周正，王曉蕾，陳海燕，馬源慧，周西清，景輝，趙躍然

(1濟南大學·山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南250013；2山東省胸科醫(yī)院；3山東省醫(yī)學科學院)

GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核診斷中的應用

周正1,2，王曉蕾2，陳海燕2，馬源慧2，周西清2，景輝2，趙躍然3

(1濟南大學·山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南250013；2山東省胸科醫(yī)院；3山東省醫(yī)學科學院)

目的 探討GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核診斷中的應用價值。方法 采用GeneXpert MTB/RIF對臨床及病理檢查確診的72例脊柱結(jié)核患者和20例非脊柱結(jié)核患者的脊柱組織標本進行檢測，計算其診斷脊柱結(jié)核的敏感性、特異性、陰性預測值、陽性預測值，并與MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法進行比較；評價GeneXpert MTB/RIF檢出利福平(RIF)耐藥性的效能。結(jié)果 GeneXpert MTB/RIF檢測診斷脊柱結(jié)核的敏感性為76.38%(55/72)、特異性為95.00%(19/20)，MGIT 960液體培養(yǎng)診斷診斷脊柱結(jié)核的敏感性為54.60%(39/72)、特異性為90.00 %(18/20)，抗酸涂片染色法診斷診斷脊柱結(jié)核的敏感性為27.77 %(20/72)、特異性為100%(20/20)。GeneXpert MTB/RIF檢測診斷脊柱結(jié)核的敏感性高于MGIT 960液體培養(yǎng)和抗酸涂片染色法(P均<0.05)。結(jié)論 GeneXpert MTB/RIF可輔助診斷脊柱結(jié)核能顯著提高脊柱結(jié)核的檢出率。

脊柱結(jié)核；脊柱組織標本評價系統(tǒng)；結(jié)核分枝桿菌；利福平；MTB/RIF檢測系統(tǒng)

中國是全球結(jié)核病高發(fā)病率國家之一，結(jié)核病患者數(shù)量僅次于印度[1]。脊柱結(jié)核是結(jié)核病的重要類型之一，占結(jié)核病患者的1%～5%[2]。其中，脊柱結(jié)核占骨結(jié)核的50%[3]。結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)和抗酸桿菌染色法是傳統(tǒng)結(jié)核病實驗室診斷的金標準。然而，傳統(tǒng)試驗存在諸多弊端，如抗酸染色法陽性率偏低，結(jié)核培養(yǎng)周期較長，需3～8周，且對活菌的要求高。GeneXpert MTB/RIF作為一種快速、有效的分子診斷手段，可在2 h內(nèi)直接從痰液標本中檢測MTB和利福平(RIF)耐藥性，其敏感性為67%～98%，特異性為98%[4,5]。本研究采用術后脊柱病灶組織標本，評價GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年1～12月山東省胸科醫(yī)院收治的經(jīng)臨床診斷和病理檢查確診的脊柱結(jié)核患者72例，經(jīng)影像學檢查明確診斷，排除既往有結(jié)核感染的患者。其中男42例、女30例，年齡11～77歲、平均39.76歲，頸椎結(jié)核2例、胸椎結(jié)核22例、腰椎結(jié)核45例、骶椎結(jié)核3例，癥狀為咳嗽33例、咳痰23例、發(fā)熱15例、咯血8例、胸痛11例、血液傳播2例、繼發(fā)性肺結(jié)核19例，經(jīng)液體藥敏法檢測RIF耐藥38例。選擇同期經(jīng)臨床診斷和病理檢查確診的非結(jié)核患者20例，男11例、女9例，年齡22～45歲、平均37.89歲，椎間盤突出癥11例、其他非結(jié)核疾病9例。兩組均經(jīng)手術治療，術中獲取脊椎病灶組織。

1.2 檢測方法 根據(jù)患者病灶不同部位選取疑似結(jié)核病灶組織(膿液、干酪樣組織、肉芽組織等)，將所獲取的脊椎病灶組織進行充分粉碎研磨，加入氫氧化鈉、磷酸鹽緩沖液震蕩離心，離心后的沉淀物分成3份待用，分別采用GeneXpert MTB/RIF、MGIT 960液體培養(yǎng)和藥物敏感試驗、抗酸涂片染色法進行檢測。GeneXpert MTB/RIF檢測：取沉淀物樣本1 mL加入GeneXpert MTB/RIF樣本前處理液2 mL，置于渦旋振蕩器上混勻孵育15 min，取處理液加入反應盒后置于GeneXpert檢測模塊中，2 h后判讀結(jié)果。結(jié)果判讀：根據(jù)GeneXpert MTB/RIF探針的循環(huán)閾值(Ct值)，當內(nèi)對照探針Ct值≤38為陽性。MGIT960液體培養(yǎng)和藥物敏感試驗：取沉淀物0.5 mL置于添加營養(yǎng)劑和雜菌抑制劑的MGIT960液體培養(yǎng)管中，放于MGIT 960培養(yǎng)儀中，監(jiān)測管中氧氣濃度，當氧氣被消耗時，管底部的熒光顯示劑在特定光源下激發(fā)出熒光，儀器通過數(shù)據(jù)處理得出陽性結(jié)果。對陽性樣本進行RIF(1 μg/mL)藥敏試驗?？顾嵬科旧ǎ喊凑铡督Y(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》中的要求進行標準化操作，當涂片結(jié)果≥1+(3～9條抗酸桿菌/100個視野)時，該涂片結(jié)果為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。以臨床診斷及病理學檢查為金標準計算各類檢查方法診斷脊柱結(jié)核的敏感性、特異性、陰性預測值、陽性預測值及其95%置信區(qū)間。以液體藥敏結(jié)果為金標準，評價GeneXpert MTB/RIF檢出MTB及RIF耐藥性的準確性。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GeneXpert MTB/RIF對脊柱結(jié)核的診斷效能 脊柱結(jié)核患者72例，GeneXpert MTB/RIF 檢測MTB陽性55例、陰性17例，MGIT 960液體培養(yǎng)MTB陽性39例、陰性33例，抗酸涂片染色法MTB陽性20例、陰性52例。非結(jié)核患者20例，GeneXpert MTB/RIF 檢測MTB陽性1例、陰性19例， MGIT 960液體培養(yǎng)MTB陽性2例、陰性18例，抗酸涂片染色法MTB陽性0例、陰性20例。三種檢測方法對脊柱結(jié)核的診斷效能見表1。

表1 三種檢測方法診斷脊柱結(jié)核的效能比較(%)

注：與MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法比較，*P<0.05。

2.2 GeneXpert MTB/RIF對RIF耐藥性的診斷價值 GeneXpert MTB/RIF對38例RIF耐藥患者進行檢測，檢出RIF耐藥23例。GeneXpert MTB/RIF對RIF耐藥的敏感性為81.81%(18/22)，特異性為68.75%(11/16)。

3 討論

近年來，我國脊柱結(jié)核患者日趨增多，并且耐多藥的患者比例較高，約占22%[6]。傳統(tǒng)的結(jié)核培養(yǎng)和抗酸染色涂片方法敏感性較低，常誤診[7]。WHO對結(jié)核病控制的重點是快速準確的診斷結(jié)核病尤其是提高耐多藥結(jié)核的診斷能力。在結(jié)核病的分子診斷技術中，檢測MTB的DNA可提高試驗的有效性和準確性[8]。GeneXpert MTB/RIF以半巢式實時定量PCR為基礎，檢測MTB中rpoB基因，檢測周期為2 h左右，并且可以檢測RIF的耐藥性。其在痰標本中檢測結(jié)核病以及RIF耐藥性的敏感性和特異性較高，成為WHO推薦的檢測結(jié)核病的方法[9]。本研究以臨床診斷和病理檢查為金標準，使用的標本類型為脊柱結(jié)核病灶組織，比較GeneXpert MTB/RIF、MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法三種方法對檢測脊柱結(jié)核的效能。結(jié)果顯示，GeneXpert MTB/RIF的敏感性遠優(yōu)于MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法。Sun等[10]報道, GeneXpert MTB/RIF結(jié)果敏感性為80%，與本研究的76.38%相符，遠高于結(jié)核桿菌固體和液體培養(yǎng)。本研究利用GeneXpert MTB/RIF分別與MGIT960液體培養(yǎng)、抗酸涂片染色法合并診斷脊柱結(jié)核，取得較好研究結(jié)果。其中，單獨使用抗酸涂片診斷結(jié)核病的敏感性僅為27.77%，但與GeneXpert MTB/RIF合并后診斷的敏感性提升至51.85%，使用GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合抗酸涂片診斷能顯著的降低了抗酸涂片的假陰性率。使用GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合抗酸涂片染色法可以在2 h內(nèi)檢測出MTB和RIF耐藥性的結(jié)果，大大縮短診斷結(jié)核病的TAT時間[11,12]。本研究中在確診脊柱結(jié)核患者中仍有17例標本的GeneXpert MTB/RIF結(jié)果顯示陰性，此假陰性出現(xiàn)的原因可能為脊柱結(jié)核患者在術前已經(jīng)使用大量的抗結(jié)核藥物，并且手術后取得的標本被其他菌污染，干擾儀器的檢測。

李力韜等[13]用GeneXpert MTB/RIF試驗檢測脊柱結(jié)核患者的敏感性和特異性均達到98%以上，明顯高于本實驗，與以下原因有關：①李力韜等研究中使用結(jié)核培養(yǎng)陽性的標本進行GeneXpert MTB/RIF試驗，而本實驗直接使用臨床標本，未使用結(jié)核培養(yǎng)陽性標本菌株。②本實驗樣本量較少，并且病例中有兒童病例，有國外文獻報道，GeneXpert MTB/RIF 試驗檢測兒童結(jié)核患者時，其敏感性和特異性明顯低于成人[14]。③Arman等[15]試驗結(jié)果為重復試驗兩次以上后記錄的最后檢測結(jié)果，而本實驗僅檢測一次。因此，GeneXpert MTB/RIF 檢測次數(shù)的增加會在一定程度上可以加大其檢測MTB的敏感性和特異性。

本研究以液體藥敏結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF檢測RIF的敏感性為81.81%，此結(jié)果與國外結(jié)果基本一致。然而特異性為68.75%，有5例標本未能檢測出耐藥基因的突變，原因可能為標本類型為術后組織標本，標本類型差異較大，組織標本含菌量較低，粉碎組織不徹底，并且其他組織雜質(zhì)較多，標本的采集及運輸中存在污染，從而影響GeneXpert MTB/RIF儀器中DNA的擴增。

本研究顯示，GeneXpert MTB/RIF是一種快速、準確診斷脊柱結(jié)核及RIF耐藥性的方法。由于樣本量較少，本文僅就GeneXpert MTB/RIF對脊柱結(jié)核的診斷價值進行了總體研究，未對頸椎、胸椎、腰椎、骶椎結(jié)核的診斷進一步分析。因此，驗證GeneXpert MTB/RIF對脊柱不同部位結(jié)核的早期診斷意義將是未來的研究方向。

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趙躍然(E-mail：yrzhao@sdu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.032

R529.2

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2017-02-24)