韓丹丹，郗彥鳳，白文啟，高 寧，王麗麗

結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA基因突變的一致性分析

韓丹丹1，郗彥鳳2，白文啟2，高 寧2，王麗麗3

目的 探討結(jié)直腸癌原發(fā)灶及相應肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA基因突變及臨床意義。方法 采用實時熒光定量PCR法檢測58例結(jié)直腸癌原發(fā)灶癌組織及相應肝轉(zhuǎn)移灶組織中KRAS、PIK3CA基因突變情況。結(jié)果 結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因的突變率分別為31.03%(18/58)、25.86%(15/58)，最常見的突變位點為G12D；PIK3CA基因的突變率分別為8.62%(5/58)、10.34%(6/58)，最常見的突變位點為E545K。有1例同時發(fā)生KRAS(G12D)、PIK3CA(E545K)基因突變。結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA基因突變的一致性較好。單因素分析顯示：KRAS突變與結(jié)直腸癌原發(fā)灶腫瘤部位、轉(zhuǎn)移灶多少、大體類型相關(guān)(P<0.05)，PIK3CA突變與同時性/異時性肝轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶多少相關(guān)(P<0.05)。多因素Cox回歸模型顯示：同時性/異時性肝轉(zhuǎn)移、KRAS突變狀態(tài)是影響結(jié)直腸癌預后的危險因素。結(jié)直腸癌同時性肝轉(zhuǎn)移比異時性肝轉(zhuǎn)移患者的總生存期延長，KRAS野生型比突變型患者總生存期延長(P<0.05)。結(jié)論 結(jié)直腸癌中KRAS基因G12D位點突變率最高，原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA基因突變一致性較好。原發(fā)灶可以作為分子檢測的標本來源，基于精準醫(yī)療對于靶向治療的選擇，則需再次評估肝轉(zhuǎn)移灶中的基因狀態(tài)，以達到個體化治療。

結(jié)直腸腫瘤；KRAS；PIK3CA；預后

結(jié)直腸癌是一種常見的危害人類健康的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第三位[1]。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的主要原因，改善其生存期最有效的治療手段為肝切除術(shù)聯(lián)合全身治療[2]。KRAS、PIK3CA基因分別是EGFR依賴的RAS/RAF/MAPK和PI3K/PTEN/AKT信號通路中的關(guān)鍵基因，任一基因突變引起信號通路的激活有助于促進細胞增殖，轉(zhuǎn)移和血管生成，抑制細胞凋亡等[3]。隨著靶向治療的進展，檢測KRAS、PIK3CA基因狀態(tài)將作為指導臨床用藥的重要依據(jù)。目前文獻對KRAS、PIK3CA的報道多聚焦于原發(fā)灶，而轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌是一種異質(zhì)性很強的疾病，因此有必要評估肝轉(zhuǎn)移灶的基因狀態(tài)。本實驗采用實時熒光定量PCR法對58例結(jié)直腸癌原發(fā)灶及肝轉(zhuǎn)移灶進行KRAS、PIK3CA基因檢測，分析兩者基因狀態(tài)及臨床意義，探討兩者與結(jié)直腸癌臨床病理特征、患者預后的關(guān)系，為肝轉(zhuǎn)移靶向治療提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2009年～2014年山西省腫瘤醫(yī)院病理科診斷為腺癌的58例結(jié)直腸癌：(1)有相應的肝轉(zhuǎn)移灶石蠟組織；(2)所有患者術(shù)前未接受過放療、化療及生物學治療；(3)患者年齡36～78歲，中位年齡56歲，男性35例，女性23例，位于結(jié)腸39例，直腸19例。

1.2 試劑及儀器 試劑盒均購自廈門艾德生物公司：DNA提取試劑-FFPE樣品DNA分離試劑盒；人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒(P216010701X)；人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒(P215070803Y)；熒光PCR儀器型號為StepOnePlus。

1.3 DNA提取 常規(guī)取4～8張8 μm厚切片，65 ℃烘片，二甲苯脫蠟，無水乙醇洗滌，蒸餾水沖洗。鏡下觀察HE染色片并對照石蠟標本標記出腫瘤細胞富集區(qū)域，將標記出的癌組織刮入Eppendorf管內(nèi)。按FFPE樣品DNA分離試劑盒說明書提取DNA，提取完的DNA立即進行檢測。

1.4 實時熒光定量PCR 設置擴增程序：第一階段95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；第二階段95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個循環(huán)；第三階段93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環(huán)；信號收集：第三階段60 ℃時收集FAM和HEX(或VIC)信號，ABI儀器探針模式設置，Reprter Dye：FAM、VIC；Quencher Dye：TAMRA；Passive Reference：NONE。執(zhí)行實時PCR，保存，分析。

1.5 結(jié)果判斷 確定樣品各個反應管各自的突變Ct值，若樣品中任何一個KRAS、PIK3CA反應孔有明顯FAM信號擴增曲線且Ct值>28或29，則此孔基因位點為突變位點，弱陽性和強陽性視為突變，陰性視為野生。陽性對照管均應有明顯的FAM信號，而陰性對照任一管FAM信號升起則視為實驗失敗。

1.6 生存分析 對58例結(jié)直腸癌患者通過電話及查閱病歷的形式進行隨訪，隨訪自確診之日起，主要觀察總體生存率。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用χ2檢驗和Fisher確切概率法分析KRAS、PIK3CA基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系；同一個體原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶突變情況的一致性檢驗采用配對χ2檢驗；單因素生存分析采用Kaplan-Meier法；多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 KRAS、PIK3CA突變狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 58例結(jié)直腸癌患者原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS突變率分別為31.03 %(18/58)、25.86%(15/58)，PIK3CA突變率分別為8.62%(5/58)、10.34%(6/58)。18例KRAS突變病例中，14例原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶均為G12D突變，1例原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶突變位點不同G12DvsG12V(GGT>GATvsGGT>GTT)，其余3例原發(fā)灶G12D突變，肝轉(zhuǎn)移灶為野生型。6例PIK3CA突變病例中，3例原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶均為E545K(GAG>AAG)突變，1例均為E542(GAA>AAA)突變，1例原發(fā)灶H1047R突變(CAT>CGT)、肝轉(zhuǎn)移灶E545K突變，1例原發(fā)灶野生型、肝轉(zhuǎn)移灶E545K突變。另有1例發(fā)生KRAS、PIK3CA共突變。KRAS基因突變與結(jié)直腸癌原發(fā)灶的腫瘤部位、轉(zhuǎn)移灶多少及大體類型相關(guān)(P<0.05)，PIK3CA基因突變與同時性/異時性肝轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移灶多少相關(guān)(P<0.05)，兩者與患者性別、年齡、腫瘤直徑、轉(zhuǎn)移發(fā)生時間等均無相關(guān)性(P>0.05，表1～3)。

2.2 結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA突變的相關(guān)性 58例結(jié)直腸癌原發(fā)灶中，5例PIK3CA突變型中1例發(fā)生KRAS突變，53例PIK3CA野生型中17例發(fā)生KRAS突變，兩基因表達無相關(guān)性(rs=-0.073，P>0.05)。肝轉(zhuǎn)移灶中，6例PIK3CA突變型中無KRAS突變，58例PIK3CA野生型中15例發(fā)生KRAS突變，兩基因表達無相關(guān)性(rs=0.201，P>0.05)。

2.3 結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA突變的一致性分析 對結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA基因突變情況進行一致性分析，結(jié)果顯示，Kappa值均≥0.75，表明結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶基因突變一致性較好，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表4)。

2.4 預后 58例中54例獲得隨訪結(jié)果，總生存期(overall survival, OS)為1～72個月，中位生存時間為24個月。Kaplan-Meier生存分析顯示，同時性/異時性轉(zhuǎn)移及KRAS突變狀態(tài)對OS有顯著影響(Log-rank檢驗P均<0.05)。異時性比同時性肝轉(zhuǎn)移患者，KRAS基因野生型比突變型OS顯著延長。多因素Cox回歸分析顯示，同時性/異時性肝轉(zhuǎn)移、KRAS突變狀態(tài)是影響預后的危險因素(P<0.05，圖1、2)。

表1 KRAS、PIK3CA基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖1 結(jié)直腸癌中KRAS突變型與野生型患者總生存曲線圖

圖2 結(jié)直腸癌中同時性/異時性肝轉(zhuǎn)移患者總生存曲線圖

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是機體一系列內(nèi)外因素共同作用的結(jié)果，多數(shù)患者確診時已是晚期，治療效果和生存率不甚樂觀。近年來，針對EGFR的靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗為KRAS野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者帶來了一線曙光。35%～40%轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌KRAS突變引起EGFR依賴的核內(nèi)信號通路活化，導致患者對靶向治療無效。治療無效的原因除與PI3K途徑中PIK3CA突變有關(guān)外，還可能與原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶間高水平瘤內(nèi)、瘤間基因的異質(zhì)性有關(guān)。腫瘤原發(fā)灶本身具有多項分化潛能，相應的肝轉(zhuǎn)移灶也必然有基因型的改變，所以有待對其進行分析。

表2 18例結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變情況

wt為野生型

表3 6例結(jié)直腸癌患者PIK3CA基因突變情況

wt為野生型

表4 結(jié)直腸癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA基因狀態(tài)的一致性分析

本組實驗結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因的突變率分別為31.03%、25.86%，與文獻報道19%～44%的突變率一致[4-6]。18例KRAS突變病例中，其中1例原發(fā)灶發(fā)生G12D突變，肝轉(zhuǎn)移灶發(fā)生G12V突變，14例原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶均發(fā)生G12D突變，突變一致率為83.33%(15/18)，這與既往報道結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶較高的一致性且主要突變位點為G12D相符[6-7]。原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶KRAS基因突變不一致的3例患者中原發(fā)灶發(fā)生G12D突變，肝轉(zhuǎn)移灶未檢測到任何突變，突變不一致率為16.67%(3/18)。由此可見，原發(fā)灶比肝轉(zhuǎn)移灶KRAS突變率高，總體保持較高水平的一致性。KRAS基因可能發(fā)生在癌癥進展的早期階段，并參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。生存分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者KRAS野生型比突變型OS延長，差異有統(tǒng)計學意義，提示KRAS基因狀態(tài)可能是影響結(jié)直腸癌患者預后的重要指標。本實驗結(jié)果顯示KRAS突變好發(fā)于潰瘍型結(jié)腸癌，與原發(fā)灶的腫瘤部位差異有統(tǒng)計學意義，與Nam等[8]報道的結(jié)果一致。KRAS突變還與轉(zhuǎn)移灶多少相關(guān)，與患者年齡、分化程度、TNM分期等臨床病理特征無關(guān)。

PIK3CA是PI3K/PTEN/AKT通路的關(guān)鍵基因，約4/5突變發(fā)生在exon9和exon20。PIK3CA突變存在于人體多種腫瘤中，突變率為9.9%～32%[5]。PIK3CA突變對生存率的影響將依賴KRAS的突變狀態(tài)，但KRAS并不是預測EGFR療效的獨立因素[9]。本組實驗結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中PIK3CA基因的突變率分別為8.62%、10.34%，6例發(fā)生PIK3CA突變的結(jié)直腸癌，3例原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶均發(fā)生E545K突變，1例原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶均發(fā)生E542K突變，突變一致率為66.67%(4/6)。Lee等[10]對比研究了結(jié)直腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間的PIK3CA基因型，發(fā)現(xiàn)約半數(shù)有相同的克隆來源，其余則顯示出基因型的差異，強調(diào)需單獨評估轉(zhuǎn)移病灶來指導治療。本組實驗有1例發(fā)生KRAS、PIK3CA共突變，主要突變位點分別是G12D、E545K。1例原發(fā)灶發(fā)生PIK3CA基因E545K突變，肝轉(zhuǎn)移灶發(fā)生H1047R突變。KRAS與PIK3CA基因共突變，exon9和exon20協(xié)同突變可能更易形成肝轉(zhuǎn)移，但由于病例較少，缺乏有效的證據(jù)。文獻報道PIK3CA基因exon9和exon20協(xié)同突變可賦予腫瘤更強的侵襲性，同時發(fā)生KRAS、PIK3CA突變者，易發(fā)生西妥昔單抗耐藥，且可能與肝轉(zhuǎn)移的形成有關(guān)[7,11]。本組實驗PIK3CA突變與轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目、轉(zhuǎn)移灶多少均相關(guān)，提示其突變可能與肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)。肝轉(zhuǎn)移灶PIK3CA突變率比原發(fā)灶高，可能與PIK3CA基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展的后期起作用有關(guān)。生存分析顯示同時性/異時性肝轉(zhuǎn)移及KRAS突變對結(jié)直腸癌患者OS有顯著影響，是影響預后的危險因素。

文獻報道對結(jié)直腸癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶KRAS、PIK3CA基因突變一致性存在爭議。He等[12]的結(jié)果指出結(jié)直腸癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS突變一致性較高，結(jié)直腸癌異時切除比同時切除PIK3CA突變率高，強調(diào)需要二次評估轉(zhuǎn)移灶。Mao等[13]則認為原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA保持高度一致。Voutsina等[14]認為轉(zhuǎn)移灶對于靶向治療的選擇更具有指導意義。本組實驗數(shù)據(jù)顯示結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶間KRAS、PIK3CA雖然存在一定程度基因型差異，但總體一致性較好，兩者均可用于臨床指導靶向治療的組織來源。本實驗由于樣本量小，KRAS、PIK3CA之間的關(guān)系尚未有確切的結(jié)論，有待進一步擴大樣本研究來證實。MSI和BRAF在Lynch綜合征分類中扮演著重要的角色已經(jīng)應用于臨床，PIK3CA突變可作為阿司匹林輔助治療結(jié)直腸癌的預測分子標志物[15]。

綜上，本組實驗提示結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS、PIK3CA基因突變一致性較好，原發(fā)灶即可作為分子檢測的標本來源。但靶向治療針對的是轉(zhuǎn)移灶，因此在可獲取轉(zhuǎn)移灶的情況下，需同時對轉(zhuǎn)移灶進行評估，為臨床精準靶向治療提供可靠依據(jù)。我們相信分子靶向治療將成為未來指導異質(zhì)性腫瘤有潛力的治療方案。

[1] Siegel R, Ma J, Zou Z,etal. Cancer statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014,64(1):9-29.

[2] Kopetz S, Chang G J, Overman M J,etal. Improved survival in metastatic colorectal cancer is associated with adoption of hepatic resection and improved chemotherapy[J]. J Clin Oncol, 2009,27(22):3677-3683.

[3] Normanno N, Tejpar S, Morgillo F,etal. Implications for KRAS status and EGFR-targeted therapies in metastatic CRC[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2009,6(9):519-527.

[4] Baldus S E, Schaefer K L, Engers R,etal. Prevalence and heterogeneity of KRAS, BRAF, and PIK3CA mutations in primary colorectal adenocarcinomas and their corresponding metastases[J]. Clin Cancer Res, 2010,16(3):790-799.

[5] Janku F, Lee J J, Tsimberidou A M,etal. PIK3CA mutations frequently coexist with RAS and BRAF mutations in patients with advanced cancers[J]. PLoS One, 2011,6(7):e22769.

[6] 謝 玲, 陳 劼, 孫 怡, 等. 中國結(jié)直腸癌、肺癌和胃癌患者KRAS基因突變情況分析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2016,32(2):210-213.

[7] Hsu H C, Thiam T K, Lu Y J,etal. Mutations of KRAS/NRAS/BRAF predict cetuximab resistance in metastatic colorectal cancer patients[J]. Oncotarget, 2016,7(16):22257-22270.

[8] Nam S K, Yun S, Koh J,etal. BRAF, PIK3CA, and HER2 oncogenic alterations according to KRAS mutation status in advanced colorectal cancers with distant metastasis[J]. PLoS One, 2016,11(3):e0151865.

[9] Ogino S, Nosho K, Kirkner G J,etal. PIK3CA mutation is associated with poor prognosis among patients with curatively resected colon cancer[J]. J Clin Oncol, 2009,27(9):1477-1484.

[10] Lee S Y, Haq F, Kim D,etal. Comparative genomic analysis of primary and synchronous metastatic colorectal cancers[J]. PLoS One, 2014,9(3):e90459.

[11] Liao X, Morikawa T, Lochhead P,etal. Prognostic role of PIK3CA mutation in colorectal cancer: cohort study and literature review[J]. Clin Cancer Res, 2012,18(8):2257-2268.

[12] He Q, Xu Q, Wu W,etal. Comparison of KRAS and PIK3CA gene status between primary tumors and paired metastases in colorectal cancer[J]. Onco Targets Ther, 2016,9:2329-2235.

[13] Mao C, Wu X Y, Yang Z Y,etal. Concordant analysis of KRAS, BRAF, PIK3CA mutations, and PTEN expression between primary colorectal cancer and matched metastases[J]. Sci Rep, 2015,5:8065.

[14] Voutsina A, Tzardi M, Kalikaki A,etal. Combined analysis of KRAS and PIK3CA mutations, MET and PTEN expression in primary tumors and corresponding metastases in colorectal cancer[J]. Mod Pathol, 2013,26(2):302-313.

[15] Liao X, Lochhead P, Nishihara R,etal. Aspirin use, tumor PIK3CA mutation, and colorectal-cancer survival[J]. N Engl J Med, 2012,367(17):1596-1606.

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Correlation of KRAS and PIK3CA gene status between primary tumors and paired metastases in colorectal cancer

HAN Dan-dan1, XI Yan-feng2, BAI Wen-qi2, GAO Ning2, WANG Li-li3
(1GraduateSchoolofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofPathology,ShanxiCancerHospital,Taiyuan030013,China;3DepartmentofEndocrinology,ShanxiProvinceFenyangHospital,Fenyang032200,China)

Purpose To investigate the mutation status of KRAS and PIK3CA gene in colorectal cancer (CRC) primary lesions and corresponding liver metastasis and its clinical significance. Methods The gene mutations of KRAS and PIK3CA were detected in 58 cases of primary lesions of CRC and corresponding liver metastasis tissue by real-time PCR. Results The mutation rates of KRAS were 31.03% (18/58) and 25.86% (15/58) in primary lesions of CRC and corresponding liver metastasis tissue, respectively, in which G12D was most commonly detected. The mutation rates of PIK3CA were 8.62% (5/58) and 10.34%(6/58)respectively, in which the most common mutation site was E545K. Only one case carried simultaneously both mutations of KRAS (G12D) and PIK3CA (E545K). The mutation of KRAS and PIK3CA had a good consistency between primary lesions and liver metastasis. Univariate analysis showed that the mutation of KRAS was related to the primary lesion of tumor location, the quantity of metastasis and the types of tumor (P<0.05), PIK3CA mutation was associated with the synchronous/metachronous liver metastasis and the quantity of metastasis (P<0.05). Multivariate Cox regression analysis showed that synchronous/metachronous liver metastasis and the mutation of KRAS were influencing factors for prognosis of CRC. The overall survival of patients with CRC who had simultaneous liver metastases was longer than those with heterotopic liver metastases; the overall survival of KRAS wild-type mutant patients was longer than those of mutant patients(P<0.05). Conclusion The G12D site of KRAS gene has the highest mutation frequency in CRC, KRAS/PIK3CA mutation has a good consistency of the primary lesions of CRC and corresponding liver metastasis. Primary lesions can be as the source of molecular detection. To achieve individualized treatment, we need to reassess the genetic status of metastasis based on the choice of targeted therapy for precision medicine.

colorectal neoplasms; KRAS; PIK3CA; prognosis

山西省科技廳重點研發(fā)項目(201603D321049)、山西省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題(2014052)

1山西醫(yī)科大學研究生院，太原 0300012山西省腫瘤醫(yī)院病理科，太原 0300133山西省汾陽醫(yī)院內(nèi)分泌科，汾陽 032200

韓丹丹，女，碩士研究生。E-mail: hdd0713mails@163.com 郗彥鳳，女，碩士生導師，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: xyf609@sohu.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.004.html

R 735.3

A

1001-7399(2017)04-0369-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.004

接受日期：2017-03-07