馮波 朱騰飛 張弛 董博 周博如

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

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楊樹(shù)MYB基因應(yīng)答非生物脅迫的表達(dá)特性1)

馮波 朱騰飛 張弛 董博 周博如

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

MYB轉(zhuǎn)錄因子以其含有的保守MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，是植物轉(zhuǎn)錄因子中數(shù)量最多的家族之一，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝的調(diào)節(jié)。利用生物信息學(xué)分析獲得222條楊樹(shù)MYB基因，用實(shí)時(shí)定量PCR篩選出8條對(duì)鹽脅迫有強(qiáng)烈應(yīng)答的基因，研究其在鹽、干旱、ABA等非生物脅迫下的表達(dá)模式；結(jié)果表明：這8條MYB基因雖然在楊樹(shù)根、莖、葉組織中均有表達(dá)，但是在不同脅迫條件和不同組織中的表達(dá)水平明顯不同。在鹽和干旱脅迫條件下，8個(gè)基因在根、莖、葉中均被誘導(dǎo)表達(dá)，表現(xiàn)為相似的表達(dá)模式。在ABA處理?xiàng)l件下，而多數(shù)基因無(wú)明顯應(yīng)答。說(shuō)明楊樹(shù)MYB基因在應(yīng)答環(huán)境變化與激素調(diào)節(jié)中具有不同的作用，并且在不同組織中的作用有所差異。

MYB基因；脅迫； RT-PCR；干旱；鹽；ABA

轉(zhuǎn)錄因子也稱(chēng)反式作用因子，是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，并對(duì)轉(zhuǎn)錄有激活或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白[1]。轉(zhuǎn)錄因子是具有序列特異位點(diǎn)的結(jié)合活性或含有同已知DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同特征的蛋白質(zhì),因而能保證目的基因以特定的強(qiáng)度、在特定的時(shí)間與空間表達(dá)。MYB轉(zhuǎn)錄因子存在于所有真核生物中，癌基因v-MYB是第一個(gè)在禽成髓細(xì)胞性白血病病毒中被鑒定出來(lái)的MYB基因[2]。在脊椎動(dòng)物中，c-MYB,A-MYB和B-MYB 3個(gè)與v-MYB相關(guān)的基因與細(xì)胞增殖、分裂以及凋亡密切相關(guān)[3]，在昆蟲(chóng)、真菌、黏性菌中也存在類(lèi)似的同源基因[4]。來(lái)自玉米的MYB基因Zea mays C參與花青素合成，與脊椎動(dòng)物c-MYB基因高度同源[5]。相對(duì)于真菌和動(dòng)物的MYB基因家族，植物編碼的MYB基因數(shù)量更多，是植物轉(zhuǎn)錄因子基因家族中最大的家族之一[6-9]。MYB轉(zhuǎn)錄因子的共同特征是含有MYB結(jié)構(gòu)域，MYB結(jié)構(gòu)域由51～52個(gè)氨基酸殘基組成，包含一系列保守的氨基酸殘基和間隔序列[10]。依據(jù)MYB轉(zhuǎn)錄因子含有的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)目和種類(lèi),分為MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB四類(lèi)。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程中具有重要作用[11-12]。其中，R2R3-MYB基因參與植物對(duì)環(huán)境脅迫如干旱、鹽、寒冷的應(yīng)答反應(yīng)[13]。過(guò)量表達(dá)OsMYB3R-2基因的轉(zhuǎn)基因水稻的細(xì)胞分裂指數(shù)增加，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐冷能力[14]。過(guò)量表達(dá)OsMYB4基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥耐寒冷脅迫能力明顯提高[15]。擬南芥AtMYB96屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)ABA和生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[16]。轉(zhuǎn)AtMYB15基因擬南芥對(duì)外源ABA敏感性提高，抗干旱和耐寒冷能力明顯增強(qiáng)[17]。本研究為探明楊樹(shù)MYB基因在應(yīng)答非生物脅迫中的作用，利用RT-qPCR方法從222個(gè)楊樹(shù)MYB基因中鑒定出71個(gè)對(duì)鹽脅迫應(yīng)答的基因，選擇其中8條應(yīng)答鹽脅迫最明顯的基因，分析其在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式，了解楊樹(shù)MYB家族基因在響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中的作用，為明確楊樹(shù)MYB家族基因功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為培養(yǎng)1個(gè)月的小黑楊組培苗，在60%～70%相對(duì)濕度、14 h光/10 h暗、平均溫度25 ℃條件下，在水中繼續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月后分為12組，每3組施以1種處理。分別用水(作為對(duì)照組)、0.15 mol/L NaCl、25% PEG(聚乙二醇)-6000、50 μmol/L ABA處理24 h后，分別將樣本的根、莖、葉保存-80 ℃，用于后續(xù)RNA提取和基因表達(dá)分析，所有處理和對(duì)照均包含3個(gè)生物重復(fù)。

RNA提?。簩悠酚谝旱醒杆傺心ィ凑罩街参颮NA提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司，中國(guó))說(shuō)明書(shū)操作，提取總RNA，用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)(威爾明頓德分光光度計(jì)技術(shù)，美國(guó))測(cè)定RNA濃度，檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。

RT-qPCR反應(yīng)：用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司，大連，中國(guó))反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將合成的cDNA用無(wú)菌水稀釋100倍，作為后續(xù)實(shí)時(shí)定量PCR的模板。實(shí)時(shí)定量PCR在ABI7500熒光PCR儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進(jìn)行，所用MYB基因引物如表1，其中ACT、EF1為內(nèi)參引物[11]。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下：10 μL SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)、0.4 μL LofROXRefer-enceDyeII(TaKaRa)、正反向引物各0.4 μmol/L、cDNA模板2 μL(相當(dāng)于100 ng RNA)。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，60 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。用Kenneth和Thomas報(bào)道的2-ΔΔCt法[12]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR反應(yīng)所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)答鹽脅迫楊樹(shù)MYB家族基因的鑒定

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中得到222個(gè)楊樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列[9]，利用BIOXM軟件設(shè)計(jì)引物，用RT-qPCR鑒定應(yīng)答鹽脅迫的基因，我們將相對(duì)表達(dá)量變化2倍以上定義為應(yīng)答鹽脅迫基因，結(jié)果有71個(gè)MYB基因應(yīng)答鹽脅迫，占32%。其中27個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，占12.16%；44個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因，占19.82%。本研究選擇在鹽脅迫條件下相對(duì)表達(dá)量提高4倍以上的8個(gè)MYB基因，分析其在不同脅迫條件下的表達(dá)模式。這8個(gè)MYB基因分別是：PtrMYB17、PtrMYB96、PtrMYB139、PtrMYB162、PtrMYB164、PtrMYB168、PtrMYB185和PtrMYB212。比較這8個(gè)MYB蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)可以看出，其氨基酸殘基數(shù)在235～674之間，分子質(zhì)量在32.78～73.67 Ku之間，等電點(diǎn)在5.91～8.75之間(表2)。用Bioedit軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除PtrMYB139，其余7個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子均含有典型的R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2 楊樹(shù)MYB基因應(yīng)答鹽脅迫表達(dá)模式

在鹽脅迫條件下，8個(gè)MYB基因在葉中均被誘導(dǎo)表達(dá)，但在根和莖中的表達(dá)水平與在葉中的表達(dá)水平有所不同，多數(shù)基因在根和莖中的表達(dá)水平明顯比葉中的表達(dá)水平低。其中，PtrMYB139、PtrMYB164和PtrMYB185在葉中受鹽脅迫誘導(dǎo)水平最高，均在8倍以上；PtrMYB162、PtrMYB168和PtrMYB212在根莖葉中均對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)出明顯的應(yīng)答反應(yīng)；PtrMYB17、PtrMYB96只在葉中顯著上調(diào)表達(dá)，而在莖和葉中表達(dá)水平無(wú)明顯變化，說(shuō)明PtrMYB17、PtrMYB96主要在葉中響應(yīng)鹽脅迫(表3)?？梢?jiàn)，楊樹(shù)MYB基因在鹽脅迫條件下會(huì)表現(xiàn)出一定的組織特異性。

表2 楊樹(shù)MYB基因蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

圖1 楊樹(shù)MYB結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)

基因名稱(chēng)根的相對(duì)表達(dá)量莖的相對(duì)表達(dá)量葉相對(duì)表達(dá)量PtrMYB171．429±0．051．136±0．076．948±0．92PtrMYB961．244±0．101．265±0．357．101±0．48PtrMYB1391．609±0．621．392±0．388．052±0．99PtrMYB1626．704±0．212．918±0．024．262±0．43PtrMYB1649．501±1．262．427±0．0410．797±0．97PtrMYB1682．519±08．750±0．117．714±1．15PtrMYB1854．454±0．241．902±0．988．558±0．39PtrMYB2122．655±0．062．934±0．054．212±0．90

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3 楊樹(shù)MYB基因應(yīng)答干旱脅迫表達(dá)模式

在干旱迫條件下，8個(gè)MYB基因在葉中均被誘導(dǎo)表達(dá)，但多數(shù)基因在根和莖中的表達(dá)水平比在葉中的表達(dá)水平低，這種基因表達(dá)趨勢(shì)與在鹽脅迫條件下的的表達(dá)趨勢(shì)相似(表4)。PtrMYB17、PtrMYB139和PtrMYB168只在葉中被干旱誘導(dǎo)表達(dá)2倍以上，在根和莖中的表達(dá)水平變化不明顯；PtrMYB164和PtrMYB185在根和葉中可被干旱誘導(dǎo)表達(dá)，而在莖中的表達(dá)水平則無(wú)明顯變化；PtrMYB162在莖和葉中可被干旱誘導(dǎo)表達(dá)，而在根中的表達(dá)水平則無(wú)明顯變化；PtrMYB96在干旱脅迫條件下，無(wú)論在根和莖中還是葉中，其表達(dá)水平變化不明顯，均未超過(guò)2倍?？梢?jiàn)PtrMYB96雖然響應(yīng)鹽脅迫，但對(duì)干旱脅迫無(wú)明顯應(yīng)答(表4)。說(shuō)明有些楊樹(shù)MYB基因在干旱脅迫條件下也表現(xiàn)出一定的組織特異性。

表4 楊樹(shù)MYB基因應(yīng)答PEG脅迫表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.4 楊樹(shù)MYB基因應(yīng)答ABA表達(dá)模式

在ABA處理?xiàng)l件下，多數(shù)基因表達(dá)水平的變化幅度都沒(méi)有超過(guò)2倍。8個(gè)楊樹(shù)MYB基因中PtrMYB164在根莖葉中均被誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)模式與在鹽和干旱脅迫條件下的表達(dá)模式相似。PtrMYB17和PtrMYB168只在根中被誘導(dǎo)表達(dá)，在莖和葉中表達(dá)水平無(wú)明顯變化。PtrMYB96表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，無(wú)論在根和莖還是葉中均為下調(diào)表達(dá)，在響應(yīng)ABA激素誘導(dǎo)過(guò)程中參與負(fù)調(diào)控(表5)。說(shuō)明受鹽和干旱誘導(dǎo)表達(dá)的楊樹(shù)MYB基因只有很少基因受ABA的影響。

表5 楊樹(shù)MYB基因應(yīng)答ABA表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3 結(jié)論與討論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常會(huì)受到各種生物脅迫和非生物脅迫的影響[18]。為了抵御各種逆境脅迫，植物通常會(huì)誘導(dǎo)激活一系列基因表達(dá)和一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[19]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的家族之一[9],參與植物細(xì)胞內(nèi)多種生理生化反應(yīng)，參與一系列植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和應(yīng)答非生物脅迫，如調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育節(jié)奏和器官形成，影響代謝產(chǎn)物的形成和激素信號(hào)等[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)楊樹(shù)受鹽脅迫時(shí)，許多MYB基因被誘導(dǎo)表達(dá)，且呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。特別是PtrMYB164，無(wú)論在根、莖還是葉中，均是所有基因中上調(diào)水平最顯著的。有關(guān)MYB基因參與鹽脅迫應(yīng)答以及調(diào)控植物耐鹽脅迫能力的研究已有報(bào)道。擬南芥中AtMYB44和AtMYB2在mRNA水平上對(duì)鹽脅迫均有應(yīng)答響應(yīng)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過(guò)表達(dá)AtMYB44和AtMYB2基因均能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的抗性[23-24]。擬南芥AtMYB41和AtMYB96基因在正常的生長(zhǎng)條件下不表達(dá)，但在干旱、ABA及鹽脅迫條件下則被誘導(dǎo)高水平表達(dá)[25-26]。在植物中過(guò)表達(dá)AtMYB41和AtMYB96基因可提高轉(zhuǎn)基因植株抗旱和耐鹽能力。這些研究說(shuō)明MYB基因參與干旱和鹽脅迫應(yīng)答，并在提高植物抗旱和耐鹽脅迫能力方面發(fā)揮重要作用。脫落酸(ABA)是一種重要植物激素，不僅參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育和氣孔開(kāi)放，還協(xié)調(diào)各種逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中和適應(yīng)各種環(huán)境過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[27]。小麥TaMYB33基因受ABA介導(dǎo)的逆境響應(yīng)信號(hào)調(diào)控，通過(guò)積累滲透壓調(diào)節(jié)物和提高細(xì)胞活性氧清除能力來(lái)提高植物對(duì)干旱和鹽的耐受性[28]。本研究發(fā)現(xiàn)在不同脅迫條件下楊樹(shù)PtrMYB164基因在根莖葉中均被誘導(dǎo)表達(dá)。而PtrMYB96在鹽脅迫條件下在葉片中大量表達(dá)，在干旱條件下在根和莖葉中變化不明顯，在ABA條件下無(wú)論在根和莖還是葉中均為下調(diào)表達(dá)。說(shuō)明楊樹(shù)應(yīng)答逆境脅迫的MYB基因和應(yīng)答ABA誘導(dǎo)的MYB基因具有不同的表達(dá)模式。

本研究鑒定出71個(gè)應(yīng)答鹽脅迫的楊樹(shù)MYB基因。其中，8個(gè)高表達(dá)MYB基因在不同組織中應(yīng)答鹽和干旱表達(dá)模式相似，但應(yīng)答ABA的表達(dá)模式具有很大差異。楊樹(shù)MYB基因在應(yīng)答環(huán)境變化與激素變化中可能具有不同的作用，并且在不同組織中的作用也有所差異。

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Expression Characteristics of PoplarMYBGene in Response to Abiotic Stresses//

Feng Bo, Zhu Tengfei, Zhang Chi, Dong Bo, Zhou Boru(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(4)：19-22.

MYBtranscription factor is one of the largest number family in plant, which is widely involved in plant growth, development and metabolism regulation, and chartered by its conservedMYBdomain. The total of 222MYBgenes from Populus were obtained by bioinformatics analysis, and 8 of these has a strong response to salt stress by real-time RT-PCR. These 8MYBgenes were highly responsive to salt and drought stress in root, steam and leaf tissues, and showed a similar expression pattern. Whereas, their expression levels was markedly different in various tissues. Under ABA treatment, most of the genes had no obvious response. The poplarMYBgenes play an important role in response to different environments and hormone regulation with different effects in various tissues.

MYB; Stress; RT-PCR; Drought; Salinity; ABA

1)國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610225001)。

馮波，女，1990年5月生，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail:1078182269@qq.com。

周博如，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，副教授。E-mail:boruzhou@yahoo.com。

2016年11月12日。

Q78;S332.1

責(zé)任編輯：潘 華。