趙 巖，孫 健，吳 影，王志強(qiáng)

結(jié)直腸癌中Survivin、Caspase 9和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性及臨床意義

趙 巖1，孫 健2，吳 影3，王志強(qiáng)1

目的 探討Survivin、Caspase 9和Ki-67三種腫瘤相關(guān)因子在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相關(guān)性。方法 采用免疫組化EliVision法檢測(cè)50例結(jié)直腸癌、30例結(jié)直腸腺瘤和30例癌旁正常組織中Survivin、Caspase 9和Ki-67的表達(dá)，并分析三者與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 Survivin和Ki-67在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性率高于結(jié)直腸腺瘤和癌旁正常組織；而Caspase 9陽(yáng)性率低于結(jié)直腸腺瘤和癌旁正常組織。Survivin與Caspase 9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)；Caspase 9與Ki-67的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Survivin、Ki-67、Caspase 9的表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 Survivin可能通過(guò)抑制Caspase 9的激活，使細(xì)胞不能進(jìn)行有效凋亡并異常增殖，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。聯(lián)合檢測(cè)有助于了解結(jié)直腸腫瘤的生物學(xué)行為并對(duì)患者早期診斷、預(yù)后判斷及干預(yù)治療提供分子生物學(xué)支持。

結(jié)直腸腫瘤；Survivin；Caspase 9；Ki-67；免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌是發(fā)生在結(jié)直腸黏膜上皮和腺體的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌和直腸癌。隨著動(dòng)物高蛋白在人們飲食結(jié)構(gòu)中的比重增加，我國(guó)結(jié)直腸癌患者數(shù)量逐年遞增?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞異常增殖、異常分化及細(xì)胞凋亡障礙密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡機(jī)制異常是惡性腫瘤發(fā)生的重要原因之一，因此研究細(xì)胞凋亡與腫瘤的關(guān)系，已經(jīng)成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。Survivin、Caspase 9的表達(dá)均與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且兩者在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面存在關(guān)聯(lián)。Ki-67是反映細(xì)胞增殖的重要生物學(xué)指標(biāo)。本文采用免疫組化法檢測(cè)Survivin、Caspase 9和Ki-67在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)并分析三者表達(dá)的相關(guān)性，希望從分子水平更深入了解結(jié)直腸癌的生物學(xué)發(fā)生機(jī)制，探討它們與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和Dukes分期等臨床病理因素的關(guān)系，為患者早期診斷、干預(yù)治療和判斷預(yù)后提供分子生物學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2014年9月～2016年7月牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院病理科存檔的結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本50例，所有標(biāo)本相關(guān)臨床資料完整，患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。其中男性32例，女性18例，年齡29～84歲，平均61.98歲，中位年齡61歲；高分化腺癌11例，中分化腺癌26例，低分化腺癌13例；根據(jù)Dukes分期：A+B期27例，C+D期23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例。取同時(shí)期30例結(jié)直腸腺瘤手術(shù)存檔蠟塊和30例癌旁>5 cm正常結(jié)直腸組織病理蠟塊作為對(duì)照。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人Survivin多克隆抗體和鼠抗人Ki-67核抗原單克隆抗體均購(gòu)自福州邁新公司。兔抗人Caspase 9多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。DAB顯色試劑盒和免疫組化EliVision Super/HRP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。使用儀器有顯微鏡、切片機(jī)、烤箱、染色缸、孵育盒、高壓鍋。

1.3 方法 免疫組化染色采用EliVision法，取存檔的組織蠟塊，行HE和免疫組化染色。用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法分別獨(dú)立閱片。在光鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色細(xì)顆粒狀。Caspase 9定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，Ki-67定位于細(xì)胞核，Survivin定位表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)國(guó)內(nèi)常用標(biāo)準(zhǔn)，即腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)及其染色反應(yīng)的強(qiáng)度進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度：無(wú)陽(yáng)性著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。采用高倍視野隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞所占的比例，定位5級(jí)，未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：4～7分為陽(yáng)性，0～3分為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件分別對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；兩變量間關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、Caspase 9和Ki-67在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)(表1) Survivin蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核(圖1)。Survivin在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性率明顯高于結(jié)直腸腺瘤和正常結(jié)直腸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Caspase 9主要定位于細(xì)胞質(zhì)，胞核也有表達(dá)，呈棕黃色灶性或彌漫性分布(圖2)。Caspase 9在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性率低于結(jié)直腸腺瘤和正常結(jié)直腸組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ki-67定位于細(xì)胞核(圖3)，Ki-67在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性率高于結(jié)直腸腺瘤和正常結(jié)直腸組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 結(jié)直腸癌中Survivin、Caspase 9和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)直腸癌中Survivin和Caspase 9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.362，P=0.010，表2)。Survivin和Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.398，P=0.004，表3)。Caspase 9與Ki-67的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.400，P=0.004，表4)。

2.3 Survivin、Caspase 9和Ki-67蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系 Survivin、Caspase 9和Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小和浸潤(rùn)深度無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。Survivin、Caspase 9和Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表5)。

表2 結(jié)直腸癌中Survivin和Caspase 9表達(dá)的相關(guān)性

r=-0.362,P=0.010

表3 結(jié)直腸癌中Survivin和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

r=0.398,P=0.004

表4 結(jié)直腸癌中Caspase 9和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

r=-0.400,P=0.004

表1 Survivin、Caspase 9、Ki-67在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤和癌旁正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)

與結(jié)直腸腺瘤組相比，△P<0.05；與正常結(jié)直腸組相比，☆P<0.05；與結(jié)直腸癌組相比，*P<0.05

ABC

圖1 Survivin在結(jié)直腸癌(A)、結(jié)直腸腺瘤(B)和癌旁正常組織(C)中的表達(dá)，EliVision法

圖2 Caspase 9在結(jié)直腸癌(A)、結(jié)直腸腺瘤(B)和癌旁正常組織(C)中的表達(dá)，EliVision法 圖3 Ki-67在結(jié)直腸癌(A)、結(jié)直腸腺瘤(B)和癌旁正常組織(C)中的表達(dá)，EliVision法

表5 Survivin、Caspase 9、Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

3 討論

Survivin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族的重要成員，是一個(gè)凋亡抑制劑。Survivin的表達(dá)廣泛參與細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、血管生長(zhǎng)，以及腫瘤免疫調(diào)節(jié)[1]。Survivin表達(dá)于各型胚胎組織，并在一些有高增殖活性的正常組織中表達(dá)，而在成熟的正常組織中幾乎不表達(dá)[2]。研究表明，在很多惡性腫瘤中，如胃癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和肺癌[3-7]均發(fā)現(xiàn)Survivin高表達(dá)。Survivin可通過(guò)多種途徑干擾多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其中就有干擾Caspase家族的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路。Caspase 9所在的Caspase家族通過(guò)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)控制細(xì)胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展。在級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游Caspase 9等能在其它蛋白輔助下發(fā)生自我活化并識(shí)別和激活下游Caspase，作為凋亡執(zhí)行者誘發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Survivin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯高于結(jié)直腸腺瘤和癌旁正常組織(P<0.05)，這與張偉興等[9]的結(jié)果一致。Survivin表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P>0.05)，與結(jié)直腸癌分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期有關(guān)(P<0.05)。本組實(shí)驗(yàn)中，Survivin在結(jié)直腸癌、腺瘤及正常組織中的表達(dá)是逐漸降低的，而在結(jié)直腸癌中，隨著腫瘤惡性程度和病情進(jìn)展的加深，Survivin的表達(dá)逐漸升高，這表明Survivin的表達(dá)一定程度反映了結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展情況，因此，Survivin在臨床上具有潛在應(yīng)用價(jià)值，可以作為一個(gè)分子標(biāo)志物對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行診斷及判斷預(yù)后。Caspase 9在癌旁正常組織中的表達(dá)明顯高于結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中表達(dá)(P<0.05)，這與東星等[10]的研究結(jié)果一致。Caspase 9與結(jié)直腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期有關(guān)(P<0.05)。其在高分化腸癌中的表達(dá)明顯強(qiáng)于中低分化的結(jié)直腸癌組織，隨著Caspase 9的表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡受到抑制，組織分化程度越低，提示Caspase 9在一定程度上參與腫瘤組織的分化。通過(guò)Spearman相關(guān)性分析得出Survivin與Caspase 9存在相關(guān)性，驗(yàn)證了Survivin可通過(guò)干擾Caspase 9的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡作用。Caspase 9亦可作為應(yīng)用于臨床的生物分子指標(biāo)評(píng)估結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。Ki-67是細(xì)胞增殖的抗原標(biāo)志物，其增殖指數(shù)越高，說(shuō)明細(xì)胞增生越旺盛。在臨床病理中，Ki-67常用來(lái)反映腫瘤的惡性程度，評(píng)估患者的預(yù)后及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移狀況。Ki-67在本實(shí)驗(yàn)中與Survivin表達(dá)呈正相關(guān)，與Caspase 9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，結(jié)合之前Survivin與Caspase 9呈負(fù)相關(guān)，表明Survivin高表達(dá)的結(jié)直腸癌組織其細(xì)胞凋亡受抑制，細(xì)胞過(guò)度增殖，惡性程度高，預(yù)后差；Caspase 9高表達(dá)的結(jié)直腸癌組織其細(xì)胞大量凋亡，增殖活力弱，預(yù)后良好。Ki-67可能與Survivin在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中表現(xiàn)為協(xié)同關(guān)系，而與Caspase 9為拮抗關(guān)系，這還需要更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證與研究。本實(shí)驗(yàn)中Ki-67與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期有關(guān)(P<0.05)。表明Ki-67表達(dá)越強(qiáng)，癌細(xì)胞增殖活力越旺盛，腫瘤惡性程度越高，越易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。Ki-67在評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后方面亦具有重要參考價(jià)值。

眾所周知，幾乎所有的癌癥均會(huì)有一個(gè)癌前病變過(guò)程，但并非所有癌前病變均會(huì)發(fā)展成癌，這也是尋找可靠腫瘤標(biāo)志物的意義所在。隨著分子靶向治療的發(fā)展，尋找腫瘤新的靶點(diǎn)也是科研工作者研究的方向。聯(lián)合檢測(cè)Survivin、Caspase 9和Ki-67可提高對(duì)結(jié)直腸癌診斷及判斷預(yù)后的準(zhǔn)確性，作為結(jié)直腸癌靶向治療的靶點(diǎn)，也會(huì)為結(jié)直腸癌的綜合治療翻開(kāi)嶄新的篇章。

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黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(2014YJSCX-20)、牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(ZSSD201620)

1牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院腫瘤科、3病理科，牡丹江 1570112牡丹江醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)教研室，牡丹江 157011

趙 巖，男，碩士研究生。E-mail: 373433006@qq.com 王志強(qiáng)，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: zqwang56@126.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

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1001-7399(2017)04-0435-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.019

R 735.3

A

接受日期：2017-02-16