吳國泰 牛亭惠 劉五州 王瑞瓊 杜麗東++李廣遠

【摘要】目的：研究藏藥唐古特烏頭總生物堿（TAA）的急性毒性及抗炎鎮(zhèn)痛作用。方法：采用灌胃和腹腔注射兩種給藥途徑研究TAA的急性毒性；采用二甲苯致小鼠耳腫脹、瓊脂肉芽腫兩種炎癥模型，考察TAA的抗炎作用；采用冰醋酸致小鼠扭體和熱板致痛兩種疼痛模型，觀察TAA的鎮(zhèn)痛作用。結果：TAA具有一定急性毒性，對二甲苯致小鼠耳腫脹和皮下瓊脂肉芽腫兩種炎癥模型以及冰醋酸致小鼠扭體和熱板致痛兩種疼痛模型均有一定的抑制作用。結論：藏藥唐古特烏頭總生物堿具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，也具有一定的急性毒性。

【關鍵詞】唐古特烏頭；生物堿；急性毒性；抗炎鎮(zhèn)痛

【中圖分類號】R29【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）10-0028-05

Acute Toxicityand Anti-inflammatoryor Analgesic Effects of Total Alkaloids of Aconitum Tanguticum in Mice

WU Guotai 1， 2NIU Tinghui 1LIU Wuzhou1WANG Ruiqiong1DU Lidong1， 2LI Guang yuan 1*

1 Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2 Key Laboratory

of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine in Gansu province， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To study the acute toxicityand anti-inflammatoryor analgesic effectsoftotal alkaloids of Aconitum tanguticum（Maxim）stapf（TAA） through experiments Methods Acute toxicity of TAA were measured by using oral and intraperitoneal injection of routes of administration The anti-inflammatory effects of TAA were observed by using the test of mouse ear swelling induced by xylene and the weight of placing agar into subcutaneous of mouse to induce granuloma The analgesic effects of TAA were observed by using the test of mouse twister induced by glacial acetic acid and the test of ache induced by hot were set up Results TAA have inhibitory effect to both of the inflammatory models and ache models TAA has some acute toxicity Conclusion TAA had anti-inflammatory and analgesic effects，andacute toxicity was appreciated

Keywords：Aconitum tanguticum（Maxim）stapf； Alkaloids；Acute Toxicity； Anti-inflammatory and Analgesic Effect

藏藥唐古特烏頭Aconitum tanguticum（Maxim） Stapf為高山珍稀藥材，其性涼味苦，具有清熱解毒，生肌燥濕的功效。主要用于肝膽熱癥、肺熱肺炎、肝炎、胃腸炎、傳染病引起的發(fā)燒等，傳統(tǒng)藏醫(yī)臨床使用歷史悠久，療效確切[1，2]。唐古特烏頭生長在高山草甸及碎石帶，平均海拔為4000米，主產于西藏西東部、青海東南部、甘肅南部、四川西北部和云南北部等地。在四川（黑水縣、紅原縣、馬爾康、金川縣）、甘肅?。ㄌ熳？h、甘南州、和政縣）、青海?。ㄑh、貴德縣、互助縣、貴南縣、同德縣、玉樹州）、西藏（昌都地區(qū)）多呈零散分布，沒有種群優(yōu)勢，易遭到破壞。目前在四川金川、馬爾康地區(qū)有少量栽培，但是栽培狀況和種植規(guī)模等并不樂觀。唐古特烏頭收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·藏藥》（第1冊），由唐古特烏頭組成復方形成的藏成藥中共有9個品種，分別為安兒寧顆粒、二十五味肺病丸、十二味翼首散、八味獐芽菜丸、大月晶丸、十一味金色丸、紅龍鎮(zhèn)痛片、十三味榜嘎散、二十五味鬼臼丸。資料顯示，藏藥甘青烏頭有小毒，具有廣泛的藥理活性，抗菌抗炎、抗病毒、抗高血壓和抗腫瘤等作用已經得到實驗驗證[3，4]。唐古特烏頭含有內酯型二萜生物堿，結構不穩(wěn)定，追蹤單個生物堿成分目前存在較大困難[5]。在前期制備總生物堿的基礎上，研究其急性毒性和抗炎鎮(zhèn)痛作用，為明確其抗炎鎮(zhèn)痛的藥效物質基礎、開發(fā)藏藥資源提供依據。

1儀器與材料

11供試藥品醋酸潑尼松片（批號：1306041，天津天藥藥業(yè)股份有限公司）；氫溴酸高烏甲素注射液（批號：20131103，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司）；泊洛沙姆（pluronic-127，批號：201412，上海源葉生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號：WXBB5403V，Sigma-aldrich公司）。唐古特烏頭（青海帝瑪爾藏藥有限公司）經甘肅中醫(yī)藥大學中藥炮制教研室劉峰林博士鑒定為毛茛科烏頭屬植物唐古特烏頭Aconitum tanguticum（Maxim）Stapf的全草，標本存放于該教研室。總生物堿（TAA）：將唐古特烏頭粉碎過20目篩，稱取500g，加15倍量（7500mL）90%乙醇在85℃條件下攪拌提取15h，回收乙醇，濃縮，冷凍干燥，得提取物8825g，用氯仿精制，用酸堿滴定法測得總生物堿含量為03323%，即獲得2932mg唐古特烏頭總生物堿。臨用前用終濃度為01%的二甲基亞砜配制乳濁液備用。

12動物昆明種小鼠，SPF級，體重（20±2g），雌雄不拘，甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（甘）2011-0001，實驗動物設施使用證號SYXK（甘）2011-0001。室溫（25±05）℃，相對濕度（55±5）%，12h燈光，12h黑暗，適應3d開始實驗。

13儀器BS110Sartorius電子天平（德國Sartorius公司）；52770型冷熱痛覺測試儀（美國Stoelting公司）；KDM型可調電子控溫電熱套（成都泰盟科技有限公司）；HHS11-2型水浴鍋（浙江科學實驗儀器廠）；DT510H型超聲波清洗器（德國Bandelin公司）。

2 方法

21TAA的急性毒性試驗分別以1：10：100劑量比例配制乳濁液，灌胃給藥（20mL/kg體重）找出受試物的0%和100%估計致死量。另取小鼠，以受試物0%和100%估計致死量為依據，分別以1：4：16劑量比例配制乳濁液，灌胃給藥（20mL/kg體重），測定受試物的Dmin和Dmax。根據Dmin和Dmax的值，以及計劃分組數，計算組間劑量比值（K），以Dmin作為最低劑量組，Dmax作為最高劑量組，按K值計算出中間幾組劑量。灌胃給藥（20mL/kg體重）后觀察并詳細記錄小鼠的反應情況以及死亡分布情況，采用LD50處理軟件計算TAA的半數致死量（LD50）和LD50的95%可信區(qū)間，采用腹腔注射給藥，同法測定腹腔注射的LD50和LD50的95%可信區(qū)間[6]。

22TAA的抗炎作用

221TAA對二甲苯所致小鼠耳殼腫脹的影響[7-8]取小鼠50只，雄性，按體重隨機分為DMSO對照組，陽性對照組（醋酸潑尼松45mg/kg，相當于臨床70kg成人日用量的10倍），總生物堿（TAA）高、中和低劑量組，共5組，每組10只。TAA高、中、低劑量分別用DMSO助溶（DMSO終濃度為01%），配成乳濁液供試，分別灌胃100、75、50mg/kg的TAA乳濁液，DMSO對照組小鼠灌胃01%DMSO蒸餾水乳濁液，給藥容量均為20mL/kg，1次/d，連續(xù)3d，末次給藥60min后，清潔小鼠雙耳耳面，于左耳兩面涂抹二甲苯25μL/只，右耳不涂抹作為對照，30min后，頸椎脫臼處死小鼠，用9mm打孔器取下左右耳相同部位的圓片，稱重。用下面公式計算腫脹度和抑制率。

腫脹度=左耳片重-右耳片重

抑制率=[DMSO對照組腫脹度-藥物組腫脹度]/DMSO對照組腫脹度×100%

222TAA對小鼠皮下瓊脂肉芽腫增生的影響[7，9]取小鼠50只，雄性，按體重隨機分為DMSO對照組，陽性對照組（醋酸潑尼松45mg/kg，相當于臨床70kg成人日用量的10倍），總生物堿（TAA）高劑量組、中劑量組和低劑量組，共5組，每組10只。分別在各小鼠背部皮下注射2%瓊脂（65℃保溫融化，生理鹽水配制）04mL/只。TAA高、中、低劑量分別用DMSO助溶（DMSO終濃度為01%），配成乳濁液供試，分別灌胃100、75、50mg/kg的TAA乳濁液，DMSO對照組小鼠灌胃01%DMSO蒸餾水乳濁液，給藥容量均為20mL/kg，1次/d，連續(xù)7d，末次給藥60min后，頸椎脫臼處死小鼠，剝離皮下瓊脂肉芽腫塊，稱濕重。用下面公式計算抑制率。

抑制率=（DMSO對照組肉芽腫重量-藥物組肉芽腫重量）/DMSO對照組肉芽腫重量×100%

23TAA的鎮(zhèn)痛作用

231TAA對冰醋酸致小鼠疼痛的影響[10]取小鼠50只，雌雄兼用，按性別體重隨機分為DMSO對照組，陽性對照組（氫溴酸高烏甲素注射液10mg/kg，相當于臨床70kg成人日用量的10倍），總生物堿（TAA）高、中和低劑量組，共5組，每組10只。TAA用DMSO助溶（DMSO終濃度為01%），配成乳濁液供試，分別灌胃100、75、50mg/kg的TAA乳濁液，DMSO對照組小鼠灌胃01%DMSO蒸餾水乳濁液，給藥容量均為20mL/kg，1次/d，連續(xù)3d，末次給藥60min后，各組小鼠分別腹腔注射新鮮配制的06%冰醋酸02mL/只，觀察各小鼠的扭體反應，記錄15min內小鼠扭體次數，用下面公式計算抑制率。

抑制率=（DMSO對照組扭體次數-藥物組扭體次數）/DMSO對照組扭體次數×100%

232TAA對小鼠熱痛閾的影響[11]取小鼠50只（實驗前篩選，熱痛反應時間為5～30s），雌性，按體重隨機分為DMSO對照組，陽性對照組（氫溴酸高烏甲素注射液10mg/kg，相當于臨床70kg成人日用量的10倍），總生物堿（TAA）高、中和低劑量組，共5組，每組10只。TAA用DMSO助溶（DMSO終濃度為01%），配成乳濁液供試，分別灌胃100、75、50mg/kg的TAA乳濁液，DMSO對照組小鼠灌胃01%DMSO蒸餾水乳濁液，給藥容量均為20mL/kg，1次/d，連續(xù)3d，末次給藥60min后，用冷熱痛覺測試儀（T=（55±05）℃）測定熱刺激時小鼠舔后足時間，用下面公式計算抑制率。

抑制率=（藥物組舔后足時間-DMSO對照組舔后足時間）/DMSO對照組舔后足時間×100%

24統(tǒng)計學處理采用SPSS170統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，數據以（x±s）表示，采用t檢驗，P<005表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3結果

31TAA的急性毒性給藥后小鼠在30min內出現興奮，豎尾，不安，張口，弓背，抽搐，四肢僵直，眼球突出，大量唾液分泌等癥狀，最后抽搐死亡，大體解剖肉眼觀察，未見肺、肝、腎、腦、心臟的形態(tài)和顏色異常；生存小鼠在給藥120min后開始進水進食，在之后的整個觀察期內，各小鼠活動正常，糞便性狀正常，體重增加正常，對照組小鼠未見明顯異常。測得TAA灌胃的LD50為0745g/kg，置信系數a=005時的置信區(qū)間為0646g≤LD50≤0860g。同法測得TAA腹腔注射的LD50為0336g/kg，置信系數a=005時的置信區(qū)間為0285g≤LD50≤0396g。

32TAA對二甲苯所致小鼠耳殼腫脹的影響由表1、圖1結果顯示TAA高、中劑量對二甲苯所致小鼠耳腫脹具有明顯抑制作用，TAA低劑量抑制效應不顯著。

32TAA對小鼠皮下瓊脂肉芽腫增生的影響由表2可知，TAA高劑量對二甲苯所致小鼠耳腫脹具有明顯的抑制效應，TAA中、低劑量抑制效應不顯著。

33TAA對冰醋酸致小鼠疼痛的影響由表3可知，TAA高、中劑量組小鼠15min內的扭體次數明顯減少，TAA低劑量組扭體次數減少得不明顯。

34TAA對小鼠熱痛閾的影響由表4可知，TAA高劑量組小鼠熱痛閾明顯增高，TAA中劑量和低劑量組痛閾增高不明顯。

4討論

烏頭屬植物在我國分布約有200種，其中70多種可作為藥用[12]，該屬藥用植物大部分以塊根或根入藥，大多數具有溫經止痛和祛風除濕的功效，其主要有效組分為生物堿類化合物[13]。唐古特烏頭是烏頭屬藥用植物的經典代表，是傳統(tǒng)藏醫(yī)臨床常用藥物之一，臨床使用歷史悠久，療效確切，具有比較雄厚的臨床基礎。

文獻記載唐古特烏頭有小毒，臨床使用時應嚴格控制用量[4，13]。前期研究表明，烏頭中的雙酯型生物堿的毒性是非常嚴重的，尤其是烏頭堿，而單酯型烏頭堿的毒性是烏頭堿的1/200～1/500，并具有相同的抗炎，抗高血壓活性[3，5]。本研究證實TAA經灌胃和腹腔注射對小鼠均具有一定的急性毒性，初步推測中毒靶器官為植物神經系統(tǒng)和運動神經系統(tǒng)，中毒較快，持續(xù)時間較短。另外，甘青烏頭中含有苯甲酰異葉烏頭堿、異葉烏頭堿和阿替辛、大麥芽堿benzoylheteratisine、tangutimine，hetisinone，talatizamine，atisine，hordeine[14]。在唐古特烏頭也分離得到異葉烏頭堿、苯甲酰異葉烏頭堿、唐烏堿等[15]，其生物堿為有效的抗炎物質，能顯著降低RA模型大鼠血清COX-2、IL-1、TNF-α和PGE2的含量[16]。

二甲苯致小鼠耳殼腫脹是經典的非特異性急性炎癥模型，是篩選抗炎作用的經典方法之一，本研究結果顯示TAA對耳殼腫脹具有一定的抑制作用，能迅速控制急性炎癥反應；皮下棉球肉芽腫是經典的非特異性慢性炎癥模型，本研究結果顯示TAA對慢性增生性炎癥反應也具有抑制作用，由此推斷TAA的抗炎作用是明確的，非特異性的。冰醋酸致小鼠扭體反應是經典的化學損傷致痛模型，能有效反應受試物通過抗炎而減輕疼痛反應，本研究證實TAA能減少小鼠扭體次數，初步推斷TAA在抗炎的同時產生鎮(zhèn)痛作用。物理損傷也是導致機體疼痛的主要原因，熱板法模擬燙傷導致的機體痛反應，是鎮(zhèn)痛藥有效性篩選的經典方法，本研究顯示TAA能提高熱刺激時的痛閾值，可以推斷具有中樞性鎮(zhèn)痛作用，具體作用機制還需進一步研究。

目前，對唐古特烏頭的系統(tǒng)研究較少，在其藥效物質基礎成分、藥理毒理作用及機制、質量評價方法和制劑質量控制的研究不足，鑒于唐古特烏頭在藏藥中的應用廣泛而且極為重要，調查發(fā)現其資源蘊藏量大，因此，今后對甘青烏頭進行細致深入的系統(tǒng)性研究，為有效合理地開發(fā)利用提供依據和參考。

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（收稿日期：2017-03-14編輯：陶希睿）