楊 超, 張國麗, 任毓忠, 鐘楊瓊, 高祥雷,李 卓, 張亞平*, 李國英*

(1. 石河子大學生命科學學院, 石河子 832000; 2. 新疆農(nóng)墾科學院生物技術研究所,石河子 832000; 3. 石河子大學農(nóng)學院, 石河子 832000)

北疆沿天山北坡一帶葡萄穗軸褐枯病病原菌的鑒定

楊 超1, 張國麗2, 任毓忠3, 鐘楊瓊3, 高祥雷3,李 卓3, 張亞平1*, 李國英3*

(1. 石河子大學生命科學學院, 石河子 832000; 2. 新疆農(nóng)墾科學院生物技術研究所,石河子 832000; 3. 石河子大學農(nóng)學院, 石河子 832000)

2015年在新疆沿天山北坡一帶的‘夏黑’葡萄上,出現(xiàn)了一種果穗穗軸變褐、枯死、幼果萎縮的病害,部分果園發(fā)病率達到100%,減產(chǎn)30%～50%。為了查明其發(fā)病原因,采用常規(guī)組織分離法對發(fā)病的穗軸進行了病原分離和純化,共獲得104個鏈格孢屬真菌Alternariaspp.菌株,選取其中10個代表性菌株,通過常規(guī)形態(tài)學鑒定、致病性測定及核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS (ITS1/ITS4) 和組蛋白3基因序列分析,結(jié)果表明,引起該病害的病原有兩個,分別是Alternariatenuissima和A.alternata,與國內(nèi)大部分葡萄產(chǎn)區(qū)報道的A.viticola不同。

葡萄; 穗軸褐枯病; 病原鑒定; 鏈格孢菌

葡萄穗軸褐枯病(grapeAlternariarot)又稱軸枯病,主要危害幼嫩的穗軸,使穗軸變褐枯死,導致花穗干枯脫落;也可危害幼果,在表面形成褐色至深褐色小型斑點,但不深入果肉組織。據(jù)國內(nèi)外報道,該病主要由鏈格孢屬Alternaria的一些真菌侵染所致。國外報道,在葡萄上侵染危害的鏈格孢屬病原真菌有多種,主要包括A.alternata、A.tenuissima、A.vitis、A.viticola和A.viniferae[1-2],它們都是危害葡萄穗軸、果梗和葉片上的弱寄生菌。在國內(nèi),王克等[3]1986年首先在遼寧報道了由Alternaria屬真菌引起的葡萄穗軸褐枯病,其病原為A.viticola。之后趙令川等在湖南長沙(1987-1988年)[4]、牛慶法在山東沂水(1990年)[5]、馬俊義等在新疆哈密(2004年)[6]、何建群在云南賓川(2011年)[7]、張軍利等在遼南(2011年)[8]等地葡萄園都相繼發(fā)現(xiàn)該病,并將其病原鑒定為A.viticola。但是,也有人認為該病是由除A.viticola以外的其他鏈格孢菌引起。如1993年鹿世晉等[9]將青島地區(qū)‘巨峰’系葡萄上發(fā)現(xiàn)的穗軸腐爛病病原鑒定為A.tenuissima。2009年馬向云等[10]將湖南懷化市‘紫秋刺’葡萄穗軸褐枯病病原鑒定為A.alternata(Fr.)Keissler?！吨袊r(nóng)作物病蟲害》第2版中記錄的葡萄穗軸褐枯病的病原為A.alternata[11]。

2014年張秋娥等[12]對葡萄穗軸褐枯病的癥狀、病原、發(fā)生規(guī)律及防治等的研究進行了綜述。作者認為以往發(fā)表的關于該病病原鑒定的文獻大多基于形態(tài)學特征,并未結(jié)合分子生物學特性。鏈格孢屬的一些種,特別是小孢子組的一些種,由于分生孢子在結(jié)構(gòu)和形態(tài)上的高度變異,加之其形態(tài)又比較相似,單憑形態(tài)學不能將其鑒定到種;而序列分析組蛋白3基因非常適合劃定小孢子鏈格孢種,以此彌補形態(tài)學鑒定上的不足[13]。所以,必須結(jié)合分子生物學才能將鏈格孢屬確切鑒定到種。

新疆是我國最重要的葡萄產(chǎn)區(qū)之一,北疆沿天山北坡一帶又是新疆最重要的鮮食和釀酒葡萄的主要產(chǎn)區(qū)。但自2015年起,在新疆沿天山一帶的石河子和博樂地區(qū)的‘夏黑’葡萄園,開花和幼果期葡萄穗軸褐枯病毀滅性發(fā)生,有些葡萄園果穗的發(fā)病率高達100%,個別果園甚至絕產(chǎn);另外在‘弗蕾’葡萄品種上也發(fā)現(xiàn)有少量穗軸褐枯病癥狀,為此對該病的病原進行了研究。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

病樣分別采集于石河子地區(qū)的石河子大學葡萄試驗站、石河子總場、石河子地區(qū)143團,博樂地區(qū)81團、89團、86團和博樂市的達鎮(zhèn)達西村等北疆沿天山北坡一帶9個葡萄園,共采集具有典型穗軸褐枯病的病樣135個。

1.2 方法

1.2.1 病原分離與純化

將采集的具有典型癥狀的病害標本,按常規(guī)組織分離法在超凈工作臺上進行病原物的分離。分離前先將葡萄病樣穗軸用流水沖洗干凈,然后在葡萄穗軸的病健交界處切取0.7 cm左右的小段,放入0.1%的升汞中表面消毒20 s,無菌水沖洗3次,置于滅菌的無菌濾紙上吸去表面水分,接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上,28℃條件下培養(yǎng)3～4 d,在PDA平板上進行單孢分離純化[14],之后將純化后的菌株接于PDA斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)5 d后置4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的鑒定

1.2.2.1 病原的形態(tài)學鑒定

根據(jù)采集地點、葡萄品種、分離菌株的數(shù)量及顏色和形狀,選取10個具有代表性的菌株,分別編號為1(來自石河子大學葡萄試驗站)、2(來自石總場四分場)、3(來自石總場六分場)、4(來自143團)、5(來自石總場葡萄站)、6(來自89團)、7(來自81團)、8(來自86團)、9(來自86團園藝3連)、10(來自博樂市達鎮(zhèn)達西村)。其中除6號樣采自‘弗蕾’品種外,其他均采自‘夏黑’葡萄品種。在無菌條件下,分別將代表性菌株轉(zhuǎn)接到馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基(PCA)平板上,25℃恒溫培養(yǎng)5 d,觀察菌落的顏色并記錄各菌落的形態(tài)特征。在光學顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗的形態(tài)和顏色及分生孢子的形狀和縱橫隔膜數(shù),測量分生孢子和喙胞的大小各50個。采用常規(guī)的玻片培養(yǎng)法[15],28℃下培養(yǎng)4 d,觀察并記錄分生孢子的著生狀態(tài)并照相[16]。

1.2.2.2 分離菌株致病性測定

2016年5月在葡萄開花前按常規(guī)方法對分離物進行PDA平板培養(yǎng),并配制2×106/mL的分生孢子懸浮液。然后從本院葡萄園的‘夏黑’品種上,采集健康的尚未開花的葡萄幼穗,用75%的乙醇進行表面消毒,無菌水沖洗3遍后,置于底部鋪有一層無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)盒中供接種用。采用噴霧法接種(接種一次),即將配好的孢子懸浮液均勻噴灑到葡萄的幼穗上,以噴無菌水作為對照,定期觀察并記錄發(fā)病情況。發(fā)病后,按1.2.1方法進行再分離,確認再分離菌株與原接種菌株在形態(tài)上的一致性。

1.2.2.3 病原菌的分子生物學鑒定

將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上,活化培養(yǎng)5 d,收集菌絲。采用 BioFlux試劑盒法提取基因組DNA。參照王洪凱等[17]、Glass等[18]的研究方法,對供試菌株核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和組蛋白3基因序列分別進行PCR擴增。ITS區(qū)引物(ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和組蛋白3基因引物(H3-1a: 5′-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3′;H3-1b: 5′-GCGG-GCGAGCTGGATGTCCTT-3′)由上海生物工程股份有限公司合成。PCR反應體系及條件參照王洪凱等[17]和Wang等[13]。產(chǎn)物經(jīng)回收、連接和轉(zhuǎn)化后,送交上海生物工程有限公司測序。

將供試菌株的ITS區(qū)和組蛋白序列分別在NCBI上進行BLAST比對和分析。應用 MEGA 5.0 軟件中的臨近法(neighbor-joining,NJ),構(gòu)建基于rDNA-ITS和組蛋白3基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄穗軸褐枯病的癥狀

據(jù)田間調(diào)查,該病的始發(fā)期為5月下旬即葡萄開花時,到6月中旬病害達到盛發(fā)期。和內(nèi)地報道的穗軸褐枯病發(fā)生時間和癥狀基本一致。其主要特點是穗軸變褐枯死、果粒干癟并脫落(圖1a～b)。尤其在連續(xù)陰雨、溫度較低的情況下該病蔓延迅速。由于葡萄穗軸和果柄發(fā)生病變,導致全部或部分幼果失水干癟,嚴重影響產(chǎn)量。

圖1 葡萄穗軸褐枯病田間癥狀Fig.1 Symptoms of grape Alternaria rot in field

2.2 病原菌分離

從石河子和博樂地區(qū)等9個葡萄園采集的135個典型穗軸褐枯病病樣中成功分離出104個鏈格孢屬真菌Alternariaspp.的菌株,分離率為77.04%。

2.3 葡萄穗軸褐枯病病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學鑒定

觀察和測定10個具有代表性的鏈格孢菌菌株?；谛螒B(tài)特征,其中6個分離菌株在PCA平板上保濕培養(yǎng)5 d可形成長達5～15個孢子的分生孢子鏈,多數(shù)分生孢子長鏈無分支。菌落灰綠色至暗褐色。分生孢子梗單生或簇生,直立,分隔,淡褐色。分生孢子倒棍棒形、卵圓形或近橢圓形,淡褐色至暗褐色,具有0～3個縱隔膜,2～5個橫隔膜,部分分生孢子分隔處略縊縮,大小(17.5～37.5)μm×(7.5～12.5)μm,平均25.0 μm×9.3 μm,短喙柱狀,淡褐色?；谝陨咸卣?將其初步鑒定為A.tenuissima(圖2a、c、e)。另外4個菌株菌落深灰色,菌絲密集。分生孢子梗單生或簇生,直立或彎曲,有分隔,在其上部形成具短分支的孢子鏈。分生孢子近橢圓形、卵形或倒棍棒狀,呈淡褐色至暗褐色,一般具0～3個縱隔膜,2～4個橫隔膜。分生孢子表面光滑,一般2～8個串生在一起,單生較少,大小(17.5～40.0)μm×(5.0～12.5)μm,平均26.5 μm×9.1 μm,短喙圓柱形或錐形,褐色,大小(2.5～12.5)μm×(2.5～5.0)μm,部分轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)孢細胞,可二次分支或產(chǎn)孢。將這些分離株初步鑒定為A.alternata(圖2 b、d、f)。

2.3.2 病原菌的致病性測定

將供試的兩種代表性菌株接種在健康的葡萄幼果果穗上,5 d后葡萄穗軸變褐枯死,幼果果實掉落(圖3)。其癥狀與田間葡萄自然發(fā)病癥狀一致。用柯赫氏法則進行驗證,從發(fā)病的穗軸上均分離到與接種菌相同的病原菌,說明供試菌株就是造成田間穗軸褐枯的病原菌。

2.3.3 分子生物學鑒定

分別用核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物ITS1/ITS4和組蛋白引物H3-1a/H3-1b對供試的10個代表菌株進行PCR擴增和測序。rDNA-ITS區(qū)擴增結(jié)果均得到一個540 bp的片段(圖4a)。在NCBI上進行BLAST比對,10個供試菌株的ITS序列與A.tenuissima(序列號HM051071、JX860514和KF494002)的同源性以及與A.alternata(序列號KJ739880和KJ526174)的同源性均達99%,無法確定10個供試菌株的歸屬。

圖2 細極鏈格孢(a、c、e)和鏈格孢(b、d、f)菌落、分生孢子及著生方式Fig.2 Colonies, conidia and mode of production of Alternaria tenuissima (a, c, e) and A.alternata(b, d, f)

圖3 接種葡萄穗軸發(fā)病情況Fig.3 Disease occurrence on the grape rachis after inoculation

用組蛋白3引物H3-1a/H3-1b對供試菌株進行PCR擴增,所得產(chǎn)物按大小分可為546 bp和440 bp兩個組,通過1%瓊脂糖凝膠電泳很容易區(qū)分(圖4b)。序列比對和分析可知,這兩組分別為A.tenuissima組(546 bp)和A.alternata組(440 bp)。其中1～6號菌株與A.tenuissima(序列號KF280523、KP701253和KP701267)的相似性達99%;7～10號菌株與A.alternata(序列號KF308982、KF997067和KF280540)的相似性達99%。

圖4 病原菌ITS區(qū)(a)和組蛋白3基因(b)PCR擴增Fig.4 PCR amplification products of the ITS (a) and the partial coding sequence of histone 3 gene (b) of the pathogens

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,10個菌株的ITS序列與GenBank下載的菌株序列聚類分析結(jié)果(圖5)顯示,10個供試菌株與所有參與分析的菌株聚為一支。因此,用ITS區(qū)rDNA序列無法確定供試菌株與小孢子種A.alternata和A.tenuissima的分類地位。

圖5 基于鏈格孢菌rDNA-ITS序列構(gòu)建的10種菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 10 isolates based on rDNA-ITS sequences of Alternaria spp.

而用組蛋白3基因很容易將10個供試菌株區(qū)分為兩個類群,即A.alternata和A.tenuissima,其所有供試菌株與A.viticola、A.vitis等都不聚在一起(圖6),再結(jié)合菌株形態(tài)學特征,可以確定分離到病原菌是A.alternata和A.tenuissima。這與其他地區(qū)報道的病原菌A.viticola和A.vitis有所不同。

圖6 基于鏈格孢菌組蛋白3基因序列構(gòu)建的10種菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 10 isolates based on histone 3 gene sequences of Alternaria spp.

3 討論

通過研究查明,引起新疆石河子和博樂葡萄產(chǎn)區(qū)‘夏黑’品種上廣泛發(fā)生的穗軸及果梗大量變褐枯死、果粒干枯、并導致毀滅性減產(chǎn)的病害,主要病原菌是細極鏈格孢A.tenuissima(以石河子地區(qū)為主)和鏈格孢A.alternata(以博樂地區(qū)為主)。在國內(nèi)其他地區(qū)也有穗軸褐枯病由細極鏈格孢[9]和鏈格孢[10-11]侵染引起的報道。該病最易感染‘巨峰’系列品種,‘弗蕾’品種也有感染,但危害很輕。

對于細極鏈格孢和鏈格孢,其菌落特征、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)比較相似,分生孢子及著生方式?jīng)]有明顯區(qū)別,加之因受環(huán)境條件和多種基質(zhì)的影響,分生孢子形態(tài)、大小變異幅度大,從形態(tài)特征上很難將它們準確區(qū)分開來。利用真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS,因序列之間的差異較小,也難以區(qū)別。 通過系統(tǒng)發(fā)育分析組蛋白3基因序列,能夠更好地分辨出小孢子鏈格孢類群,從而彌補了rDNA序列分析的不足,這一研究結(jié)果與Wang等[13]對小孢子鏈格孢的研究所得結(jié)論比較一致。故組蛋白3基因序列分析可以作為研究鏈格孢分類鑒定的重要手段。據(jù)報道,葡萄穗軸褐枯病主要在葡萄開花前后發(fā)生,若此時陰雨連綿,氣溫偏低,易造成流行;該病發(fā)生與品種有密切的關系,一般‘巨峰’系品種發(fā)病較重;2015年在新疆天山北坡‘夏黑’葡萄品種上嚴重發(fā)生穗軸褐枯病,進一步驗證了這一結(jié)論。另外,‘弗蕾’品種雖發(fā)病不重,但從其上也分離到該病病原菌。2004年馬俊義等曾報道在新疆哈密葡萄園發(fā)生嚴重的穗軸褐枯病,‘無核白’、‘木納格’和‘紅地球’的發(fā)病指數(shù)分別為60.52、15.01和11.65,其病原為Alternariaviticola,故該病在新疆其他葡萄產(chǎn)區(qū)的病原種類發(fā)生情況有待繼續(xù)調(diào)查和鑒定。鑒于該病在新疆沿天山北坡一帶‘夏黑’葡萄上發(fā)生比較嚴重,在葡萄開花前后,特別是種植‘夏黑’葡萄較多的地區(qū),應注意及時進行防治。

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(責任編輯：田 喆)

Identification of the pathogens of grape spike-stalk brown along theTianshan Mountains

Yang Chao1, Zhang Guoli2, Ren Yuzhong3, Zhong Yangqiong3, Gao Xianglei3, Li Zhuo3, Zhang Yaping1, Li Guoying3

(1. College of Life Science, Shihezi University, Shihezi 832000, China; 2.Biotechnology Research Institute, Xinjiang Academy ofAgricultural Reclamation, Shihezi 832000, China; 3.College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi 832000, China)

A grape disease which caused brown necrosis of the spike-stalk and fruit shrinkage was observed on ‘Summer Black’ grape along the Tianshan Mountains in Northern Xinjiang in 2015. The disease incidence in some orchards reached 100%, reducing yields by 30%-50%. One hundred and fourAlternariaspp. were isolated from diseased tissues to determine the causal agent of the disease. Ten representative isolates were selected for morphological observation, pathogenicity tests, comparison of internal transcribed spacer regions 1 and 4, and histone 3 nucleotide sequences. The results showed thatA.tenuissimaandA.alternatawere the causal pathogens of spike-stalk brown spot in grape. This was different from previous reports from other regions of China.

grape; spike-stalk brown spot; identification of pathogen;Alternariaspp.

2016-06-06

2016-09-16

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203035)

S 436.631.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.022

* 通信作者 E-mail：lgyshzu@163.com; 510224419@qq.com