素6-BA、NAA等不同質(zhì)量濃度對(duì)大青楊葉片分化誘導(dǎo)作用都有極顯著水平的差異。通過(guò)多重比較說(shuō)明，在大青楊不定芽誘導(dǎo)中，NAA的影響大于培養(yǎng)基類(lèi)型的影響，大于6-BA的影響。從分析結(jié)果來(lái)看A2B2C2最高，即大青楊葉片誘導(dǎo)不定芽生成的最佳培養(yǎng)基為WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。因?yàn)檎辉囼?yàn)組合中沒(méi)有出現(xiàn)在正交實(shí)驗(yàn)表中，所以單獨(dú)將此組合單獨(dú)做一個(gè)試驗(yàn)(圖2)。從培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，該組合培養(yǎng)出的不定芽翠綠，生芽率到達(dá)100%。

圖1 大青楊葉片不定芽誘導(dǎo)(組培14 d發(fā)芽的葉片)

表4 不同培養(yǎng)基及激素配比對(duì)大青楊葉片不定芽誘導(dǎo)的方差分析

變異系數(shù)來(lái)源平方和自由度均方F培養(yǎng)基類(lèi)型3333．620021666．8148．986??6-BA質(zhì)量濃度1924．22302962．1125．187??NAA質(zhì)量濃度5947．159422973．58016．032??

注：** 表示在0.01水平差異顯著。

2.2 大青楊不定芽增殖培養(yǎng)體系的優(yōu)化

將分化14 d的叢生芽放入MS、WPM 2種不同培養(yǎng)基、添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA的激素進(jìn)行不定芽增殖培養(yǎng)，15 d后觀(guān)察不定芽數(shù)、測(cè)定苗高并進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表5)表明，不同質(zhì)量濃度的NAA對(duì)苗高和出芽數(shù)的影響都達(dá)到了極顯著水平，而6-BA沒(méi)有作用，不同培養(yǎng)基對(duì)苗高的影響達(dá)到極顯著水平。培養(yǎng)中加入NAA能促進(jìn)不定芽增殖，并且在每個(gè)組合中，NAA質(zhì)量濃度為0.01時(shí)出芽數(shù)量最高。出芽數(shù)最多的是L1組合，平均苗高最高的是L14組合。從多重比較可以看出，L1與其他組合差異性顯著。綜上結(jié)果，在大青楊不定芽增殖培養(yǎng)基中，NAA的影響大于培養(yǎng)基類(lèi)型的影響，大于6-BA的影響。大青楊不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，叢生苗粗壯且出芽較多，葉片嫩綠色。

圖2 WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA條件下不定芽誘導(dǎo)情況

表5 不同培養(yǎng)基及激素對(duì)大青楊不定芽增殖影響的方差分析

變異系數(shù)來(lái)源因變量離差平方和自由度均方F值培養(yǎng)基出芽數(shù)量23．8331 3．0001．027苗 高487．3581487．3587．341??6-BA質(zhì)量濃度出芽數(shù)量19．66736．5562．244苗 高86．229328．7431．183NAA質(zhì)量濃度出芽數(shù)量53．500317．8336．106??苗 高992．6763330．8926．131??

注：** 表示在0.01水平差異顯著。

2.3 大青楊生根體系的優(yōu)化

在MS、1/2MS培養(yǎng)基及不同質(zhì)量濃度的IBA、NAA對(duì)大青楊試管苗生根誘導(dǎo)15 d觀(guān)察結(jié)果表明，L1 1/2MS+0.1 mg/L IBA的生根最好，平均生根數(shù)最高，達(dá)到7根。各個(gè)組合根生長(zhǎng)情況(圖3)中可以發(fā)現(xiàn),L1、L2、L5、L6都長(zhǎng)出須根且根健壯。加入NAA的L3、L4、L7、L8產(chǎn)生黃色愈傷小塊或產(chǎn)生輻射性的短根。方差分析(表6)說(shuō)明，激素類(lèi)型極顯著影響組培苗生根，IBA能促進(jìn)試管苗須根的形成，而NAA對(duì)管苗根的形成沒(méi)有作用。在大青楊生根培養(yǎng)中，激素類(lèi)型的影響大于培養(yǎng)基類(lèi)型的影響。綜上分析，最適合大青楊組培苗生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L IBA。

圖3 大青楊生根培養(yǎng)

變異來(lái)源平方和自由度均方F培養(yǎng)基類(lèi)型 0．7381 0．7380．132 激素類(lèi)型649．6983216．56638．726??

注：** 表示在0.01水平下差異顯著。

2.4 移栽煉苗

大青楊生根苗經(jīng)煉苗后移栽至由V(草泥炭)∶V(珍珠巖)∶V(蛭石)=3∶1∶1的混合基質(zhì)中，30 d后幼苗開(kāi)始長(zhǎng)出新葉，根系牢固，長(zhǎng)成成苗(圖4)。

3 結(jié)論與討論

組織培養(yǎng)方法的優(yōu)化是基因工程育種的基礎(chǔ)例如抗除草劑玉米[8]、抗蟲(chóng)楊樹(shù)[9-10]等轉(zhuǎn)基因新品種或新品系的獲得，都是建立在一個(gè)行之有效的組培優(yōu)化體系基礎(chǔ)上。

雖然早在20世紀(jì)30年代，國(guó)外就開(kāi)始了對(duì)楊屬植物組織培養(yǎng)的研究[11]，我國(guó)于20世紀(jì)70年代對(duì)楊屬植物進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，分別開(kāi)展了。小葉楊(PopulussimoniiCarr)、小黑楊(Populussimonii×Populusnigra)、青楊(PopuluscathayanaRehd.)等楊樹(shù)離體花藥培養(yǎng)研究[12]。近年來(lái)對(duì)青楊派植物組織培養(yǎng)的研究也取得了不少進(jìn)展，李開(kāi)隆[13]對(duì)香楊(Populuskoreana)的頂芽和腋芽進(jìn)行組織培養(yǎng)和植株研究。李世承以大青楊嫩葉、新梢為材料進(jìn)行植物組織培養(yǎng)。靳春蓮建立大青楊組培體系。這些為大青楊的研究奠定了重要的基礎(chǔ)，但對(duì)于大青楊再生體系優(yōu)化研究還未有。組培體系的再生效率也亟需提高。

圖4 大青楊生根苗移栽效果

在大青楊再生體系優(yōu)化中，外源激素的配比和培養(yǎng)基類(lèi)型對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育影響較大。本實(shí)驗(yàn)中6-BA和NAA之間的質(zhì)量濃度配比與培養(yǎng)基類(lèi)型不同對(duì)不定芽分化、不定芽增殖的誘導(dǎo)率和出芽數(shù)影響不同。從不定芽分化實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基類(lèi)型不同，組培苗所呈現(xiàn)出來(lái)的狀態(tài)不同(表1，圖1)，加入MS培養(yǎng)基中的芽的狀態(tài)呈現(xiàn)乳白色并且稀疏，而其他兩種類(lèi)型培養(yǎng)基在分化中，葉片愈傷部位首先出現(xiàn)黃色愈傷小塊，其后在愈傷小塊上長(zhǎng)有芽點(diǎn)。在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，通過(guò)不定芽誘導(dǎo)體系進(jìn)行直觀(guān)分析得出WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA有助于大青楊分化(表1，圖1)。隨后的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)了此組合出芽率為100%，芽點(diǎn)翠綠(圖2)。章林[14]在對(duì)銀中楊的組培研究中也發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 6-BA時(shí)，促進(jìn)嫩芽的分化和生長(zhǎng)，且達(dá)到最高的分化率。在不定芽增殖過(guò)程中，杜曉艷[15]等發(fā)現(xiàn)6-BA是適合青楊不定芽誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分裂素，但是不定芽的質(zhì)量下降，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/L時(shí)出現(xiàn)了明顯的苗徒長(zhǎng)，莖細(xì)長(zhǎng)現(xiàn)象。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/L時(shí)，不定芽發(fā)生黃化死亡現(xiàn)象，所以低濃度的NAA有助于青楊生長(zhǎng)發(fā)育。所以，本研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)中激素濃度都在此濃度最高值以下。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，大青楊葉片在MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA處理中培養(yǎng)出來(lái)的莖較嫩、較多，此處理是最高效的處理組合。IBA和NAA為最常用于木本植物生根的激素，結(jié)合本試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)最基本的培養(yǎng)基為MS和1/2MS。在生根培養(yǎng)試驗(yàn)組合中，1號(hào)組合(1/2MS+0.1 mg/L IBA)對(duì)大青楊的生根最有利，且苗的長(zhǎng)勢(shì)較好，根系較為發(fā)達(dá)，葉片綠，莖段粗壯(表6，圖3)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)加入低質(zhì)量濃度的IBA有助于大青楊的生根，加入NAA發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生氣生根和愈傷小塊，不利于大青楊的生根培養(yǎng)。尤其是在對(duì)大青楊遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程，較多的根有利于植物篩選過(guò)程的培養(yǎng)，以及后期移栽過(guò)程中對(duì)充足養(yǎng)分的吸收。另外，本研究采用葉片作為外植體[17]材料，其便于裁剪，接觸光的面積大，也便于農(nóng)桿菌充分高效地侵染。所以，本研究?jī)?yōu)化的高效再生體系能為大青楊的遺傳轉(zhuǎn)化奠定良好的基礎(chǔ)。

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OptimizingPopulusussuriensisRegeneration System//

Jiang Yang, Liu Huanzhen, Li Kailong(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(4)：28-32.

By orthogonal experiments, we studied the effects of different media and different hormone combinations on the regeneration system ofPopulusussuriensisleaves, and optimized the regeneration system. The concentration of NAA had the strongest inducing effect on adventitious buds, types of culture medium had the moderate, concentration of 6-BA had the weakest induding effect. The effects of concentration of NAA during proliferation of adventitious buds was more than types of culture medium, and more than concentration of 6-BA. The effect of hormone was more than culture medium type during rooting. The types of culture medium and the concentration of hormone had significant effect on the regeneration system. The most suitable medium for differentiation of adventitious buds was WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA, with the inducing rate of 100%. The most suitable medium for buds proliferation was MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA, and the plantlets were healthy. The most suitable medium for rooting was 1/2 MS+0.1 mg/L IBA with the rooting rate of 100%.

PopulusussuriensisKom.; Regeneration system; Medium; Orthogonal experimental design

姜洋，男，1991年4月生，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail:395121052@qq.com。

李開(kāi)隆，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail:likailongnefu@sohu.com。

2016年11月21日。

Q943.1

1)“十三五”國(guó)家科技計(jì)劃課題(2016YFD0600404)。

責(zé)任編輯：潘 華。