曹 蕊，嚴(yán) 笠，張 辰，孫雪健，趙振民

人小涎腺間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成脂比較

曹 蕊，嚴(yán) 笠，張 辰，孫雪健，趙振民

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心 北京 100144）

目的：通過對(duì)人小涎腺干細(xì)胞（human Minor Salivary Gland Mesenchymal Stem Cells, hMSGMSCs)與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,hBMSCs)的增殖、活力、凋亡以及成脂分化能力等生物學(xué)特性的比較，證實(shí)小涎腺干細(xì)胞具有高度自我更新能力并具有向脂肪細(xì)胞分化的潛能，為其成為新型的理想種子細(xì)胞提供理論基礎(chǔ)。方法：提取臨床患者的hMSGMSCs和hBMSCs各3例，利用MTS細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)兩種細(xì)胞的490nm吸光度值（optical density，OD490nm）的變化并繪制增殖曲線，比較兩種細(xì)胞的增殖能力；利用MUSE細(xì)胞分析儀檢測(cè)兩種細(xì)胞的活力和凋亡，并加以比較；對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，2周后油紅O染色，鏡下觀察及用異丙醇溶解成脂細(xì)胞吸附的油紅O染料，檢測(cè)OD490nm，比較脂滴形成情況。結(jié)果：hMSGMSCs 比hBMSCs具有更強(qiáng)的增殖能力（P＜0.05），將其傳至30代仍很好地保持細(xì)胞的活性；兩種干細(xì)胞活力及凋亡情況檢測(cè)無明顯差異(P＞0.05)；兩種細(xì)胞成脂誘導(dǎo)2周后OD490nm無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論：hMSGMSCs 將有望成為理想的種子細(xì)胞，應(yīng)用于細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)研究。

小涎腺干細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖曲線；凋亡；成脂誘導(dǎo)

人成體干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，在合適的條件下或給予合適的信號(hào)，可以分化成多種功能細(xì)胞或組織器官用于治療多種傳統(tǒng)方法難以治愈的疾病。人骨髓中存在一定量的hBMSCs，能夠在一定條件下分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)其為理想的種子細(xì)胞來源[1-3]。但因取材較為困難，創(chuàng)傷大，獲得的細(xì)胞數(shù)量有限，因此研究者陸續(xù)從其它組織中尋找間充質(zhì)干細(xì)胞。近年來，已有研究證實(shí)大唾液腺組織中含有間充質(zhì)干細(xì)胞,可作為種子細(xì)胞，應(yīng)用于細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)研究[4-8]。本課題組已成功從小涎腺中提取成纖維樣細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)和免疫相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)，證實(shí)hMSGMSCs強(qiáng)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物[9-10]。本次研究主要是對(duì)小涎腺干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞的一些生物學(xué)特性做比較，進(jìn)一步證實(shí)hMSGMSCs具有很強(qiáng)的自我復(fù)制能力并具有良好的成脂分化潛能，可為今后的細(xì)胞治療提供理想的種子細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 材料：hMSGMSCs來源于3例中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院唇部手術(shù)需要切除的小涎腺組織，3例hBMSCs同樣來源于本院的髂骨松質(zhì)骨切取時(shí)髂骨傷口內(nèi)流出的骨髓血組織，患者平均年齡10歲，無腺體相關(guān)疾病和自身免疫性疾病病史。本研究所使用樣本均獲患者知情同意，經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器：DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco)、胎牛血清（Gibco)、青鏈霉素（Hyclone)、胰蛋白酶（Hyclone)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）（Sigma）、胰島素（Sigma)、吲哚美辛（Sigma)、地塞米松（Sigma)、主要儀器：二氧化碳孵箱(美國Thermo)、倒置顯微鏡(Nikon TE2000-S)、酶標(biāo)儀（Enspire）、生物電脈沖分析儀（Muse Cell Analyer）、流式細(xì)胞儀(BD FACSAriaTMⅡ Cell Sorter)。

1.3 培養(yǎng)基配方：①普通完全培養(yǎng)基：DMEM 高糖、10%胎牛血清、1%青鏈霉素；②成脂誘導(dǎo)液(100ml)；DMEM高糖、10%胎牛血清、1%青鏈霉素、IBMX0.5mmol/L、胰島素10μmol/L、吲哚美辛200μmol/L、地塞米松10nmol/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 hBMSCs體外分離培養(yǎng)：臨床上手術(shù)中收集從髂骨傷口內(nèi)流出的5ml骨髓血采用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將5ml骨髓血沿管壁緩慢加入到已有等體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，離心15min，1500rpm，小心吸取上中層交界處的白色絮狀層，即單核細(xì)胞層，放入另一個(gè)離心管中，用等體積無血清培養(yǎng)基洗滌2次（每次離心5min，1500rpm），輕輕吸除上清液，加入10%FBS DMEM約5ml，制成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)，3d后換液。細(xì)胞匯合至80%后1:2或1:3傳代。

1.4.2 hMSGMSCs的體外分離培養(yǎng)：將采集到的小涎腺組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用冷的PBS洗兩遍，盡量去除分泌液。用眼科剪和眼科鑷去除多余的結(jié)締組織，分離出完整的小涎腺。吸去培養(yǎng)皿中的全部液體，用眼科剪將其剪成大約0.5mm3的小塊，操作過程中避免組織過度干燥。用眼科鑷將剪碎的組織塊均勻鋪在T25培養(yǎng)瓶的底部，每個(gè)組織塊間距5mm，小心放入完全培養(yǎng)基后豎立放于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中，6h后組織塊貼附于瓶底時(shí)慢慢放倒培養(yǎng)瓶，使組織塊完全浸在完全培養(yǎng)基中。接種4d后換液，棄去未貼壁的組織塊。之后每3d換液一次。細(xì)胞匯合至80%后1:2或1:3傳代。

1.4.3 對(duì)hMSGMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：將第5代hMSGMSCs細(xì)胞消化至單細(xì)胞懸液，1 000rpm離心5min，棄上清，加PBS重懸，再重復(fù)本步驟一次。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用Staining Buffer重懸細(xì)胞至106/100μl，分裝至1.5ml離心管中，100μl/管。根據(jù)抗體說明書加入抗體，避光冰上孵育30min。每管添加1ml Staining Buffer吹打細(xì)胞，離心300g，5min，棄上清，重復(fù)本步驟，棄上清后每管細(xì)胞重懸于300μl Staining Buffer，2h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.4.4 hBMSCs和hMSGMSCs的生長(zhǎng)曲線的比較：將第5代的兩種細(xì)胞消化后分別計(jì)數(shù)，接種于96孔板中，每孔加入200μl細(xì)胞懸液，約2 000個(gè)/孔，共計(jì)每種細(xì)胞接種21孔。細(xì)胞接種第2天開始，每天選擇3孔吸除上清液后，加入無血清培養(yǎng)基100μl，再采用細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒（CellTiter 96? Aqueous One Solution Assay），加入甲臢化合物3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），內(nèi)鹽（MTS）溶液20μl，搖勻后37℃孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定每孔在490nm波長(zhǎng)的光密度值（OD值）。連續(xù)檢測(cè)7d，繪制生長(zhǎng)曲線，未檢測(cè)的細(xì)胞3d換液一次。

1.4.5 hMSGMSCs和 hBMSCs細(xì)胞活力以及細(xì)胞凋亡情況的比較：取第5代同等數(shù)量的兩種細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化,完全培養(yǎng)基終止后將細(xì)胞懸液離心,用1%FBS的PBS洗一次后，加1%FBS PBS 1ml重懸細(xì)胞，分別取兩種細(xì)胞的細(xì)胞懸液20μl加入380μl MuseTMCount ＆ Viability Cell Reagent MCH100102,輕輕吹打混勻后常溫避光孵育5min，利用Muse細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。分別取兩種細(xì)胞懸液100μl加入100μl MuseTMAnnexin V ＆Dead Cell Reagent MCH100105,輕輕吹打混勻后常溫避光孵育20min，利用Muse細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.4.6 hBMSCs和hMSGMSCs成脂誘導(dǎo)和檢測(cè)：將第5代的hMSGMSCs和hBMSCs分別以5×104/孔各接種一個(gè)六孔板的四孔，孵育24h后將四孔分為兩組，一組兩孔是對(duì)照組，加入普通完全培養(yǎng)基，另一組兩孔加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)14d后固定，進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞成脂分化情況。以60%的異丙醇溶解染色后的成脂細(xì)胞[11]，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm時(shí)的吸光度值，吸光度值與成脂細(xì)胞的多少成正比，從而對(duì)兩種細(xì)胞成脂分化能力進(jìn)行比較。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independ-Samples t test)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs原代及傳代細(xì)胞鏡下觀察結(jié)果：原代培養(yǎng)24h后細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞逐漸由圓形轉(zhuǎn)化成為長(zhǎng)梭形，并呈集落樣分布，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的形態(tài)方向趨于一致，漩渦樣生長(zhǎng)，每3d換液一次，細(xì)胞匯合至90%時(shí)進(jìn)行1:3傳代。細(xì)胞傳至10代后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，細(xì)胞狀態(tài)變差,傳代的間隔延長(zhǎng)許多。見圖1A、圖1B。

2.2 hMSGMSCs原代及傳代細(xì)胞鏡下觀察結(jié)果：體外分離得到的1～2個(gè)小涎腺，接種于一個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶，接種5～6d開始有細(xì)胞爬出，有的呈上皮樣從組織周圍爬出，也有的為成纖維樣細(xì)胞散在生長(zhǎng)。每3d換液一次,原代培養(yǎng)10d左右傳第一代,用0.25%胰酶37℃消化1min,成纖維樣細(xì)胞基本全部消下來,轉(zhuǎn)移至另一個(gè)培養(yǎng)瓶中,從而達(dá)到兩種形態(tài)的細(xì)胞分離,傳2～3代后可得到純化的細(xì)胞,本研究對(duì)象是成纖維樣細(xì)胞。成纖維樣細(xì)胞平均每3d傳代一次，傳至30代細(xì)胞狀態(tài)良好。見圖1C、圖1D。

圖1 hBMSCs和hMSGMSCs原代及傳代細(xì)胞鏡下觀察結(jié)果

2.3 hMSGMSCs細(xì)胞表型流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果：對(duì)培養(yǎng)至第5代的hMSGMSCs細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hMSGMSCs高表達(dá)的表面標(biāo)志物大多與間充質(zhì)干細(xì)胞一致，包括：CD29、CD73、CD90、CD105和CD166，但有一個(gè)例外CD44，該標(biāo)志物被認(rèn)為在上皮細(xì)胞中表達(dá)。上皮細(xì)胞標(biāo)志物CD49f及造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45為陰性。見表1。

表1 hMSGMSCs流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果：采用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168h的吸光度值（OD490nm）,結(jié)果如圖2所示，在培養(yǎng)72、120、144、168h后，小涎腺間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P72=0.0329，P120=0.0498, P144=0.0154, P168=0.0145）。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：采用Annexin V ＆ Dead Cell Reagent檢測(cè),結(jié)果證實(shí)hMSGMSCs的凋亡細(xì)胞百分比為（23.35±3.633）%，hBMSCs的凋亡細(xì)胞百分比為（17.88±2.105）%，二者無顯著性差異(P=0.868)。見圖3。

圖3 hBMSCs和hMSGMSCs細(xì)胞凋亡檢測(cè)比較

2.6 細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果：采用Count ＆ Viability Cell Reagent檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)hMSGMSCs的活性細(xì)胞百分比為（78.45±6.809）%，hBMSCs的活性細(xì)胞百分比為（71.72±9.986）%，二者無顯著性差異(P=0.389)。見圖4。

圖4 hBMSCs和 hMSGMSCs 細(xì)胞活力檢測(cè)比較

2.7 細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)結(jié)果：以成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)14d后，采用油紅O染色并采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm時(shí)的吸光度值，結(jié)果證實(shí)hMSGMSCs在誘導(dǎo)后OD490nm為0.3679±0.2006, hBMSCs在誘導(dǎo)后OD490nm為0.2526±0.1402,二者無顯著性差異(P=0.4604)。見圖5、圖6。

圖5 hBMSCs 和hMSGMSCs成脂誘導(dǎo)14d后油紅O染色脂滴形成情況比較(×200)

圖6 hBMSCs和hMSGMSCs成脂誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)比較

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道人的腮腺存在間充質(zhì)干細(xì)胞,小涎腺與其組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分類似，可能同樣含有此種干細(xì)胞，而且小涎腺位于口腔粘膜下，取材方便，來源豐富，切取后不影響供區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能[9，12]。目前對(duì)于人小涎腺組織中的成體干細(xì)胞的研究很少，無詳細(xì)報(bào)道。本研究已成功利用組織貼壁法從小涎腺中提取小涎腺間充質(zhì)干細(xì)胞，在原代培養(yǎng)初期從組織周圍長(zhǎng)出一些混雜的細(xì)胞，一種是緊密排列在組織周圍的鋪路石樣的上皮細(xì)胞，另一種是散在生長(zhǎng)的成纖維樣細(xì)胞，通過胰酶消化時(shí)間差異將兩種細(xì)胞分離，在富含血清的完全培養(yǎng)基中，上皮細(xì)胞不能生長(zhǎng)，故細(xì)胞傳至3代后就得到純化的間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞在體外擴(kuò)增傳至30代時(shí)，通過對(duì)30代細(xì)胞活力的檢測(cè)證實(shí)它很好地保持了干細(xì)胞的一些增殖活性，由此可以經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增得到足量的種子細(xì)胞。

本研究中通過hMSGMSCs細(xì)胞表型流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果可知，hMSGMSCs可強(qiáng)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞通常表達(dá)的標(biāo)記物，包括CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166[13]，與BMSC一致；細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示小涎腺來源的間充質(zhì)干細(xì)胞比骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力；細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)結(jié)果表明二者成脂誘導(dǎo)分化能力無差異。且單個(gè)小涎腺原代培養(yǎng)的效率與5ml骨髓原代培養(yǎng)的效率相似[14]，因此獲得同樣多的原代細(xì)胞需要的小涎腺組織量較少。相關(guān)研究表明，hMSGMSC還具有SOX2和巢蛋白陽性表達(dá)，SOX2可以調(diào)控成體干細(xì)胞的多能性，并且在多種上皮組織中可維持組織穩(wěn)態(tài)[15-16]。提示hMSGMSCs具有未成熟干細(xì)胞的特質(zhì)，具有分化潛能。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)巢蛋白陽性的細(xì)胞在組織受損后可以很快做出反應(yīng)，進(jìn)入增殖狀態(tài)修復(fù)組織的損傷?？梢姵驳鞍椎谋磉_(dá)提示hMSGMSCs具有組織儲(chǔ)備干細(xì)胞的特征[17]。

綜上，hMSGMSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增方面優(yōu)于hBMSCs,能夠通過較少的小涎腺組織量培養(yǎng)獲得充足的間充質(zhì)干細(xì)胞，并具有與hBMSCs相似的干細(xì)胞特性，因此hMSGMSCs將有望成為理想的種子細(xì)胞，應(yīng)用于細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)研究中。

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Comparative Study on Proliferative and Adipogenic Ability of Human Minor Salivary Gland Mesenchymal Stem Cells and Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

CAO Rui,YAN Li,ZHANG Chen,SUN Xue-jian,ZHAO Zhen-min
(Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100144,China)

Objective To identify the self-renewal and adipogenic differentiation potential and explore ideal seed cells for cell therapy and bioengineered organ, we compared the biological characters including cell proliferation,vitality, apoptosis and adipogenic differentiation ability between human minor salivary gland mesenchymal stem cells (hMSGMSCs) and human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs). Methods hMSGMSCs and hBMSCs derived from 3 patients were isolated and cultured. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sul-fophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt (MTS) assay were used to detect proliferative ability of cells, and the growth curve was plotted according to the absorbance of 490 nm. Cell vitality and apoptosis were measured by MUSE cell analyzer. The adipogenic differentiation of cells was induced for two weeks, and the lipid droplets formation in cells were stained with the Oil Red O and were observed under the microscope, and the optical density at 490 nm (OD490nm) was detected after being dissolved in isopropanol. Results The proliferative ability of hMSGMSCs was higher than hBMSC, and hMSGMSCs could maintain stem cell vitality until the passage 30 (P<0.05). No statistically signif i cant differences of the cell vitality, apoptosis and adipogenic differentiation ability between hMSGMSCs and hBMSCs were found (P>0.05). Conclusion hMSGMSCs has the potential to become one kind of desirable seed cell for basic research and cell therapy in regenerative medicine.

hMSGMSCs;hBMSCs;the cells growth curve;apoptosis;adipogenic differentiation.

Q813.1

A

1008-6455（2017）05-0031-04

2017-01-21

2017-03-28

編輯/張惠娟

趙振民，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，教授，研究方向：整形外科和再生醫(yī)學(xué)；E-mail:zhaozhenmin0098@vip.sina.com

曹蕊，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，主管技師；研究方向：細(xì)胞生物學(xué)；E-mail:caorui660428@sina.com