王素敏，王浩聯(lián)，何倩倩，李東穎，張金平，李建生

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052

BANCR在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

王素敏，王浩聯(lián)，何倩倩，李東穎，張金平，李建生

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052

目的 研究食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)患者癌組織中BANCR的表達(dá)及其與臨床病理和預(yù)后的關(guān)系。方法 應(yīng)用熒光實時定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)檢測BANCR在92例ESCC癌組織和癌旁組織中的表達(dá),分析BANCR表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 BANCR 在67.4%(62/92)的ESCC患者癌組織中高表達(dá)，其相對表達(dá)量為2.046±0.160，癌旁組織相對表達(dá)量為0.447±0.694，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；BANCR的高表達(dá)與腫瘤的TNM分期(P=0.015)、腫瘤大小(P=0.022)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.032)有關(guān)；與年齡、性別、腫瘤部位、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等無關(guān)；BANCR高表達(dá)組無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期(OS)均較BANCR低表達(dá)組縮短(PFS，P=0.006；OS，P=0.040)。結(jié)論 BANCR在ESCC組織中高表達(dá)，BANCR的異常表達(dá)與腫留大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，BANCR表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差，提示其可能參與ESCC的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。

長鏈非編碼RNA；BANCR；食管鱗狀細(xì)胞癌；TNM分期；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；預(yù)后

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì), 轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA分子，以前認(rèn)為其是轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物,其作用價值未得到研究人員重視[1]。目前越來越多研究表明，lncRNA通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、染色質(zhì)修飾和核-細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運等生物過程[2]，從而參與到疾病的發(fā)生、發(fā)展機制中。BNACR是位于9號染色體長度為693 bp的lncRNA，最先被發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤中并調(diào)節(jié)其侵襲能力，相繼證實BANCR參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肺癌、胃癌、肝癌和腸癌的發(fā)生和發(fā)展[5-8]。然而，BANCR在食管癌發(fā)生、發(fā)展中是否起到調(diào)控作用尚不明確，本試驗旨在研究BANCR在92例食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者中的表達(dá)情況，并探討其與ESCC臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年2月-2011年4月行手術(shù)切除的92例ESCC癌組織，術(shù)前未經(jīng)放療、化療及其他輔助治療，術(shù)后經(jīng)病理科證實；對照組選取同一患者的癌旁組織(距手術(shù)切緣至少3 cm)，術(shù)后病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。所有標(biāo)本取下后, 立即放入液氮中后轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ脒x對象術(shù)后均電話隨訪，隨訪起點為病理確診日期，末次隨訪時間為2016年4月30日，無失訪病例。腫瘤分化程度依據(jù)Edmondson-Steiner分級標(biāo)準(zhǔn)來確定, 腫瘤分期按美國腫瘤研究聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)2010發(fā)布的第七版分期系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)確定，同時收集各標(biāo)本的臨床病理資料，此研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒由大連TaKaRa公司提供。熒光實時定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)試劑盒購自美國Roch公司。BANCR引物、β-actin引物用Premier 5.0軟件設(shè)計并由上海英濰捷基生物工程有限公司合成。qRT-PCR引物序列如下： BANCR：(Forward)5′-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3′；(Reverse)5′-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3′； GAPDH：(Forward) 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′； (Reverse) 5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′。

1.3 方法 采用TRLzol一步法抽提ESCC癌組織及癌旁組織的總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA產(chǎn)物，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。qRT-PCR按照SYBR Green說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。根據(jù)公式2-ΔΔCt計算BANCR在ESCC組織中的相對表達(dá)量。

為了驗證BANCR與ESCC臨床病理特征是否相關(guān)，本試驗根據(jù)ESCC癌組織BANCR表達(dá)水平的均值為臨界值，將試驗組分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并研究其表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。為了探討B(tài)ANCR異常表達(dá)與預(yù)后是否相關(guān)，本研究根據(jù)BANCR的表達(dá)高低將ESCC患者分為兩組：BANCR高表達(dá)組(n=62)和BANCR低表達(dá)組(n=30)，并通過Kaplan-Meier生存分析來評估BANCR表達(dá)水平和患者總生存期(OS)、無進(jìn)展生存期(PFS)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以上實驗中每個樣本組織均重復(fù)實驗3次。采用χ2檢驗或者四格表Fisher 精確檢驗比較BANCR在各腫瘤組織和對應(yīng)癌旁組織中的陽性率，并分析其與主要臨床病理特征的關(guān)系；Kaplan-Meier生存分析法分析BANCR高表達(dá)和低表達(dá)ESCC患者的PFS和OS的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BANCR在ESCC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異 92例ESCC癌組織BANCR相對表達(dá)量為2.046±0.160，癌旁組織相對表達(dá)量為0.447±0.694，BANCR在ESCC患者癌組織較癌旁組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

圖1 ESCC癌組織與癌旁組織BANCR表達(dá)水平

Fig 1 The expressions of BANCR in ESCC tissues and adjacent non-tumor tissues

2.2 BANCR的表達(dá)與ESCC臨床病理特征的相關(guān)性 BANCR異常表達(dá)與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)(見表1)。

2.3 BANCR的表達(dá)與ESCC預(yù)后的關(guān)系 BANCR高表達(dá)組患者的PFS和OS較BANCR低表達(dá)組均明顯縮短(PFS，P=0.006；OS，P=0.040)。BANCR高表達(dá)組患者中位PFS是13個月，而BANCR低表達(dá)組患者中位PFS是40個月。BANCR高表達(dá)組患者中位生存期為19個月，BANCR低表達(dá)組患者中位生存期為38個月(見圖2、圖3)。

表1 ESCC癌組織BANCR表達(dá)水平和ESCC臨床病理特征的關(guān)系

Tab 1 The relationship between expression of BANCR and clinicopathologic characteristics in ESCC

臨床特征例數(shù)BANCR表達(dá)低高P值年齡(歲)0.167 ≤60451233 >60471829性別0.175 男632340 女29722腫瘤部位0.174 上16610 中461036 下301416分化程度0.484 高1798 中43835 低311318腫瘤大小(cm)0.022 ≤4341618 >4581444淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.032 無441925 有481137遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0.217 M0712348 M121714TNM分期0.015 Ⅰ～Ⅱ331617 Ⅲ～Ⅳ591445

圖2 PFS分析Fig 2 Analysis of progression free survival

圖3 ESCC患者OS分析Fig 3 Analysis of OS in ESCC patients

3 討論

食管癌是目前全球第八大惡性腫瘤，并且腫瘤相關(guān)病死率位居第六位[9]。根據(jù)組織學(xué)分類食管癌可分為兩個主要類型：ESCC和腺癌。其中ESCC是食管癌的主要組織類型，雖然診斷和治療有所提高，但是ESCC患者的5年生存率仍然很低[10]。在很大程度上，ESCC患者死亡的原因是遠(yuǎn)處病灶轉(zhuǎn)移[11]。

早期認(rèn)為lncRNA為基因組轉(zhuǎn)錄的“暗物質(zhì)”，但近來研究表明lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有密切的聯(lián)系[12]。大量研究表明lncRNA參與表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、小RNA生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，針對已知的lncRNA功能可以總結(jié)為信號、誘餌、引導(dǎo)、支架[13]。同時研究證實許多l(xiāng)ncRNA可作為疾病發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及預(yù)后的新指標(biāo)，如HULC、H19、MALAT1和HEIH[14]。探索lncRNAs的異常表達(dá)有利于更好地研究ESCC的發(fā)生分子機制并為其診斷和治療提供新的潛在的分子靶點[15]。

通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)BANCR在ESCC組織中較癌旁組織表達(dá)高，提示BANCR可作為診斷ESCC的一個潛在指標(biāo)，并且BANCR的異常表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，與年齡、性別、腫瘤部位無關(guān)，提示BANCR與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。此外，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，BANCR高表達(dá)組的PFS和OS較BANCR低表達(dá)組都明顯縮短，提示BANCR的高表達(dá)可能與ESCC的預(yù)后不良有關(guān)，可作為ESCC患者預(yù)后情況的指標(biāo),為臨床ESCC的診斷、進(jìn)展及預(yù)后提供新的方法。目前研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA HOTAIR、H19等可通過誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程[16]。EMT是指上皮細(xì)胞失去上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的可逆過程，已被證明在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移播散的早期事件中起關(guān)鍵作用[23]。有研究報道， lncRNA結(jié)合到特定的蛋白伴侶并在調(diào)節(jié)他們結(jié)合蛋白的活性和定位中發(fā)揮重要作用，MALAT-1是核lncRNA，通過與SR蛋白相互作用和影響SR蛋白及其他的剪接因子在核散斑區(qū)域的分布增加轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性[15]。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中的AOC4P表達(dá)可能通過與Vimentin蛋白結(jié)合、促進(jìn)其降解從而抑制EMT過程。目前研究發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)節(jié)EMT的信號通路主要包括轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF-β)通路[18]、MEK-ERK通路[19]、Wnt /β-catenin 通路[20]，BANCR是否通過上述信號通路調(diào)節(jié)EMT仍有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，在ESCC組織中BANCR表達(dá)升高，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TMN分期相關(guān)。提示BANCR參與ESCC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移進(jìn)程，其有可能作為ESCC患者預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物，但其可能作為ESCC診斷的標(biāo)記物及其調(diào)控ESCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的確切分子機制仍有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Clinical significance of BANCR expression in esophageal squamous cell carcinoma

WANG Sumin, WANG Haolian, HE Qianqian, LI Dongying, ZHANG Jinping, LI Jiansheng

Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

Objective To explore the expression of BANCR in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and to analyze its clinical significance.Methods The expression of BANCR was examined by quantitative real-time-PCR in 92 ESCC tissues and adjacent non-tumor tissues.And its correlation with clinical pathology and prognosis was analyzed.Results BANCR was overexpressed significantly in ESCC tissues compared with adjacent non-tumor tissues (P<0.05). High expression of BANCR was associated with TNM stage (P=0.015), tumor size (P=0.022) and lymph node metastasis (P=0.032), but not associated with age, gender, tumor site and distant metastasis BANCR high expression group had significant shorter survival time than low BANCR expression group.Conclusion BANCR is highly expressed in ESCC tissues and its high expression is correlated with tumor size, lymph node metastasis and TNM stage. The expressionof BANCR is higher， the prognosis of ESCC patients is worse, it may be involved in the progression and metastasis of ESCC.

Long non-coding RNA; BARF-activated non-coding RNA; Esophageal squamous cell carcinoma; TNM stage; Lymph node metastasis; Prognosis

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.013

王素敏，碩士研究生在讀，研究方向:消化道腫瘤。 E-mail: 846101031@qq.com

李建生，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：消化道腫瘤。E-mail: lijiansheng@medmail.com.cn

R735.1

A

1006-5709(2017)05-0531-03

2016-11-23