林興滔，葛 巖，王慧玲，豆文憲，朱小蘭

冷凍切片干燥處理對HE染色效果的影響

林興滔1，葛 巖1，王慧玲2，豆文憲1，朱小蘭1

HE染色；冷凍切片；固定液，干燥

冷凍切片是術(shù)中快速提供病理診斷和觀察組織細胞有效成分的一種重要的手段，在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，再進行切片染色的快速制片。在制片的過程中，臨床快速診斷的組織除了需要防冰晶形成外，筆者在實際工作中注意到不同的固定液及不同的處理方案對冷凍制片HE染色質(zhì)量同樣會帶來影響，現(xiàn)分析總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取廣東省人民醫(yī)院病理科2016年5月～6月手術(shù)送檢的冷凍標(biāo)本50例，包括正常結(jié)腸、肺癌、支氣管切緣、乳腺癌、卵巢、子宮肌瘤、甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。

1.2 儀器 英國Shandon Cryotome PSE自動恒溫冷凍切片機，F(xiàn)eather N35一次性刀片，櫻花OCT包埋劑，冷熱電吹風(fēng)筒(1 000 W)

1.3 試劑配制 Lillie-Mayer蘇木精[1]：燒瓶盛700 mL蒸餾水置于電爐上，加入50 g硫酸鋁鉀，待完全溶解加入5 g蘇木精，加熱至80 ℃加入碘酸鈉0.5 g，持續(xù)均勻攪拌，沸騰3～5 min，放置室溫冷卻至60 ℃加入丙三醇300 mL，室溫過夜，次日加入冰醋酸20 mL。水溶性伊紅：10 g水溶性伊紅加入溶解了10 g無水氯化鈣的1 000 mL蒸餾水中，反復(fù)搖勻溶解后使用。

1.4 方法 將樣本支持器平穩(wěn)放置在速凍臺上，滴加少許OCT包埋劑讓其硬化，然后將規(guī)范取材的術(shù)中冷凍組織放在其表面，用OCT包埋膠完全包裹，組織變硬后即可切片，6～8 μm厚。(1)比較4種固定液的固定效果：冷凍標(biāo)本連續(xù)切4張，分別于10%中性緩沖福爾馬林、冷甲醇、冷丙酮和95%冷乙醇中固定30 s，取出水洗，蘇木精染色45 s，水洗，0.5%碳酸鋰返藍，水洗，復(fù)染伊紅5 s，常規(guī)脫水透明封片。(2)繼續(xù)將冷凍標(biāo)本連續(xù)切片2張，經(jīng)最佳固定液固定后，用冷熱電吹風(fēng)筒分別進行吹風(fēng)干燥，常規(guī)水洗，染色制片，觀察冷熱干燥對冷凍切片的影響。

2 結(jié)果

2.1 4種固定液固定后冷凍切片HE染色結(jié)果比較 10%中性緩沖福爾馬林和冷丙酮固定冷凍切片組織細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)清晰度欠佳，核膜不清，染色質(zhì)松散，核質(zhì)染色對比不明顯；冷甲醇固定冷凍切片組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細胞及胞核收縮不明顯，核質(zhì)染色對比良好、層次分明。95%冷乙醇固定冷凍切片比較甲醇固定，細胞、胞核收縮較明顯，染色質(zhì)不清晰，伊紅著色差，核質(zhì)染色對比不佳(表1，圖1)。

2.2 冷凍切片不同干燥處理后鏡下觀察 選取冷甲醇作為常規(guī)冷凍切片固定液，比較未干燥處理冷凍切片HE染色，熱風(fēng)干燥容易導(dǎo)致組織細胞及胞核收縮，染色質(zhì)縮聚(圖2)。對于4例支氣管切緣組織，熱風(fēng)干燥組未發(fā)生脫片、冷風(fēng)干燥組與未干燥組分別有1例和3例出現(xiàn)脫片。熱風(fēng)干燥較未干燥處理軟骨組織少脫片，冷風(fēng)干燥冷凍切片HE染色光鏡下染色效果與未干燥相同，同時亦較少發(fā)生脫片；對于其余類型組織，3種干燥處理的冷凍切片均未發(fā)生脫片。

①A①B①C①D②A②B

圖1 4種固定液固定后浸潤性乳腺癌冷凍切片HE染色比較：A.10%中性緩沖福爾馬林固定的冷凍切片；B.冷丙酮固定的冷凍切片；C.95%冷乙醇固定的冷凍切片；D.冷甲醇固定的冷凍切片 圖2 冷凍切片不同干燥處理后HE染色比較：A.熱風(fēng)干燥處理冷凍切片；B.冷風(fēng)干燥處理冷凍切片

3 討論

固定的主要目的是保持組織細胞形態(tài)特征清晰和穩(wěn)定，作為臨床病理快速診斷的重要環(huán)節(jié)，冷凍切片需要選擇合適的固定液，才能最大限度地縮小其與石蠟切片的差異性[2]。

甲醛固定組織是一個滲透、結(jié)合和交聯(lián)的過程[3]，其產(chǎn)生交聯(lián)的速度要遠遠比滲透慢，所以甲醛的固定冷凍切片的時間較長，需要10 min以上，影響冷凍切片快速病理診斷結(jié)果的報告。甲醇、乙醇和丙酮均屬于常見凝固固定劑，丙酮對細胞核的固定不佳，乙醇雖然可以沉淀核蛋白，但是沉淀后的核蛋白溶于水，光鏡下核染色不良。甲醇對組織的滲透性強，收縮力略小于乙醇，冷凍切片HE染色細胞及胞核收縮不明顯，染色質(zhì)清晰，核質(zhì)對比良好。我們通常先將冷凍切片制片的甲醇固定液置于冷凍切片機中預(yù)冷，常溫甲醇容易導(dǎo)致組織細胞出現(xiàn)腫脹，固定不佳。

冷凍切片在制片的過程中如果出現(xiàn)脫片情況，往往會影響病理診斷的真實性和報告的及時發(fā)出。為防止脫片，我們經(jīng)常會使用電熱吹風(fēng)筒對固定好的組織切片進行干燥處理，本實驗比較干燥和未干燥處理的冷凍切片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)冷風(fēng)干燥可以有效的減少富含纖維、軟骨或壞死的組織冷凍切片的脫片現(xiàn)象。馮家成等[4]曾報道熱風(fēng)干燥雖然同樣可以減少冷凍切片脫片，但易導(dǎo)致組織細胞及胞核收縮，染色質(zhì)縮聚，影響術(shù)中快速臨床病理診斷。

總之，很多因素影響冷凍切片的制片質(zhì)量，繼而影響術(shù)中快速病理診斷結(jié)果的報告，選擇合適的冷凍切片固定液是一項重要的制片環(huán)節(jié)。冷甲醇固定液配置簡單、方便、固定效果良好，可以作為較理想的選擇。病理技術(shù)人員在進行冷凍切片制片時，對送檢的組織需要有所認識，面對富含纖維組織、軟骨或壞死的組織可以選擇冷風(fēng)干燥處理，減少脫片現(xiàn)象，及時提供良好的冷凍切片，以服務(wù)于術(shù)中快速病理診斷。

[1] 張 威, 駱新蘭, 朱小蘭, 等. Lillie-Mayer蘇木素在冷凍切片快速進行性染色中應(yīng)用[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2008,24(1):114-115.

[2] 孫麗萍. 五種不同固定液對冷凍切片染色質(zhì)量的影響[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學(xué), 2011,29(1):95.

[3] 王伯沄, 李玉松, 黃高昇, 等. 病理學(xué)技術(shù)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2000:67.

[4] 馮家成, 楊 靜, 張柏輝, 等. 三種不同固定液和固定方法對腦組織冷凍切片的影響[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2015,31(5):593-594.

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廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病理醫(yī)學(xué)部1病理科、2普通外科，廣州 510000

林興滔，男，主管技師。E-mail: lingxingtao@126.com 朱小蘭，女，副主任技師，通訊作者。E-mail: zxlllp@163.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.030.html

R 329-33

B

1001-7399(2017)04-0463-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.030

接受日期：2016-12-24