郝帥林，張媛，魏艷杰，李朝陽，肖童，蘇琦，苗雨欣，徐菁蔓，郝志梅，田煒

[1.華北理工大學 醫(yī)學實驗研究中心（國家科技部老年醫(yī)學國際科技合作基地），河北 唐山 063000；2.華北理工大學 管理學院，河北 唐山 063000]

基礎研究·論著

天麻素抗心肌氧化應激損傷的作用機制研究*

郝帥林1，張媛1，魏艷杰1，李朝陽1，肖童1，蘇琦1，苗雨欣1，徐菁蔓1，郝志梅2，田煒1

[1.華北理工大學 醫(yī)學實驗研究中心（國家科技部老年醫(yī)學國際科技合作基地），河北 唐山 063000；2.華北理工大學 管理學院，河北 唐山 063000]

目的探討天麻素在大鼠心肌細胞氧化應激損傷時是否通過線粒體機制發(fā)揮心臟保護作用。方法首先使用過氧化氫H2O2650 μmol/L處理大鼠心臟組織來源的H9c2心肌細胞，復制氧化應激損傷模型。分別使用50.0、10.0、1.0和0.1 μmol/L天麻素預處理，利用共聚焦顯微鏡成像技術(shù)，檢測線粒體膜電位的變化，四甲基偶氮唑鹽比色法檢測天麻素對細胞存活率的影響，Western blot檢測天麻素對糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、蛋白激酶-B（Akt）活性的影響。結(jié)果不同濃度的天麻素預處理均能減弱H2O2引起的四甲基羅丹明乙酯熒光強度降低程度，且與模型組（0.30±0.25）比較，10.0 μmol/L天麻素預處理組（0.79±0.08）作用最為明顯。天麻素（10.0μmol/L）預處理能提高H9c2細胞的存活率，使p-GSK-3β（Ser9）、p-Akt（Ser473）蛋白水平升高，而磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抑制劑渥曼青霉素可以阻斷其發(fā)揮作用。結(jié)論天麻素能夠減輕由H2O2引發(fā)的H9c2心肌細胞氧化應激損傷，其可能是通過PI3K/Akt途徑使GSK-3β失活，抑制mPTP開放以發(fā)揮心臟保護作用。

天麻素；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔；氧化應激損傷；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶-B

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是指在短時間心肌血供中斷后，一定時間內(nèi)恢復血供，原缺血心肌發(fā)生較血供恢復前更嚴重的損傷。目前普遍認為，在再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展過程中，氧化應激是很重要的機制之一[1]。磷脂酰肌醇 -3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號途徑是氧化應激過程中很重要的一條通路[2]。

天麻素是從蘭科植物天麻的干燥莖塊中提煉出含量最高的單體成份，具有抑制心肌細胞凋亡，增加心肌血供，調(diào)節(jié)血管舒縮功能的作用[3]。大量動物實驗表明，天麻素在MIRI中能減少炎癥因子、提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量、減輕Ca2+超載，說明天麻素在MIRI病理過程中具有一定的保護作用[4]，但是其具體保護機制尚不明確。因此，本研究采用過氧化氫H2O2650 μmol/L處理來源于大鼠胚胎心臟的H9c2心肌細胞，復制氧化應激損傷模型，探討天麻素是否具有抗心肌缺血再灌注損傷作用，以及該保護作用是否是通過PI3K/Akt通路及線粒體保護機制實現(xiàn)的，以期為天麻素的臨床應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

大鼠胚胎心臟組織來源的H9c2細胞株購自美國ATCC公司。

1.2 試劑與儀器

實驗藥物天麻素由北京百威靈科技有限公司提供（純度>99%），H2O2（批號STBB6350）購自美國Sigma公司，熒光染料四甲基羅丹明乙酯（Tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE）購自美國Invitrogen公司，渥曼青霉素（Wortmannin，Wort）購自北京索萊寶公司，兔源單克隆抗體p-Akt（Ser473）、p-GSK-3β（Ser9）及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司，鼠源微管蛋白（Tubulin）多克隆抗體購自北京中杉金橋生物有限公司，改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、四甲基偶氮唑鹽比色法[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]細胞增殖及毒性檢測試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、電化學發(fā)光免疫分析（electrogenerated chemiluminescence，ECL）發(fā)光檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，37℃二氧化碳CO2培養(yǎng)箱購自美國 Thermo Forma公司，F(xiàn)V 1000激光掃描共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司，生物安全柜購自新加坡ESCO公司，5804R高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，JY200C電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司，酶標儀和半干轉(zhuǎn)運系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗細胞2遍，用5 ml含10%胎牛血清、雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基重懸H9c2細胞并轉(zhuǎn)入50 ml培養(yǎng)瓶中，放置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24～48 h待細胞貼壁達培養(yǎng)瓶底壁面積>90%時，選生長狀態(tài)良好的H9c2細胞用0.25%胰蛋白酶200 μl消化2 min，用10 ml培養(yǎng)基終止消化，反復輕輕吹打制成細胞懸液，傳代2、3次/周。

1.3.2 實驗分組及處理方法 實驗共分為兩部分。第一部分為天麻素抗心肌氧化應激損傷作用研究，分為：①對照組：正常心肌細胞不給予任何處理；②H2O2組：只加H2O2650 μmol/L處理20 min；③天麻素 +H2O2組：加入天麻素（50.0、10.0、1.0和0.1μmol/L）預處理20 min，加入H2O2650 μmol/L處理20 min。后面的研究中，天麻素+H2O2組均加入天麻素10 μmol/L預處理20 min后再加入H2O2650 μmol/L處理20 min；④天麻素組：只加天麻素10μmol/L處理20min。第二部分為天麻素抗心肌氧化應激損傷的機制研究，分為：①H2O2組：只加H2O2650μmol/L處理20min；②天麻素+H2O2組：加入天麻素 10 μmol/L預處理20 min，加入H2O2650 μmol/L處理20 min；③PI3K抑制劑（Wort）+天麻素+H2O2組：加入PI3K抑制劑100 nmol/L處理10 min，天麻素10 μmol/L處理20 min，H2O2650μmol/L處理20 min；④抑制劑（Wort）組：只加抑制劑 100 nmol/L處理10 min。

1.3.3 檢測線粒體膜電位 將生長密度達80%～90%、狀態(tài)良好的細胞置于超凈工作臺內(nèi)，重復上述細胞培養(yǎng)步驟，胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基懸浮后移到50ml離心管，在低速離心機上1000r/min離心5 min，棄上清液后用新的完全培養(yǎng)基重懸，混合均勻后傳入共聚焦專用小皿，每個小皿2ml，培養(yǎng)24h，實驗前棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，然后用臺式液2 ml（氯化鈉140.0 mmol/L，氯化鉀6.0 mmol/L，氯化鎂1.0mmol/L，氯化鈣1.0mmol/L，乙烷磺酸5.0mmol/L，葡萄糖5.8mmol/L，pH=7.4）于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。加入特異性熒光標記物TMRE 100 nmol/L，2μl孵育20 min，上鏡觀察，使用Delta T open Dish Systems特殊恒溫裝置使溫度維持在37℃。激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為543和560 nm。鏡下觀察不同時間紅色熒光的變化，采集H2O2處理前及處理20 min后圖像，并使用Image J軟件對其熒光強度進行統(tǒng)計學分析。

1.3.4 MTT法檢測細胞的存活率 選取對數(shù)生長期且細胞狀態(tài)良好的細胞重復細胞培養(yǎng)步驟，待其消化、離心重新懸浮后進行細胞計數(shù)，稀釋為1× 104個/ml，96孔板加入100 μl/孔，約1000個細胞，培養(yǎng)24～48 h，待其長到75%左右后按照各組要求處理，處理后把液體全部吸出，PBS沖洗，重新加入完全培養(yǎng)基100 μl，MTT溶液10 μl，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μl，15 min后顯微鏡下觀察到藍色結(jié)晶物完全溶解，用酶標儀在570 nm處測定每孔光密度值。計算細胞的存活率，細胞存活率（%）=實驗組光密度（optical delnsity，OD）值/對照組OD值×100%。

1.3.5 Western blot檢測p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）蛋白表達 細胞培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，臺式液孵育2 h，根據(jù)分組分別進行處理，PBS沖洗3次，加入40 μl裂解液冰上裂解30 min，收集細胞于Eppendorf管中，超聲破碎15 s，4℃、12 000 r/min離心15 min后取上清液，使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進行蛋白定量。以50 μg/孔上樣，進行電泳并轉(zhuǎn)膜，使用10%脫脂奶粉室溫搖床慢搖封閉2 h，孵育p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）相對應的一抗（1∶1 000稀釋），4℃搖床慢搖過夜（8～12 h），Tris-HCl緩沖鹽溶液洗3次，10 min/次，加相應二抗（1∶1 000稀釋）室溫搖床慢搖2 h，Tris-HCl緩沖鹽溶液洗3次，10 min/次，增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）熒光顯色，用Image J進行灰度掃描及定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用完全隨機設計的單因素方差（One-way，ANOVA）分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻素對心肌細胞氧化應激損傷的影響

2.1.1 天麻素對心肌細胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）開放的影響 激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，與對照組（0.92±0.07）比較，H2O2組處理后TMRE熒光強度（0.30±0.08）降低，提示650μmol/L H2O2可以使mPTP開放，引起線粒體損傷。而不同濃度（0.1、1.0、10.0和50.0μmol/L）天麻素預處理后的熒光強度值[分別為（0.40±0.13）、（0.66±0.15）、（0.79±0.08）和（0.51±0.07）]與H2O2組比較，可以不同程度地減弱H2O2引起的TMRE熒光強度降低程度，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=26.062，P=0.000），說明天麻素能夠減輕由650μmol/L H2O2引起的線粒體損傷，且天麻素濃度為10.0μmol/L時，該保護作用最為顯著。見附表和圖1。

2.1.2 天麻素對心肌細胞存活率的影響 MTT法測定心肌細胞的存活率結(jié)果顯示，各組的OD值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=45.844，P= 0.000）。H2O2組（0.56±0.05）與對照組（0.75±0.06）比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.246，P=0.000），H2O2組心肌細胞的存活率下降。天麻素（10.0μmol/L）+ H2O2組（0.64±0.03）與H2O2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.629，P=0.000），天麻素（10.0μmol/L）+ H2O2組心肌細胞的存活率較高。天麻素組（0.76± 0.06）與H2O2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.659，P=0.000），天麻素組心肌細胞的存活率較高。表明天麻素具有抗心肌細胞氧化應激損傷保護作用。

附表 各組TMRE熒光強度比較 （±s）

附表 各組TMRE熒光強度比較 （±s）

注：t1、P1：與對照組比較；t2、P2：與H2O2組比較

組別 熒光強度比值t1值P1值t2值P2值對照組（n=9） 0.92±0.07 - - - -H2O2組（n=8） 0.30±0.08 11.635 0.000 - -天麻素（0.1μmol/L）+H2O2組（n=10） 0.40±0.13 2.339 0.021 3.316 0.000天麻素（1.0μmol/L）+H2O2組（n=10） 0.66±0.15 2.063 0.042 6.326 0.000天麻素（10.0μmol/L）+H2O2組（n=9） 0.79±0.08 2.936 0.004 12.276 0.000天麻素（50.0μmol/L）+H2O2組（n=8） 0.51±0.07 2.346 0.020 5.369 0.000

圖1 不同濃度天麻素對TMRE熒光強度的影響 （×40）

2.1.3 天麻素對p-Akt（Ser473）蛋白表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，p-Akt（Ser473）蛋白在對照組、H2O2組、天麻素+H2O2組表達為（100.0±14.1）、（45.0±10.2）和（69.0±8.2）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.630，P=0.022）。與對照組比較，H2O2組的 p-Akt（Ser473）表達下降（P<0.05），而天麻素（10.0μmol/L）預處理能夠減輕H2O2降低Akt活性的作用（P<0.05）。提示Akt可能參與天麻素抗心肌細胞氧化應激損傷保護作用。見圖2。

2.1.4 天麻素對p-GSK-3β（Ser9）蛋白表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，p-GSK-3β（Ser9）蛋白在對照組、H2O2組、天麻素+H2O2組表達為（105.0± 12.4）、（47.0±8.1）和（73.0±11.2）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.326，P=0.000）。與對照組比較，H2O2組的p-GSK-3β（Ser9）表達降低（P<0.05）。相對于H2O2組，天麻素（10μmol/L）+H2O2組p-GSK-3β（Ser9）的表達增加（P<0.05）。提示天麻素可能通過提高GSK-3β的磷酸化水平來對抗由H2O2引起的心肌細胞線粒體損傷。見圖3。

2.2 天麻素對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的影響

圖2 檢測p-Akt（Ser473）的表達 （±s）

2.2.1 PI3K抑制劑對天麻素線粒體保護作用的影響 激光共聚焦結(jié)果顯示，各組TMRE熒光強度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=18.162，P= 0.000）。天麻素（10.0μmol/L）+H2O2組（0.79±0.08）與H2O2組（0.30±0.08）比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.723，P=0.000），10.0μmol/L天麻素可以對抗H2O2引起的TMRE熒光強度降低，而發(fā)揮線粒體保護作用。PI3K抑制劑Wort+天麻素（10.0μmol/L）+H2O2組（0.33±0.20）與天麻素（10.0μmol/L）+H2O2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.325，P=0.000）。Wort組與天麻素（10.0μmol/L）+H2O2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.326，P=0.000），說明Wort可以阻斷天麻素的保護作用，提示天麻素是通過PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮抗心肌細胞氧化應激損傷線粒體保護作用的。見圖4。

2.2.2 Wort對p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，在H2O2組、天麻素 （10.0μmol/L）+H2O2組、Wort+天麻素（10.0μmol/L）+H2O2組、Wort組中，p-Akt（Ser473）蛋白表達分別為（55.0±9.1）、（101.0±10.1）、（46.0±3.2）和（56.00±7.2）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.316，P=0.000）。p-GSK-3β（Ser9）蛋白表達分別為（72.0±11.2）、（107.0±8.0）、（47.00±7.1）和（47.0± 10.1）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=12.337，P=0.011）。相對于H2O2組，天麻素（10μmol/L）+H2O2組的p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）蛋白表達增強（P<0.05）；而與天麻素（10μmol/L）+H2O2組比較，加入PI3K抑制劑Wort后，p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）蛋白表達均降低（P<0.05）。說明天麻素可能是通過PI3K/Akt通路調(diào)控GSK-3β活性，對H2O2引起的心肌細胞氧化應激損傷發(fā)揮保護作用。見圖5。

圖3 p-GSK-3β（Ser9）的表達 （±s）

圖4 Wort對天麻素保護TMRE熒光強度作用的影響 （×40）

圖5 Wort對天麻素升高p-Akt（Ser473）和p-GSK-3β（Ser9）的影響

3 討論

天麻素作為名貴藥材天麻的有效成分之一，具有抗炎、抗衰老、鎮(zhèn)靜等作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，天麻素在腦缺血再灌注損傷中能發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用[6]，并且在同樣具有復雜病理過程的心肌缺血再灌注損傷中也發(fā)揮著類似作用[7]。本研究中MTT結(jié)果顯示，天麻素能增加心肌H9c2細胞的存活率，發(fā)揮抗氧化應激損傷保護作用。

mPTP的本質(zhì)是心肌細胞線粒體膜上的一種跨膜多孔蛋白，在正常生理狀態(tài)下，mPTP呈關(guān)閉狀態(tài)。MIRI過程中，缺血、缺氧、氧化應激等機制可誘發(fā)mPTP開放，改變線粒體的通透性，導致細胞凋亡或者壞死，因此在MIRI過程中mPTP的開放成為誘導細胞死亡的重要機制[8]。實驗研究證明腺苷[9]、紅景天苷[10]等均通過阻止mPTP的開放抑制心肌細胞壞死而發(fā)揮心肌保護作用。本研究激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果也表明，天麻素能夠?qū)笻2O2引起的細胞線粒體膜電位降低，抑制氧化應激引起的mPTP開放，減輕心肌細胞線粒體的損傷，證明天麻素也通過線粒體機制發(fā)揮心肌保護作用。

GSK-3β是mPTP上游重要的調(diào)控因子，廣泛分布于所有的真核細胞中，主要調(diào)節(jié)心臟糖原合成酶，GSK-3β失活會喪失對下游因子的調(diào)控能力，在MIRI過程中扮演重要角色[11]。黃芪甲苷[12]、白藜蘆醇[13]等中藥材就是通過上調(diào)p-GSK-3β的表達，抑制mPTP的開放，發(fā)揮抗氧化應激心肌保護作用。本研究結(jié)果顯示，天麻素能夠?qū)笻2O2作用，使p-GSK-3β（Ser9）的表達增加，說明天麻素可能是通過上調(diào)GSK-3β（Ser9）的磷酸化水平，從而抑制mPTP開放，發(fā)揮心肌保護作用。

PI3K屬于信號轉(zhuǎn)導蛋白質(zhì)酶類的一個保守家族，主要調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、生存，是下游信號分子Akt的首要調(diào)節(jié)點[14]。Akt作為信號通路的調(diào)節(jié)器，其活化后可以促進下游因子GSK-3β的磷酸化，同時PI3K/Akt作為體內(nèi)重要的通路，在細胞活化、炎癥反應、趨化性及凋亡等多種生物反應中扮演著重要角色[15-17]，在MIRI過程中有阻止mPTP開放、減少細胞凋亡的作用[18-19]。本研究結(jié)果也顯示，天麻素可以對抗H2O2作用，使p-Akt（Ser473）的表達增加，當加入PI3K抑制劑Wort后，不但天麻素使p-Akt（Ser473）表達增加的作用消失，而且天麻素使p-GSK-3β（Ser9）表達增加，以及抑制mPTP開放的作用均被阻斷，說明PI3K/Akt通路不但參與天麻素增加p-GSK-3β（Ser9）表達，抑制mPTP開放的抗氧化應激心肌保護作用，而且還是該作用的重要調(diào)控因素。

綜上所述，天麻素預處理可以通過減輕H2O2引起的H9c2心肌細胞線粒體損傷，發(fā)揮抗氧化應激損傷保護作用，該作用可能是通過PI3K/Akt途徑使GSK-3β失活，進而抑制mPTP開放來實現(xiàn)的。

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（童穎丹 編輯）

Protective effect of gastrodin against myocardial oxidative stress damage*

Shuai-lin Hao1,Yuan Zhang1,Yan-jie Wei1,Zhao-yang Li1,Tong Xiao1, Qi Su1,Yu-xin Miao1,Jing-man Xu1,Zhi-mei Hao2,Wei Tian1
[1.Medical Experimental Research Center(International Science and Technology Cooperation Base of Geriatric Medicine),North China University of Science and Technology,Tangshan, Hebei 063000,China;2.College of Management,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China]

ObjectiveTo investigate whether gastrodin plays a protective role in rat myocardial cell oxidative stress by mitochondrial pathway.MethodsH2O2(650 μmol/L)was used to induce oxidative stress injury of H9c2 cells,and the pretreatment concentration of gastrodin was 50.0,10.0,1.0 and 0.1 μmol/L respectively. Laser scanning confocal microscopy(LSCM)was used to detect mitochondrial membrane potential.MTT method was used to test the effect of gastrodin on cell survival rate.Western blot was used to observe the influences of gastrodin on the activity of glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β)and protein kinase B (Akt).ResultsPretreatment of gastrodin with different concentrations could prevent the reduction of fluorescence intensity of tetramethylrhodamine ethyl ester caused by H2O2,and the 10.0 μmol/L gastrodin pretreatment group had the most obvious effect compared with the model group[(0.79±0.08)vs(0.30±0.25)].Pretreatment with gastrodin(10.0 μmol/L)improved the survival rate of H9c2 cells(P<0.05)and increased protein expressions of p-GSK-3β (Ser9)and p-Akt (Ser473);whereas PI3K inhibitor,Wortmannin penicillin (Wort),could block this effect.ConclusionsGastrodin can alleviate oxidative stress damage of H9c2 myocardial cells caused by H2O2.It may inactivate GSK-3β through PI3K/Akt pathway,thereby play a cardiac-protective role through inhibition of mPTP opening.

gastrodin;mitochondrial permeability transition pore;oxidative stress injury;phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B(Akt)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.001

1005-8982（2017）09-0001-07

2016-07-05

河北省自然科學基金（No：H2012401036）；河北省高等學?？茖W技術(shù)研究項目（No：QN20131072）；華北理工大學大學生創(chuàng)新項目（No：X2016214）

田煒，E-mail：twhzm@aliyun.com；Tel：13513451200