郭蕓琿，于媛媛，溫立柱，孫翠慧，孫憲芝，王文莉，孫霞，鄭成淑

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/山東省中日韓菊花國(guó)際合作研究中心，山東泰安 271018)

硝態(tài)氮影響菊花根系形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的分子基礎(chǔ)

郭蕓琿，于媛媛，溫立柱，孫翠慧，孫憲芝，王文莉，孫霞，鄭成淑

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/山東省中日韓菊花國(guó)際合作研究中心，山東泰安 271018)

【目的】通過(guò)觀察硝態(tài)氮處理下菊花根系外觀形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)、根系和葉片中硝態(tài)氮含量、內(nèi)源激素水平以及根系硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和側(cè)根發(fā)育特異基因表達(dá)量的變化，揭示硝態(tài)氮對(duì)菊花根系發(fā)育的影響及其分子基礎(chǔ)，為氮素高效利用的菊花分子育種提供依據(jù)。【方法】利用菊花扦插生根苗的水培試驗(yàn)，用10 mmol·L-1KNO3處理（對(duì)照為不含N元素的Hogland營(yíng)養(yǎng)液）后，分別在第0、1、3、7、14、21和28天觀察菊花根系外觀形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)，測(cè)定根系和葉片硝態(tài)氮（NO3-）、吲哚-3-乙酸（IAA）和細(xì)胞分裂素（CTK）含量，克隆菊花根系硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CmNRT1.1、CmNRT2.1、CmNAR2.1和側(cè)根發(fā)育特異轉(zhuǎn)錄因子基因CmANR1的cDNA保守序列片段，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)它們?cè)诟抵械南鄬?duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】與對(duì)照相比，處理的根系總根長(zhǎng)、平均直徑、總表面積、總體積和根尖數(shù)至處理第3天均沒(méi)有顯著差異，但第7天時(shí)均顯著增加，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，增加的幅度增大。顯微觀察第28天時(shí)的根橫切面表明，與對(duì)照相比，1級(jí)根、2級(jí)根和3級(jí)根的維管束直徑和維管束占根橫切面的比值均出現(xiàn)了不同程度的增加。處理的根系和葉片的NO3-含量分別在處理第7天和第14天時(shí)達(dá)到高峰（峰值分別為0.45和0.35 mg·g-1FW），之后雖有所回落，但與對(duì)照相比始終處于較高水平（對(duì)照的根系和葉片硝態(tài)氮含量分別保持在0.17—0.27 mg·g-1FW和0.16—0.22 mg·g-1FW）。處理的根系、葉片的IAA和CTK含量與對(duì)照相比均顯著增加，根系IAA和CTK含量高峰在第7天出現(xiàn)，葉片的在第14天出現(xiàn)，而對(duì)照的IAA和CTK含量無(wú)明顯變化。處理的根系硝態(tài)氮信號(hào)感應(yīng)和低親和型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CmNRT1.1的相對(duì)表達(dá)量高峰出現(xiàn)在第1天（對(duì)照也為第1天）；高親和型硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CmNRT2.1和二者的互作蛋白基因CmNAR2.1的相對(duì)表達(dá)量高峰均出現(xiàn)在第3天（對(duì)照在第3天稍微增加后保持相對(duì)穩(wěn)定）；菊花側(cè)根發(fā)育基因CmANR1的相對(duì)表達(dá)量在第7天達(dá)到高峰（對(duì)照為第14天）。硝態(tài)氮處理后這4個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比始終處于較高水平，表達(dá)趨勢(shì)也相似，都是先升高后降低再保持相對(duì)穩(wěn)定，表明它們均受硝態(tài)氮信號(hào)誘導(dǎo)?！窘Y(jié)論】菊花根系能通過(guò)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和側(cè)根發(fā)育基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)生長(zhǎng)介質(zhì)中的硝態(tài)氮信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控根系構(gòu)型的改變，來(lái)提高菊花根系對(duì)硝態(tài)氮的吸收和利用。

菊花；根系；硝態(tài)氮；內(nèi)源激素；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】菊花（Chrysanthemum morifolium）是中國(guó)傳統(tǒng)名花，也是世界四大切花之一，其產(chǎn)量和銷(xiāo)量均位于世界花卉前列[1]，在世界范圍內(nèi)廣泛用作切花、盆花及庭園綠化[2]。氮素對(duì)菊花的產(chǎn)量和品質(zhì)至關(guān)重要，但施用過(guò)量不僅影響菊花的產(chǎn)量和品質(zhì)，還會(huì)由于不能被植株及時(shí)吸收利用，而引起肥料資源的大量浪費(fèi)和地下水環(huán)境的嚴(yán)重污染[3]。因此，研究菊花根系響應(yīng)硝態(tài)氮信號(hào)的分子機(jī)理，選育氮高效利用的菊花新品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)模式植物擬南芥的氮素營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行過(guò)大量研究。研究認(rèn)為[4-5]，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中已形成根系養(yǎng)分捕獲塑性，形成了感知和捕獲 NO3-的復(fù)雜機(jī)制。FITTER等[6]研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)尾形分支根系可以吸收更多的營(yíng)養(yǎng)，以適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)貧瘠的環(huán)境，而叉狀分支根系較適合于營(yíng)養(yǎng)豐富的生境條件。擬南芥根系在土壤低NO3-濃度時(shí)，細(xì)根直徑變小，比根長(zhǎng)增加，分枝角減小。劉大同等[7]研究表明，生長(zhǎng)在硝態(tài)氮富集土壤中的小麥1級(jí)側(cè)根明顯比生長(zhǎng)在缺氮環(huán)境中的粗壯。在擬南芥中也觀察到氮富集土壤中生長(zhǎng)的側(cè)生根中柱直徑、中柱細(xì)胞數(shù)及外皮層細(xì)胞數(shù)都比缺氮環(huán)境中的明顯增加[8]。也有研究表明，硝態(tài)氮信號(hào)被擬南芥根系感知，引起根系內(nèi)源IAA和CTK水平發(fā)生變化，從而促進(jìn)側(cè)根的生長(zhǎng)[9]。XU等[10]研究表明，生長(zhǎng)介質(zhì)中的NO3-能誘導(dǎo)擬南芥根系硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNRT1.1和AtNRT2.1的表達(dá)上調(diào)，并與AtNAR2.1蛋白互作，調(diào)控下游側(cè)根發(fā)育特異轉(zhuǎn)錄因子基因AtANR1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)擬南芥?zhèn)雀纳L(zhǎng)和發(fā)育[10]。之前國(guó)內(nèi)外對(duì)菊花氮素營(yíng)養(yǎng)的研究主要集中在氮素水平/形態(tài)或施入土壤中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的比例對(duì)菊花體內(nèi)外氮循環(huán)、生理作用及產(chǎn)量和觀賞品質(zhì)的影響上[11-13]。近年來(lái)，在菊花中也研究了菊花根系硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CmNRT1.1和CmNRT2.1，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能進(jìn)行了驗(yàn)證[14]。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于硝態(tài)氮信號(hào)誘導(dǎo)菊花根系形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的分子機(jī)理研究未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究外源硝態(tài)氮處理對(duì)菊花根系外觀形態(tài)與解剖結(jié)構(gòu)、NO3-含量、內(nèi)源激素水平、菊花根系硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CmNRTs和側(cè)根發(fā)育基因CmANR1表達(dá)的影響，旨在揭示菊花響應(yīng)硝態(tài)氮的根系結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的分子機(jī)理，為培育氮高效利用菊花新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2015年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站和園藝科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料采用國(guó)內(nèi)外主栽切花菊品種‘神馬’。取生長(zhǎng)健壯、大小一致的菊花插穗（高約8 cm，頂部帶2—3片幼葉）進(jìn)行扦插，約3周后扦插生根。3月25日將生根均勻、長(zhǎng)勢(shì)健壯的扦插生根苗轉(zhuǎn)移到人工氣候室（光照周期定為日14 h/夜10 h，溫度為晝22℃/夜 18℃，相對(duì)濕度約 75%）中裝有細(xì)砂的方盆中緩沖2 d，然后轉(zhuǎn)入盛有4 L無(wú)N元素的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的黑色方形塑料盆（長(zhǎng)48 cm、寬 29 cm、高12 cm）中，幼苗根莖交界處經(jīng)海綿包裹后用聚乙烯泡沫板固定于塑料盆中，以氣泵對(duì)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行連續(xù)通氣，每6 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。每盆25株，共20盆。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的硝態(tài)氮濃度（0、1、10、20、30 mmol·L-1）處理后，菊花的長(zhǎng)勢(shì)調(diào)查結(jié)果表明，10 mmol·L-1硝態(tài)氮處理下菊花的長(zhǎng)勢(shì)最好[14]，因此，本試驗(yàn)KNO3處理濃度設(shè)為0和10 mmol·L-1（各10盆）。處理后于第0、1、3、7、14、21、28天分別取不同處理的菊花根系和葉片，根據(jù)試驗(yàn)需要分別進(jìn)行后續(xù)觀察和分析。每處理3次重復(fù)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 根系形態(tài)構(gòu)型測(cè)定 用根系掃描儀 EPSON（G780B，Seiko Epson Corp.，Tokyo，Japan）掃描KNO3處理后第0、1、3、7、14、21、28天時(shí)的菊花根系。用WinRHIZO軟件（2007年版）分析處理樣品圖像，計(jì)算每個(gè)樣品的總根長(zhǎng)、平均直徑、總表面積、總體積和根尖數(shù)等參數(shù)的平均值。

1.2.2 根系解剖結(jié)構(gòu)觀察 第28天時(shí)，取對(duì)照和硝態(tài)氮處理的新鮮菊花根系，切取粗細(xì)基本一致的距離根莖約1 cm處的1級(jí)根（扦插生出的初級(jí)根）、距離根莖最近的1 cm處的2級(jí)根（第1側(cè)根）和3級(jí)根（第2側(cè)根）的橫截面制成臨時(shí)切片，采用帶有刻度的生物顯微鏡觀察根系解剖結(jié)構(gòu)，其放大倍數(shù)為100×。觀察3個(gè)視野，取平均值。

1.2.3 硝態(tài)氮含量測(cè)定 采用任同輝[15]的水楊酸比色法。取根系和葉片各2 g，加去離子水10 mL研磨后移入15 mL離心管，30 min沸水浴，冷卻后3 500 r/min離心10 min。將提取液過(guò)濾到25 mL容量瓶中并定容，吸取0.1 mL樣品液，加入0.4 mL 5%水楊酸試劑，混勻后室溫放置 20 min，再加入 9.5 mL 8% NaOH，搖勻，待冷卻至室溫后，在410 nm處比色測(cè)OD值。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.4 內(nèi)源激素的提取和測(cè)定 采用林貴玉等[16]的方法。稱取根系和葉片樣品各5 g置于研缽中加入液態(tài)氮，研細(xì)后加入預(yù)冷的80%甲醇60 mL，再均勻研細(xì)，轉(zhuǎn)到150 mL錐形瓶中，加塞放入4℃振蕩器中，振蕩24 h后過(guò)濾，濾渣中再加入預(yù)冷的80%甲醇20 mL，放置在冰箱里過(guò)夜， 再過(guò)濾，合并濾液。取10 mL濾液，通過(guò)SeppakC18小柱（美國(guó)Waters公司），用4 mL乙腈通過(guò)小柱，收集洗出液，過(guò)0.45 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。使用Waters201型HPLC（美國(guó)Waters公司），NovaparC18（0.5 cm×15 cm）柱，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（20﹕20﹕60，pH 3.5），UV檢測(cè)器254 nm。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.5 基因保守序列片段克隆和qPCR檢測(cè) 采用田素波等[17]的方法。分別取KNO3處理后第0、1、3、7、14、21、28天的根系，放入液氮中迅速冷凍后，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中保存。根系總 RNA的提取采用TRNzol法，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用天根生化科技（北京）有限公司的FastKing RT Kit（With gDNase）（KR116）試劑盒，用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè) CmNRT1.1、CmNRT2.1、CmNAR2.1、CmANR1在菊花根系中的表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)從 NCBI中引用 AtNRT1.1、AtNRT2.1、AtNAR2.1、AtANR1的序列，然后與菊花轉(zhuǎn)錄組相關(guān)基因進(jìn)行blast同源性比對(duì)，再使用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。每處理3次重復(fù)，qPCR引物設(shè)計(jì)如下（表1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 17.0軟件的LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 菊花根系外觀形態(tài)

利用根系掃描儀掃描硝態(tài)氮處理（圖 1）和對(duì)照的菊花根系，并通過(guò)軟件計(jì)算根系形態(tài)相關(guān)指標(biāo)（表2）。結(jié)果表明，硝態(tài)氮處理的與對(duì)照相比，菊花根系總長(zhǎng)度、平均直徑、總表面積、總體積和根尖數(shù)至處理后的第3天為止沒(méi)有出現(xiàn)明顯差異，而第7天時(shí)出現(xiàn)明顯差異，分別比對(duì)照增加了46.94%、6.12%、32.25%、60.94%、76.32%，而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，以上各指標(biāo)均有不同程度的增加。第28天時(shí)，硝態(tài)氮處理的菊花根系總長(zhǎng)度、平均直徑、總表面積、總體積和根尖數(shù)與對(duì)照相比，分別增加了 205.63%、59.80%、129.33%、114.33%、105.04%。說(shuō)明生長(zhǎng)介質(zhì)中的NO3-會(huì)影響菊花根系構(gòu)型的改變。

表1 相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量所用PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences used in real time PCR amplification

圖1 硝態(tài)氮對(duì)菊花根系外觀形態(tài)的影響Fig. 1 Effects of NO3-on the root appearance of chrysanthemum

表2 硝態(tài)氮對(duì)菊花總根長(zhǎng)、平均直徑、總表面積、總體積和根尖數(shù)的影響Table 2 Effects of NO3-on the overall lengths, average diameters, total surface areas, total volumes and tips of roots in chrysanthemum

2.2 菊花根系解剖結(jié)構(gòu)

利用帶刻度的生物顯微鏡觀察處理后第28天的菊花根系橫切面，并測(cè)定各級(jí)側(cè)根的維管束大小（表3）。結(jié)果表明，硝態(tài)氮處理的菊花根系1級(jí)根（扦插生出的初級(jí)根）的維管束直徑為 0.103 mm，2級(jí)根的維管束直徑為0.107 mm，3級(jí)根的維管束直徑為0.102 mm。硝態(tài)氮處理的1級(jí)根、2級(jí)根和 3級(jí)根的維管束直徑與對(duì)照相比分別增加5.10%、13.83%和5.15%；維管束占根橫切面直徑的比例與對(duì)照相比也明顯增加，分別增加了15.70%、13.80%和12.42%。從圖2可以看出，與對(duì)照相比，硝態(tài)氮處理的菊花1級(jí)根、2級(jí)根和3級(jí)根的維管束直徑以及維管束占根橫切面直徑的比例均較大。

表3 硝態(tài)氮對(duì)菊花根維管束直徑、維管束和根徑比的影響Table 3 Effects of NO3-on the vascular bundle diameters, ratio of vascular bundle diameter and root diameter of the roots in chrysanthemum 28 days after treatments

圖2 硝態(tài)氮處理后第28天菊花根系橫切面Fig. 2 Root cross sections of chrysanthemum on the 28 day

2.3 菊花根系和葉片中的NO3-含量

硝態(tài)氮處理的菊花根系 NO3-含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在處理第7天時(shí)達(dá)到高峰（圖3），峰值為 0.45 mg·g-1FW，之后有所下降，然后保持在0.39—0.41 mg·g-1FW，但對(duì)照的菊花根系NO3-含量在整個(gè)試驗(yàn)期間保持在0.17—0.27 mg·g-1FW。硝態(tài)氮處理的菊花葉片 NO3-含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)也有所增加，在處理第14天時(shí)達(dá)到高峰，峰值為0.35 mg·g-1FW，之后有所下降，然后保持在0.29—0.32 mg·g-1FW，而對(duì)照的菊花葉片 NO3-含量在整個(gè)試驗(yàn)期間均顯著少于處理組，保持在0.16—0.22 mg·g-1FW。比較根系和葉片中NO3-含量，對(duì)照的菊花根系NO3-含量早期比葉片多，但后期含量明顯比葉片少，而硝態(tài)氮處理的菊花根系NO3-含量始終比葉片中的含量高。

圖3 硝態(tài)氮對(duì)菊花根系和葉片NO3-含量的影響Fig. 3 Effects of NO3-on the nitrate contents of the roots and leaves of chrysanthemum

2.4 根系和葉片中IAA和CTK的含量

從圖4可以看出，硝態(tài)氮處理的菊花根系中IAA含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在處理第7天時(shí)達(dá)到最大值0.83 ng·g-1FW，稍有下降后保持在0.68—0.75 ng·g-1FW，而對(duì)照的根系中IAA含量變化幅度較小，保持在0.56—0.67 ng·g-1FW（圖4-A）。葉片中IAA含量的變化趨勢(shì)基本與根系中的變化趨勢(shì)相似，但葉片IAA含量比根系的高，而且硝態(tài)氮處理的葉片IAA含量高峰出現(xiàn)在處理第14天時(shí)，比根系的高峰出現(xiàn)時(shí)期晚7 d（圖4-B）。根系和葉片CTK含量的變化趨勢(shì)與IAA的變化趨勢(shì)也有相似之處，硝態(tài)氮處理的根系中CTK含量在第7天出現(xiàn)高峰，峰值為0.19 ng·g-1FW，而對(duì)照的根系中CTK含量保持在0.11—0.14 ng·g-1FW（圖4-C）。葉片中CTK含量與根系中的變化趨勢(shì)相似，但葉片中CTK含量整體水平比根系中的高，且硝態(tài)氮處理的葉片CTK含量峰值也出現(xiàn)在處理第14天時(shí)（圖4-D），雖然變化趨勢(shì)相似，但葉片和根系中IAA和CTK含量差異明顯。

圖4 硝態(tài)氮對(duì)菊花根系和葉片中IAA和CTK含量的影響Fig. 4 Effects of NO3-on the contents of IAA and CTK of the roots and leaves of chrysanthemum

2.5 根系中硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 CmNRT1.1、CmNRT2.1、CmNAR2.1和側(cè)根發(fā)育基因CmANR1的表達(dá)

從圖5可以看出，硝態(tài)氮處理的CmNRT1.1的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比差異顯著，處理第 1天時(shí)CmNRT1.1表達(dá)量達(dá)到高峰，之后逐漸下降并保持平穩(wěn)狀態(tài)（圖5-A）。CmNRT2.1的相對(duì)表達(dá)量在處理第3天時(shí)達(dá)到高峰，之后有所下降，但與對(duì)照相比始終處于較高水平（圖5-B），CmNAR2.1的相對(duì)表達(dá)量在第3天達(dá)到高峰，第7天時(shí)下降，第14天時(shí)又回升，隨后逐漸下降（圖 5-C）。菊花側(cè)根發(fā)育特異基因CmANR1的相對(duì)表達(dá)量在第7天時(shí)達(dá)到高峰，第21天后稍微回落，但與對(duì)照相比始終處于較高水平（圖5-D）?？傮w來(lái)看，CmNRT1.1最早出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)高峰，CmNRT2.1和CmNAR2.1延后出現(xiàn)高峰，CmANR1最晚達(dá)到表達(dá)高峰。

3 討論

3.1 硝態(tài)氮對(duì)菊花根系構(gòu)型和解剖結(jié)構(gòu)的影響

植物根系形態(tài)構(gòu)型是決定植物獲取養(yǎng)分的重要因素，而根系形態(tài)建成過(guò)程受自身遺傳因素和生長(zhǎng)介質(zhì)養(yǎng)分供應(yīng)狀況的影響[18]。植物能感受生長(zhǎng)介質(zhì)中氮、磷、硫和鐵等元素的養(yǎng)分有效性并形成可識(shí)別的信號(hào)，從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的分裂和分化，影響根毛的形成、主根的生長(zhǎng)和側(cè)根的發(fā)育，最終導(dǎo)致根構(gòu)型的變化[19]。根尖是根系吸收水分和養(yǎng)分的重要部位，根尖數(shù)越多，根長(zhǎng)越長(zhǎng)，根系表面積越大，越有利于養(yǎng)分的有效捕獲[20]。DATTA等[21]研究表明，較高濃度的NO3-處理促進(jìn)擬南芥?zhèn)雀纳扉L(zhǎng)，是通過(guò)增加分生組織細(xì)胞的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而且這一生理過(guò)程是由具有硝態(tài)氮感應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的 AtNRT1.1調(diào)控側(cè)根發(fā)育特異基因 AtANR1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[22]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，10 mmol·L-1濃度硝態(tài)氮處理的菊花根總長(zhǎng)、平均直徑、總表面積、總體積和根尖數(shù)均顯著增加，而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，增加幅度越大。同時(shí)，觀察根系維管束和根橫切面發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮處理的1級(jí)根、2級(jí)根和3級(jí)根的維管束直徑及維管束占根橫切面直徑的比例與對(duì)照相比均明顯增加。硝態(tài)氮處理影響了菊花的根系構(gòu)型和解剖結(jié)構(gòu)，這說(shuō)明菊花根系能響應(yīng)生長(zhǎng)介質(zhì)中的硝態(tài)氮信號(hào)，而響應(yīng)這種信號(hào)是通過(guò)諸多基因的表達(dá)調(diào)控和改變自身根系組織結(jié)構(gòu)及外部形態(tài)構(gòu)型來(lái)實(shí)現(xiàn)的[19]。但如果生長(zhǎng)介質(zhì)中NO3-濃度過(guò)高，則會(huì)抑制側(cè)根的生長(zhǎng)，其原因可能是根系中IAA的過(guò)多累積，也可能是IAA信號(hào)途徑發(fā)生了改變而引起側(cè)根生長(zhǎng)的抑制[7]。本研究前期預(yù)試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮濃度過(guò)高（20、30 mmol·L-1）時(shí)菊花根系生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，側(cè)根發(fā)生較少或不能生長(zhǎng)，說(shuō)明適宜的硝態(tài)氮濃度是植物根系正常發(fā)育的必要條件。

圖5 硝態(tài)氮對(duì)菊花根系CmNRT1.1、CmNRT2.1、CmNAR2.1和CmANR1相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 5 Effects of NO3-on the relative expression of CmNRT1.1, CmNRT2.1, CmNAR2.1, and CmANR1 in roots of chrysanthemum

3.2 硝態(tài)氮對(duì)菊花根系和葉片中NO3-含量的影響

已有研究表明，施用硝態(tài)氮肥能促進(jìn)菊花對(duì)硝酸鹽的吸收，提高菊花中硝酸鹽的含量，但其產(chǎn)量不會(huì)以相應(yīng)的比例增加，過(guò)多施用氮肥時(shí)產(chǎn)量甚至降低[23]。本研究結(jié)果表明，硝態(tài)氮處理的菊花根系和葉片中硝態(tài)氮含量均有所提高，且對(duì)照的菊花根系NO3-含量早期比葉片多，后期含量明顯比葉片少，而硝態(tài)氮處理的菊花根系NO3-含量始終比葉片中的含量高。這說(shuō)明菊花植株不同部位的硝酸鹽含量有很大差異，氮的供應(yīng)水平對(duì)植物體硝酸鹽含量有顯著的影響。當(dāng)外界N水平較高時(shí)，菊花對(duì)硝酸鹽的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)主要是受低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NRT1影響，NRT1表達(dá)量高，菊花根系和葉片的硝酸鹽含量也高。

3.3 菊花響應(yīng)硝態(tài)氮根系形態(tài)結(jié)構(gòu)改變與內(nèi)源 IAA和CTK水平的關(guān)系

BOUGUYON等[24]研究認(rèn)為，擬南芥NO3-信號(hào)同時(shí)誘導(dǎo)ANR1在根部的表達(dá)和IAA向根部的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并引起側(cè)根的伸長(zhǎng)，而且側(cè)根生長(zhǎng)期間細(xì)胞發(fā)生一系列大小和形態(tài)上的變化，以及組織中IAA和CTK水平的動(dòng)態(tài)變化[10]。另外，局部NO3-處理對(duì)擬南芥?zhèn)雀扉L(zhǎng)的刺激作用主要是由于側(cè)根分生組織分裂產(chǎn)生了更多的細(xì)胞[20]。玉米側(cè)根分生組織中 CTK的產(chǎn)生也具有NO3-依賴性變化，在玉米缺氮的根部重新供給NO3-時(shí)，能夠快速刺激根系CTK的生物合成及其向根尖的轉(zhuǎn)運(yùn)[25-26]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，硝態(tài)氮處理的菊花根系和葉片中 IAA和CTK含量均顯著提高，而根系中IAA和CTK含量與葉片中的相比整體水平相對(duì)減少，說(shuō)明根系NO3-信號(hào)能使少量的IAA向根部轉(zhuǎn)導(dǎo)，也能使根系合成CTK引起菊花側(cè)根的形成和伸長(zhǎng)[16]。有研究報(bào)道表明，高濃度硝態(tài)氮抑制側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育[27]，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，無(wú)論IAA還是CTK在根系中的分布量都比葉片中的量少，這可能是因?yàn)楦淀憫?yīng) NO3-信號(hào)，并引起側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育需要較少量的IAA和CTK，這也解釋了植物根系中IAA和CTK濃度過(guò)高會(huì)抑制根系生長(zhǎng)及高濃度硝態(tài)氮抑制側(cè)根生長(zhǎng)的事實(shí)[27-28]。但高濃度 NO3-對(duì)側(cè)根的抑制作用不僅是IAA或CTK的變化所致，還可能存在其他的調(diào)節(jié)機(jī)制，這方面機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

3.4 菊花響應(yīng)硝態(tài)氮根系形態(tài)結(jié)構(gòu)改變與相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系

在通氣良好的土壤中，硝態(tài)氮是植物吸收的主要氮源，其不僅是氮同化的代謝底物，而且還可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[29]。硝態(tài)氮可以調(diào)節(jié)許多基因的變化，如編碼硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及與硝酸鹽吸收、還原、同化作用相關(guān)酶的基因等，來(lái)最大限度地捕獲、吸收、利用氮素，從而滿足自身正常生命活動(dòng)的需要。這些基因通?？墒艿较跛猁}的迅速誘導(dǎo)，且不依賴蛋白質(zhì)的從頭合成，因此被稱為硝酸鹽初級(jí)響應(yīng)基因，總數(shù)多達(dá)1 000個(gè)[29]。NRT1.1是硝態(tài)氮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的感受蛋白，也是低親和型硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且具有在細(xì)胞之間運(yùn)輸IAA的功能[20]，而NRT2.1是高親和型硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們共同與NAR2.1蛋白互作，調(diào)控側(cè)根發(fā)育特異基因ANR1的表達(dá)[27]。ANR1是一個(gè)編碼NO3-誘導(dǎo)的根特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子MADS box的家族成員[22]。ANR1被阻遏的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，培養(yǎng)基中富含NO3-的區(qū)域內(nèi)側(cè)根不再優(yōu)先生長(zhǎng)[30]。本研究結(jié)果表明，硝態(tài)氮處理的菊花根系中這4個(gè)基因的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著增加，說(shuō)明這4個(gè)基因均受硝態(tài)氮信號(hào)誘導(dǎo)。不同的是，硝態(tài)氮處理的根系中 CmNRT1.1在處理第1天達(dá)到表達(dá)高峰，CmNRT2.1、CmNAR2.1在處理第3天達(dá)到高峰，而CmANR1在第7天出現(xiàn)高峰，且CmNAR2.1的表達(dá)量變化幅度沒(méi)有其他3個(gè)基因明顯。由此推測(cè)CmNRT1.1和CmNRT2.1雖然調(diào)控下游側(cè)根發(fā)育特異基因CmANR1的表達(dá)，但可能不是持續(xù)調(diào)控，只是在前期誘導(dǎo)啟動(dòng)CmANR1的表達(dá)，后期則由CmANR1自身持續(xù)表達(dá)，或者還可能受到內(nèi)源激素等其他通路基因的調(diào)控[29]。

4 結(jié)論

硝態(tài)氮處理改變了菊花根系形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育。在這個(gè)過(guò)程中，根系維管束結(jié)構(gòu)、硝態(tài)氮含量、內(nèi)源激素水平和相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了相應(yīng)改變。說(shuō)明菊花根系能夠通過(guò)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和側(cè)根發(fā)育基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)生長(zhǎng)介質(zhì)中的硝態(tài)氮信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控根系構(gòu)型的改變，從而提高菊花根系對(duì)硝態(tài)氮的吸收和利用。菊花根系的這種捕獲硝態(tài)氮信號(hào)的機(jī)制為植株的正常生命活動(dòng)提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1] 任洪艷, 孫霞, 鄭成淑, 王文莉, 孫憲芝, 束懷瑞. 利用cDNA-AFLP 技術(shù)篩選菊花開(kāi)花相關(guān)基因. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(16): 3386-3394.

REN H Y, SUN X, ZHENG C S, WANG W L, SUN X Z, SHU H R. Differential analysis of flowering related genes by cDNA-AFLP in chrysanthemum. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(16): 3386-3394. (in Chinese)

[2] 林桂玉, 黃在范, 張翠華, 鄭成淑. 菊花花芽分化期超微弱發(fā)光及生理代謝的變化. 園藝學(xué)報(bào), 2008, 35(12): 1819-1824.

LIN G Y, HUANG Z F, ZHANG C H, ZHENG C S. Changes in ultra weak uminescence intensity, respiration rate and physiologicalmetabolism of chrysanthemum during floral differentiation. Acta Horticulturae Sinica, 2008, 35(12): 1819-1824. (in Chinese)

[3] 郭春曉, 鄭成淑, 謝紅英, 徐瑾, 馬海燕. 鹽脅迫下外源水楊酸對(duì)菊花根系離子含量和 ATPase及 PPase 活性的影響. 園藝學(xué)報(bào), 2011, 38(6): 1167-1172.

GUO C X, ZHENG C S, XIE H Y, XU J, MA H Y. Effects of exogenous salicylic acid on ion content, activities of ATPase and PPase of the roots in chrysanthemum under salt stress. Acta Horticulturae Sinica, 2011, 38(6): 1167-1172. (in Chinese)

[4] FORDE B G. Nitrogen signaling pathways shaping root system architecture: an update. Current Opinion in Plant Biology, 2014, 21: 30-36.

[5] 姜天華, 單佩佩, 黃在范, 溫立柱, 孫翠慧, 劉坤, 鄭成淑. 施用氮肥對(duì)油用牡丹葉片氮素吸收積累與籽粒品質(zhì)的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2016, 27(10): 3257-3263.

JIANG T H, SHAN P P, HUANG Z F, WEN L Z, SUN C H, LIU K, ZHENG C S. Effects of nitrogen fertilization application on the nitrogen uptake, accumulation, and yield quality of oil peony. Chinese Journal of Applied Ecology, 2016, 27(10):3257-3263. (in Chinese)

[6] FITTER M, ABRAM B, LORENZO H. The nutritional control of root development. Plast Soil, 2010, 232: 51-68.

[7] 劉大同, 荊彥平, 李棟梁, 余徐潤(rùn), 王忠. 植物側(cè)根發(fā)育的研究進(jìn)展. 植物生理學(xué)報(bào), 2013, 49(11): 1127-1137.

LIU D T, JING Y P, LI D L, YU X R, WANG Z. Research advances in plant lateral root development. Plant Physiology Journal, 2013, 49(11): 1127-1137. (in Chinese)

[8] WALCH L, GAN Y, FILLEUR S, FORDE B G. Nitrogen signaling and the regulation of root development. Aspects Applied Biology, 2005, 73: 99-106.

[9] ALONI R, ALONI E, LANGHANS M, ULLRICH C I. Role of cytokinin and auxin in shaping root architecture: regulating vascular differentiation, lateral root initiation, root apical dominance and root gravitropism. Annals of Botany, 2006, 97(5): 883-893.

[10] XU N, WANG R C, ZHAO L F, ZHANG C F, LI Z H, ZHAO L, LIU F, GUAN P Z, CHU Z H, CRAWFORD N M, WANG Y. The Arabidopsis NRG2 protein mediates nitrate signaling and interacts with and regulates key nitrate regulators. The Plant Cell, 2016, 28(2): 485-504.

[11] 郭春曉，王文莉，鄭成淑，時(shí)連輝，束懷瑞. 鹽脅迫下外源 SA 對(duì)菊花體內(nèi)離子含量和凈光合速率的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(15): 3185-3192.

GUO C X, WANG W L, ZHENG C S, SHI L H, SHU H R. Effects of exogenous salicylic acid on ions contents and net photosynthetic rate in chrysanthemum under salt stress. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(15):3185-3192. (in Chinese)

[12] 孫霞, 王秀峰, 鄭成淑, 邢世巖, 束懷瑞. 菊花節(jié)律鐘輸出基因CmGI（GIGANTEA）的cDNA全長(zhǎng)克隆、序列信息及定量表達(dá)分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(13): 2690-2703.

SUN X, WANG X F, ZHENG C S, XING S Y, SHU H R. The cDNA cloning and analysis of sequence information and quantitative express of chrysanthemum rhythms clock output gene CmGI (GIGANTEA). Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(13): 2690-2703. (in Chinese)

[13] FAN H M, LI Y Y, SUN X, WANG W L, SUN X Z, ZHENG C S. Effects of humic acid derived from sediments on growth, photosynthesis and chloroplast ultrastructure in chrysanthemum. Scientia Horticulturae, 2014, 177(2): 118-123.

[14] 顧春筍. 菊花 CmNRT1.1基因的克隆和功能鑒定[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

GU C S. Cloning and functional analysis of CmNRTs in chrysanthemum [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012. (in Chinese)

[15] 任同輝. 蘿卜硝酸鹽含量分析的初步研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

REN T H. Primary studies on nitrate content in radish (Raphanus sativus L.) [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2005. (in Chinese)

[16] 林貴玉, 鄭成淑, 孫憲芝, 王文莉. 光周期對(duì)菊花花芽分化和內(nèi)源激素的影響. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(1): 35-39.

LIN G Y, ZHENG C S, SUN X Z, WANG W L. Effects of photoperiod on floral bud differentiation and contents of endogenous hormonesin chrysanthemum. Shandong Agricultural Sciences, 2008(1): 35-39. (in Chinese)

[17] 田素波, 林桂玉, 鄭成淑, 孫霞, 任洪艷, 溫立柱. 菊花花發(fā)育基因 CmCO和 CmFT的克隆與表達(dá)分析. 園藝學(xué)報(bào). 2011, 38(6): 1129-1138.

TIAN S B, LIN G Y, ZHENG C S, SUN X, REN H Y, WEN L Z. Cloning and expression of CmCO and CmFT of floral development genes in chrysanthemum. Acta Horticulturae Sinica, 2011, 38(6): 1129-1138. (in Chinese)

[18] VIDAL E A, ARAUS V, LU C, PARRY G, GREEN P J, CORUZZI G M, GUTIERREZ R A. Nitrate-responsive miR393/AFB3 regulatory module controls root system architecture in Arabidopsis thaliana.Proceedings of the National Academy Sciences of USA, 2015, 107: 4477-4482.

[19] DESMET L, TETSUMURA T, DERYBEL B, FREY N, LAPLAZE L, CASIMIRO L, SWARUP R, NAUDTS M, VANNESTE S, AUDENAERT D. Auxin dependent regulation of lateral root positioning in the basal meristem of Arabidopsis thaliana. Development, 2007, 134: 681-690.

[20] ZHANG H M, ANDREA J, PETER W B, BRAIN G F. Dual pathways for regulation of root branching by nitrate. Plant Biology, 1999, 96(11): 6529-6534.

[21] DATTA S, HETTIARACHCHI G H, DENG X W, HOLMA M. Arabidopsis CONSTANS-LIKE3 is a positive regulator of red light signaling and root growth. The Plant Cell, 2006, 18(1): 70-84.

[22] ZHANG H M, FORDE B G. An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science, 1998, 279: 407-409.

[23] 李麗. 氮素濃度及形態(tài)對(duì)葉用蘿卜硝酸鹽含量的影響[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

LI L. Effects of different nitrogen concentration and form on nitrate in radish leaf [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2004. (in Chinese)

[24] BOUGUYON E, BRUN F, MEYNARD D, KUBES M, PREVENT M, LERAN S, LACOMBE B, KROUK G, GUIDERDONI E, ZAZIMALOVA E, HOYEROVA K, NACRY P, GOJON A. Multiple mechanisms of nitrate sensing by Arabidopsis thaliana nitrate transceptor NRT1.1. Nature Plants, 2015, 1: 15015.

[25] KRUSELL L, MADSEN H L, SATO S, AUBERT G, GENUA A, SZCZYGLOWSKY K, DUC G, KANEKO T. Shoot control of root development and nodulation is mediated by a receptor-like kinase. Nature, 2002, 420: 422-425.

[26] YU L H, MIAO Z Q, QI G F, WU J, CAI X T, MAO J L, XIANG C B. MADS-box transcription factor AGL21 regulates lateral root development and responds to multiple external and physiological signals. Molecular Plant, 2014, 7(11): 1653-1669.

[27] SILVA S W, SEABRA A R, LEITAO J N, CARVALHO H G. Possible role of glutamine synthetase of the prokaryotic type (GSI-like) in nitrogen signaling in Medicago truncatula L. Plant Science, 2015, 240: 98-108.

[28] FUKAKI H, TASAKA M. Hormone interactions lateral foot formation. Plant Molecular Biology, 2009, 69: 437-449.

[29] KROUK G, LACOMBE B, BIELACH A, PERRINE-WALKER F, MALINSKA K, MOUNIER E, HOYEROVA K, TILLARD P, LEON S, LJUNG K, ZAZIMALOVA E, BENKOVA E, NACRY P, GOJON A. Nitrate-regulated auxin transport by NRT1.1 defines a mechanism for nutrient sensing in plants. Developmental Cell, 2010, 18(6): 927-937.

[30] GRUBER B D, GIEHL R F, FRIEDEL S, WIRéN N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Journal, 2013, 163(1): 161-179.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Molecular Basis of the Effects of Nitrate Signal on Root Morphological Structure Changes of Chrysanthemum

GUO YunHui, YU YuanYuan, WEN LiZhu, SUN CuiHui, SUN XianZhi, WANG WenLi, SUN Xia, ZHENG ChengShu
(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/Chrysanthemum Research Center of China, Japan and Korea in Shandong Province, Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】 In order to reveal the root morphology and molecular basis of the response of nitrate nitrogen to root development of chrysanthemum, and provide a basis for chrysanthemum breeding to improve the efficiency of nitrogen, this study was carried to investigate the changes of root morphology and structure, the contents of nitrate nitrogen and endogenous hormones,the nitrate nitrogen transport genes and root formation gene of chrysanthemum. 【Method】 The rooted cuttings of chrysanthemum were used in water-culture system in this experiment, then treated by 10 mmol·L-1KNO3while control was treated with Hogland nutrient solution without nitrogen. On the day 0, 1, 3, 7, 14, 21 and 28 after treatment, anatomical structures were observed, the contents of NO3-, IAA and CTK in the roots and leaves were measured, the cDNA conserved sequence fragments of CmNRT1.1, CmNRT2.1, CmNAR2.1 which were identified as the NO3-transport protein genes and CmANR1 which were identified as the lateral root differentiation gene of the roots were cloned, and the relative expression levels of them were observed using quantitative real-time PCR. 【Result】The results showed that: There were no significant differences were observed in the overall length, average diameter, total surface area and total volume of roots between NO3-treatment and control within the first 3 days, they were increased significantly after 7 days compared with those of control. The cross sections of roots were also observed on the day 28 after treatments. The vascular bundle diameter of the 1st root, 2nd root and 3rd root after NO3-treatments were increased significantly compared with those of control. The ratios of vascular bundle to root diameter of the 1st root, 2nd root and 3rd root were significantly increased compared with those of controls. The NO3-contents of chrysanthemum reached the peak on the day 7 (0.45 mg·g-1FW) in the roots and on the day 14 (0.35 mg·g-1FW) in the leaves, respectively, then both of them decreased slightly, but they were maintained higher level compared with those of control on all days. Compared with those of control, the contents of IAA and CTK in roots and leaves in the NO3-treatments were significantly increased. The peaks of the contents of IAA and CTK in the roots appeared on the day 7 and those of in the leaves appeared on the 14 day after treatments, while the IAA and CTK contents of controls showed no significant change. The relative expression levels of CmNRT1.1 gene’s peak were appeared on the day 1 after treatment (the control also on the day 1). The relative expression levels of CmNRT2.1 and CmNAR2.1’s peaks were appeared on the day 3 after treatment (the control slightly increased on the day 3 and remained relatively stable). While the relative expression levels of CmANR1 reached the peak on the day 7 after treatment (the control on the day 14), and the relative expression levels of the 4 genes maintained higher levels than those of control throughout the experiment. The results showed that the 4 genes were induced by nitrate, and their expression trends were similar, which were increased at first, decreased later and then remained relatively stable.【Conclusion】 The roots of chrysanthemum could respond to nitrate signal in the growth medium. The response is realized through the expression of nitrate transporter genes and lateral root development gene, and then adjust the configuration of the roots to improve the absorption and utilization of nitrate in chrysanthemum roots.

Chrysanthemum morifolium; root; NO3-; endogenous hormones; gene expression

2016-10-27；接受日期：2017-02-27

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD10B07）

聯(lián)系方式：郭蕓琿，E-mail：2550031106@qq.com。通信作者鄭成淑，Tel：0538-8246139；E-mail：zcs@sdau.edu.cn