蔡 旋,薛慧琴,楊 帆,肖長(zhǎng)峰,杭怡瓊,盧永紅?

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106;2華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,上海200237)

貓須草(Orthosiphon stamineus)是一種生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶地區(qū)的唇形科腎茶屬植物。在東南亞國(guó)家如印度尼西亞、馬來(lái)西亞等廣泛分布,我國(guó)的海南、廣西、云南等也有分布[1]。貓須草提取物已被證實(shí)具有自由基清除、抗菌、抗腫瘤和抗炎癥等多種生物活性[2]。先前的研究已經(jīng)證實(shí)[3-4],貓須草根、莖、葉基本營(yíng)養(yǎng)成分及抗氧化成分類(lèi)似,且都具有良好的抗氧化活性及腸道上皮細(xì)胞保護(hù)作用,腸道上皮細(xì)胞保護(hù)作用與抗氧化作用相關(guān),其中根提取物的抗氧化效果最佳。但由于經(jīng)典的貓須草有效成分提取方法是根據(jù)貓須草的莖和葉優(yōu)化的,采用該方法對(duì)貓須草根進(jìn)行提取時(shí),得率僅9.52%,遠(yuǎn)低于葉(16.70%)和莖(16.64%)。事實(shí)上,貓須草的加工工藝是將貓須草整株拔出,曬干后將莖、葉一起切短,而根部則做丟棄處理,造成了資源浪費(fèi)。優(yōu)化貓須草根的提取工藝,將其提取物作為食品或飼料添加使用,既可以充分利用貓須草資源,又可以減緩動(dòng)物腸道氧化應(yīng)激,起到保護(hù)腸道屏障作用。

貓須草有效成分提取方式已有較多研究,如超臨界萃取法[5]、傳統(tǒng)的浸提法[6]、超聲波輔助浸提法等[7],但針對(duì)飼料添加而言,采用超臨界萃取法成本略高,而有機(jī)溶劑浸提法工藝成熟,設(shè)備簡(jiǎn)單,適合廣大中小企業(yè)使用。超聲波輔助提取技術(shù)近年來(lái)已經(jīng)成熟,許多天然產(chǎn)物提取工廠(chǎng)也已經(jīng)購(gòu)置;超聲波輔助提取可以極大地縮短提取時(shí)間,節(jié)約生產(chǎn)成本;因此本研究采用有機(jī)溶劑超聲波輔助提取法,并對(duì)提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

對(duì)于貓須草有效成分浸提的提取溶劑,Sahib等[8]比較了石油醚、氯仿、甲醇的提取效果,結(jié)果表明,甲醇具有最佳的生物活性。貓須草中主要有效成分是酚酸及黃酮類(lèi)成分,黃酮苷類(lèi)易溶于水,而黃酮類(lèi)化合物大多易溶于醇類(lèi)[9]。因此,針對(duì)貓須草抗氧化成分提取時(shí),研究者通常會(huì)選擇甲醇或乙醇作為提取溶劑,其中以甲醇作為提取溶劑較多見(jiàn)[10-11]。本試驗(yàn)以甲醇-水為提取溶劑,采用超聲波輔助,研究不同提取溫度、提取時(shí)間、甲醇濃度及料液比對(duì)貓須草根中有效成分提取的影響,以期優(yōu)化貓須草根的提取工藝,為貓須草根用于飼料添加劑提供加工工藝依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

貓須草根于2015年夏購(gòu)自廣西玉林中草藥市場(chǎng),為玉林本地農(nóng)戶(hù)種植,當(dāng)年采摘。貓須草根通風(fēng)處陰干48 h后,輕拍除去泥土,多功能中藥粉碎機(jī)粉碎,過(guò)32目篩,粉末于干燥器中保存,經(jīng)直接干燥法測(cè)定,含水率為8.52%。

1.2 儀器與試劑

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

利用控制變量法分別考察甲醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間及料液比對(duì)提取率及提取物還原能力的影響?？疾旒状紳舛葧r(shí),甲醇濃度分別設(shè)為0%、25%、50%、75%、100%,提取溫度為45℃,提取時(shí)間為30 min,固液比為1∶60;考察提取溫度時(shí),提取溫度分別設(shè)為25℃、40℃、55℃、70℃、85℃,甲醇濃度為50%,提取時(shí)間為30 min,固液比為1∶60;考察提取時(shí)間時(shí),提取時(shí)間分別設(shè)為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min,甲醇濃度為50%,提取溫度為55℃,固液比為1∶60;考察固液比時(shí),固液比分別設(shè)為1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100,甲醇濃度為 50%,提取溫度為 55 ℃,提取時(shí)間為 30 min。

提取工藝如下:稱(chēng)取3 g制備好的貓須草根粉末于三角燒瓶中,加入一定量的甲醇∕水提取液,保鮮膜封閉瓶口。在指定溫度下,300 W超聲,時(shí)間依試驗(yàn)要求確定。超聲提取結(jié)束后,提取液經(jīng)雙層紗布粗過(guò)濾,濾液采用抽濾方式三次通過(guò)中速定性濾紙(杭州特種紙業(yè)有限公司),澄清的濾液轉(zhuǎn)入旋蒸瓶中,濾渣再次以同樣工藝抽提,合并兩次濾液,以低于55℃溫度旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)干燥。干燥后刮取樣品稱(chēng)重,并在干燥器中保存樣品,以待后續(xù)試驗(yàn)。

分別以得率和抗氧化能力來(lái)考察貓須草根提取工藝。

1.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取合理水平,進(jìn)行正交試驗(yàn)分析,正交試驗(yàn)流程與單因素試驗(yàn)時(shí)一致。

1.3.3 還原能力的測(cè)定

在設(shè)置土工格柵結(jié)構(gòu)的過(guò)程中，需完善施工技術(shù)方案，提升整體結(jié)構(gòu)的施工建設(shè)水平，保證符合當(dāng)前的施工發(fā)展需求。首先需在基床開(kāi)挖環(huán)節(jié)中開(kāi)展砂墊層的處理工作，逐層進(jìn)行碾壓處理，開(kāi)始鋪設(shè)土工格柵[5]。在鋪設(shè)之后應(yīng)進(jìn)行格柵加筋，保證方向受力的均勻性，縱向搭接長(zhǎng)度符合標(biāo)準(zhǔn)要求，控制在18cm左右，橫向搭接長(zhǎng)度控制在10cm左右。且在鋼筋搭接的位置上，應(yīng)使用塑料帶開(kāi)展綁扎工作，按照1.4m的規(guī)格開(kāi)展間隔鋪設(shè)活動(dòng)，使用U型釘材料開(kāi)展固定工作，以免影響工程的施工效果[6]。

樣品的抗氧化性能通過(guò)測(cè)定樣品的鐵離子還原能力,以維生素C的相當(dāng)量來(lái)表示。稱(chēng)取20 mg維生素 C,定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度為 200 μg∕mL 的溶液。 分別取 0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL,定容至 10 mL,配制成質(zhì)量濃度為 0 μg∕mL、5 μg∕mL、10 μg∕mL、20 μg∕mL、30 μg∕mL、40 μg∕mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在試管中混合1 mL不同濃度樣品(樣品采用50%甲醇配制成1 mg∕mL質(zhì)量濃度)或標(biāo)準(zhǔn)品,2.5 mL 0.2 mol∕L pH 6.6 PB緩沖液,2.5 mL鐵氰化鉀溶液(w∕v);50℃水浴20 min;加入2.5 mL TCA(10%,w∕v),混勻,3 000 r∕min離心10 min,收集上清,取2.5 mL上清液與0.5 mL氯化鐵溶液(0.1%,w∕v)混合,700 nm下測(cè)定吸光值。樣品的還原能力以等價(jià)維生素C的質(zhì)量濃度表示。抗氧化能力根據(jù)公式:等價(jià)維生素C含量(μg)=測(cè)得樣品溶液維生素等價(jià)質(zhì)量濃度(μg∕mL)÷樣品溶液的質(zhì)量濃度(mg∕mL)×樣品的質(zhì)量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 甲醇濃度對(duì)得率及抗氧化能力的影響

如圖1所示,甲醇濃度對(duì)貓須草根提取物的得率和總抗氧化能力均有較大影響,得率隨甲醇濃度的升高而降低,而總抗氧化能力在甲醇濃度為0%—75%間先升高,后降低,變化不顯著。而100%甲醇提取物無(wú)論是得率還是總抗氧化能力均顯著低于其他,可以排除該工藝。因此,正交試驗(yàn)甲醇濃度定為0%、25%、50%和75%。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)得率及抗氧化能力的影響

如圖2所示,提取時(shí)間對(duì)貓須草根提取物的得率和總抗氧化能力均有一定影響,其中提取時(shí)間10—20 min間得率及總抗氧化能力差異相對(duì)較大,提取時(shí)間在30 min以上時(shí)差異很小,更長(zhǎng)的提取時(shí)間也意味著更多的能源消耗,因此正交試驗(yàn)將提取時(shí)間定為5 min、10 min、15 min、20 min。

圖1 甲醇濃度對(duì)抗氧化成分得率及總還原能力的影響Fig.1 Effects of methanol concentration on antioxidant component yield and total reducing power

圖2 提取時(shí)間對(duì)抗氧化成分得率及總還原能力的影響Fig.2 Effects of extracting time on antioxidant component yield and total reducing power

2.1.3 提取溫度對(duì)得率及抗氧化能力的影響

如圖3所示,提取溫度對(duì)貓須草根提取物的得率和總抗氧化能力均有一定影響,其中提取溫度為25℃時(shí),得率及總還原能力均遠(yuǎn)低于40℃提取時(shí)數(shù)值,而85℃提取時(shí)雖然總還原能力高于70℃時(shí),但甲醇揮發(fā)迅速,有一點(diǎn)安全隱患,且從得率上看,并無(wú)太大差別,因此正交試驗(yàn)將提取溫度定為40℃、50℃、60℃、70℃。有趣的是,一般認(rèn)為高溫會(huì)影響提取物的抗氧化活力,但本研究表明,70—85℃溫度提取,對(duì)貓須草根提取物的還原(抗氧化)能力并無(wú)顯著影響。

2.1.4 料液比對(duì)得率及抗氧化能力的影響

如圖4所示,提取料液比對(duì)貓須草根提取物的得率和總抗氧化能力均有較大影響,其中料液比為1∶20時(shí),得率及總還原能力均遠(yuǎn)低于1∶40提取時(shí)數(shù)值,而1∶100提取時(shí)雖然總還原能力及得率均略高于1∶80 時(shí),但高料液比會(huì)帶來(lái)提取成本的巨大提升,因此正交試驗(yàn)將料液比定為 1∶50、1∶60、1∶70、1∶80。

圖3 提取溫度對(duì)抗氧化成分得率及總還原能力的影響Fig.3 Effects of extracting temperature on antioxidant component yield and total reducing power

圖4 料液比對(duì)抗氧化成分得率及總還原能力的影響Fig.4 Effects of material-liquid ratio on antioxidant component yield and total reducing power

2.2 正交試驗(yàn)

由2.1各因素對(duì)提取率及產(chǎn)物還原能力的影響,確定選取4因素進(jìn)行正交分析,每個(gè)因素選取4水平,利用L16(45)進(jìn)行正交試驗(yàn),空出第5列做空白誤差分析。正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal experiment

由表1可以看出,對(duì)得率的影響,甲醇含量＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度,最佳提取工藝為4號(hào)方案,即:0%甲醇,在70℃溫度下,以1∶80料液比提取20 min。由方差分析(表2)可以得知,甲醇含量和料液比對(duì)得率有顯著影響,而提取溫度與提取時(shí)間對(duì)得率無(wú)顯著影響。對(duì)提取物總還原能力的影響,同樣是甲醇含量＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度,最佳提取工藝為8號(hào)方案,即:25%甲醇,在70℃溫度下,以1∶70料液比提取10 min,方差分析結(jié)果未提示有顯著影響因素。

表2 各因素對(duì)提取物得率及總還原能力影響的方差分析Table 2 Variance analysis of effects of factors on extractive yield and total reducing power

本研究比較了不同提取方案對(duì)100 μg∕mL的提取物還原能力的影響,結(jié)果表明提取物的還原能力隨甲醇濃度的升高而升高。經(jīng)方差分析表明,甲醇濃度對(duì)正交試驗(yàn)中提取物的還原能力有顯著影響;對(duì)甲醇濃度與提取物還原能力進(jìn)行皮爾森相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),甲醇濃度與提取物還原能力顯著正相關(guān)(皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.863,P＜0.01);而由圖1可知,隨著甲醇濃度升高,得率呈下降趨勢(shì);對(duì)甲醇濃度與提取得率進(jìn)行皮爾森相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),甲醇濃度與提取得率顯著負(fù)相關(guān)(皮爾森相關(guān)系數(shù)為-0.633,P＜0.01);通過(guò)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得知,得率與還原能力顯著負(fù)相關(guān)(皮爾森相關(guān)系數(shù)為-0.704,P＜0.01)。在討論提取方案對(duì)提取物抗氧化能力影響時(shí),綜合考慮了提取物的得率和抗氧化能力,得到了抗氧化能力最大的提取方案。

制備貓須草根提取物的主要目的是為了得到其具有抗氧化活性的有效成分,因此總還原能力較得率更有價(jià)值。本研究認(rèn)為宜選取得到總還原能力最大的提取方案為最優(yōu)方案。

為驗(yàn)證此結(jié)果的準(zhǔn)確性,在最佳條件下進(jìn)行了3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得率為(13.15±0.13)%,等價(jià)維生素C還原能力為(11.44 ±0.15)mg∕g。

研究表明,貓須草根抗氧化成分提取工藝簡(jiǎn)便,成本可控,提取物抗氧化效果良好,是一種潛在的天然飼料添加劑。

3 結(jié)論

(1)貓須草根提取的最佳工藝為采用25%甲醇,在70℃溫度下,以1∶70料液比以300 W超聲波提取10 min。在此工藝下得率為13.15%,也具有最高抗氧化能力。

(2)甲醇濃度是影響貓須草根提取物得率和提取物抗氧化能力的最主要因素,得率隨甲醇濃度升高而降低,在0%—50%范圍內(nèi),提取物抗氧化能力隨甲醇濃度提高而降低。

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