孫來龍，杜劍平，劉朝兵，張松林*

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.宜昌市中心人民醫(yī)院胸心大血管外科，三峽大學(xué)心血管病研究所，湖北 宜昌 443002)

技術(shù)方法

一種新型大鼠動脈移植模型的建立

孫來龍1，2，杜劍平1，劉朝兵1，2，張松林1，2*

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.宜昌市中心人民醫(yī)院胸心大血管外科，三峽大學(xué)心血管病研究所，湖北 宜昌 443002)

目的 移植物血管病(allograft vasculopathy, AV)限制著移植器官功能及遠(yuǎn)期存活，是器官移植領(lǐng)域最迫切需要解決的世界性難題。傳統(tǒng)的血管縫合方式需要優(yōu)秀的顯微外科技術(shù)，開展困難。探索出更為簡便、可行的動脈移植方法，可為臨床研究AV提供思路。方法 采用靜脈留置針管自制血管套管，取供體大鼠胸主動脈牽拉入套管并兩端翻轉(zhuǎn)、結(jié)扎固定為移植體，將該移植體植入受體大鼠腹主動脈并于造模后1周、4周、8周取移植段動脈行HE染色，觀測移植血管形態(tài)、測量內(nèi)膜厚度。結(jié)果 40只受體大鼠中有38只健康存活達(dá)所需檢測時間點，下肢及尾巴活動自如、大小便正常，且HE染色可見移植段血管內(nèi)膜表現(xiàn)為與AV一致的同心圓樣增厚。結(jié)論 此種大鼠動脈移植方法簡便可行，較傳統(tǒng)血管縫合方法可明顯縮短腹主動脈阻斷時間、減輕受體大鼠的手術(shù)創(chuàng)傷、造模成功率高,可復(fù)制性強(qiáng)。

移植物血管病；移植；模型

AV是由免疫因素和非免疫因素共同介導(dǎo)的移植物血管內(nèi)膜損傷和病理性過度修復(fù)，導(dǎo)致移植物血管同心圓樣增厚、管腔狹窄的一種移植后血管疾病。對AV發(fā)病機(jī)制及治療的研究一直以來是器官移植領(lǐng)域研究的熱點。傳統(tǒng)的血管縫合需要優(yōu)秀的外科團(tuán)隊及精細(xì)嫻熟的顯微外科操作技術(shù)，不利于AV研究的順利開展及推廣。我們在學(xué)習(xí)、嘗試各種目前已有的AV造模，綜合各種造模方式的利弊后總結(jié)出此種套管法大鼠胸主動脈腹腔移植模型，此法過程簡便、可復(fù)制性強(qiáng)、受體大鼠手術(shù)創(chuàng)傷小，可為臨床研究AV提供一個可行的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級別雄性Wistar大鼠20只，體重120～150 g，5～6周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]；SPF級別雄性SD大鼠40只，體重300～330 g，8～9周齡，購自三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[SCXK(鄂)2011-0012]。實驗操作完成于三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中心實驗室[SYXK(鄂)2011-0061]。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要儀器及材料

XTL-165雙目外科顯微鏡(江西鳳凰光學(xué)股份有限公司)；16 G、20 G靜脈留置針(BD公司)；P1 F6輸尿管導(dǎo)管(張家港沙工醫(yī)療器械公司)；8-0及9-0顯微帶針縫合線(寧波醫(yī)用縫針有限公司)。

1.3 實驗方法

手術(shù)操作過程簡便，除移植體植入受體大鼠腹主動脈過程時需一名助手外，其余操作過程一人即可順利完成。1只供體Wistar大鼠胸主動脈取出后可制作2個血管移植體移植給2只受體SD大鼠，節(jié)約動物資源。

1.3.1 供體手術(shù)

以Wistar大鼠為供體，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉起效后將大鼠固定在墊有紗布的解剖臺上。胸腹部備皮，碘伏消毒后鋪無菌紗布于切口四周，取尿道口上1 cm處至劍突下切口入腹，用鈍頭無齒鑷將胃管、腸管牽拉于腹腔左側(cè)。剪開后腹膜暴露腹主動脈及下腔靜脈，用剪刀剪斷腹主動脈及下腔靜脈快速放血，用紗布沾去血液，直到血液放盡。在劍突下向兩側(cè)橫形剪開腹壁和膈肌，分別于兩側(cè)腋中線處剪斷肋骨，將胸壁上翻，暴露胸腔內(nèi)臟器。小心分離出胸主動脈，顯微鏡下剝離動脈外層脂肪組織，剪斷肋間動脈時保留斷端約1 mm左右(斷端血管彈性回縮，既可防止漏血，也保證了胸主動脈完整性)。切取全長胸主動脈，肝素生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，手術(shù)刀切取中間兩段約7 mm粗細(xì)均勻且較直的動脈以制作移植體。

1.3.2 移植體制作

16 G靜脈留置針管(內(nèi)徑1.5 mm，外徑1.7 mm)壁薄，材質(zhì)堅韌，是自制血管套管的良好選擇。10支16 G靜脈留置針可制作40個血管套管。以鋒利的手術(shù)刀切取每段長度約4 mm的靜脈留置針套管保證兩個斷端面光滑、平整。以8-0顯微縫線縫于血管一端，牽引上述所取的移植血管通過套管。此時，將20 G靜脈留置針管插入該段移植動脈以便于套管的固定及動脈的翻轉(zhuǎn)。調(diào)節(jié)移植段血管于套管正中間。使用8-0顯微縫線縫于血管一端兩對稱位置，反向牽拉血管使血管翻轉(zhuǎn)于自制套管上，抽出用于牽拉的8-0 顯微縫線，將翻轉(zhuǎn)血管打結(jié)固定。同樣的方法翻轉(zhuǎn)血管的另一側(cè)并打結(jié)固定(見圖a)，抽出20 G留置針管后(見圖b)將移植體保存于4℃生理鹽水中備用。在制作移植體的過程中應(yīng)使用生理鹽水保持血管濕潤，避免血管損傷。經(jīng)我們的大量造模實驗證實供體120～150 g Wistar大鼠降主動脈外徑與16 G留置針套管內(nèi)徑相當(dāng)，且16 G留置針套管外徑與300～340 g SD受體大鼠腹主動脈內(nèi)徑相當(dāng)。

注：(a)反向牽拉，翻轉(zhuǎn)血管；(b)制備完成的移植體。圖1 移植體制作Note.(a)Reverse pull and turn the artery；(b)Prepared graft.Fig.1 Preparation of graft

1.3.3 受體手術(shù)

受體SD大鼠術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉、體位及固定、消毒鋪巾、腹部切口同上述供體手術(shù)。開腹后用腹部撐開器暴露腹腔內(nèi)容物，用鈍頭鑷將胃管及少量腸管輕輕牽拉于腹腔左側(cè)的溫鹽水紗布上，另取一塊溫鹽水紗布覆蓋于牽拉至腹腔左側(cè)的胃腸管。剪開后腹膜暴露腹主動脈及下腔靜脈，在顯微鏡下小心游離腎動脈平面下方約1～1.5 cm腹主動脈，取一只動脈夾夾閉腹主動脈左、右髂總分叉處上約3～4 mm處，另取一只動脈夾夾閉上述游離段動脈最上緣(如圖c)。將一段較20 G靜脈留置針軟管約短5 mm的P1 F6輸尿管導(dǎo)管套于20 G留置針管外，此時制備好的移植體可恰好置于其末端便于插入腹主動脈(如圖d)。于近心端動脈夾下約4～5 mm處剪開約1/2周徑血管，遠(yuǎn)心端血管斷端兩角及正中間斷縫三針9-0顯微縫線起牽拉作用，分別向上、向左、向右三個方向牽拉三根縫線并將移植體向腹主動脈斷端遠(yuǎn)心端完全插入。將三針用于牽拉的縫線縫合剪口(注意：三針均縫合后才能依次打結(jié))。先開放遠(yuǎn)心端動脈夾，見無漏血后再開放近心端動脈夾(若有漏血應(yīng)夾閉近心端動脈夾，在漏血處補(bǔ)縫一至兩針)。觀察到移植體遠(yuǎn)心端動脈充盈并搏動為移植體植入成功(見圖e)。溫鹽水沖洗腹腔2～3次后將胃管、腸管放回腹腔，關(guān)腹后送動物房。術(shù)后禁食12 h，自由飲水。觀察大鼠活動，48 h大鼠自由活動可視為手術(shù)成功。若術(shù)后，大鼠下肢癱瘓、大小便失禁、尾巴僵直、發(fā)涼變暗考慮為移植失敗。

2 結(jié)果

經(jīng)過造模預(yù)實驗后，正式造模的40只SD大鼠中，有38只均能存活達(dá)實驗觀測時間點，且受體大鼠下肢、尾巴活動自如、大小便正常。有1只SD大鼠在向遠(yuǎn)心端插入移植體時感阻力極大，不幸撕裂腹主動脈而導(dǎo)致失敗；有1只大鼠術(shù)后下肢活動障礙、尾巴僵硬，并于術(shù)后第三天死亡，考慮為移植體管腔或剪口縫合處狹窄導(dǎo)致遠(yuǎn)端供血不足。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)供體胸主動脈獲取至剝離干凈平均時間為(20±2)min；移植體制作平均時間為(6±1)min；受體移植手術(shù)總時間平均為45±4 min，其中腹主動脈阻斷時間平均約(7±2)min。由于總手術(shù)時間、腹主動脈阻斷時間短，本實驗中未使用肝素及抗生素，術(shù)后約1 h大鼠即可蘇醒并逐漸恢復(fù)正?；顒?。移植后1周、4周、8周(n=12)取出移植段血管，用肝素生理鹽水沖洗管腔置于4%多聚甲醛中固定以供后期行HE染色。

注：(c)阻斷腹主動脈；(d)移植體的放置；(e)移植手術(shù)成功。圖2 受體手術(shù)Note.(c)Abdominal aorta occlusion；(d)Placement of graft；(e)Successful transplantation.Fig.2 Receptor surgery

注：(f)正常對照組；(g)移植術(shù)后1周；(h)移植術(shù)后4周；(i)移植術(shù)后8周。圖3 移植動脈HE染色(×400)Note.(f)Normal control group；(g)1 week after transplantation；(h)4 weeks after transplantation；(i)8 weeks after transplantation.Fig.3 HE staining of graft artery

移植段動脈HE染色結(jié)果分析：正常對照組血管：內(nèi)膜、中膜、外膜完整，中層彈力纖維排列整齊；移植1周：血管內(nèi)皮明顯剝脫，內(nèi)膜附著少許炎細(xì)胞及血栓；血管壁明顯水腫，少許炎細(xì)胞浸潤；移植4周：血管內(nèi)膜逐漸增厚，中層彈力纖維排列欠整齊，少許炎細(xì)胞浸潤；移植8周：血管內(nèi)膜明顯同心圓樣增厚，中層彈力纖維排列紊亂，偶見斷裂，亦可見炎癥細(xì)胞浸潤。

HE染色可見血管組織形態(tài)總體表現(xiàn)為AV一致的改變。下列表1示各時間點12只受體大鼠移植血管內(nèi)膜平均厚度：

表1 各時間點移植動脈內(nèi)膜厚度(±s,μm)

Tab.1 Intimal thickness at each time point

表1 各時間點移植動脈內(nèi)膜厚度(±s,μm)

組別Group內(nèi)膜厚度Intimalthickness對照組Controlgroup4.56±0.081周組1weeksgroup4.72±0.034周組4weeksgroup38.76±3.628周組8weeksgroup87.45±4.27

3 討論

3.1 經(jīng)驗及體會

在造模學(xué)習(xí)、嘗試的整個過程中，我們經(jīng)歷過多次不同原因的失敗。在不斷改進(jìn)、摸索中才總結(jié)出此種簡便可行的套管法大鼠主動脈移植模型。現(xiàn)將造模過程中的體會分享如下：(1)制作套管時，用鋒利刀片切割16G留置針管，確保長度一致、邊緣修剪整齊以保證移植血管長度一致及減少對移植動脈的損傷；(2)制作移植體時，20G靜脈留置針的使用可以很好的固定套管，便于翻轉(zhuǎn)血管及打結(jié)固定；(3)翻轉(zhuǎn)移植動脈時用兩把顯微鑷子或者縫合血管壁反向牽拉縫線均能較好地翻轉(zhuǎn)動脈；(4) 為防止移植體插入腹主動脈時移植體上動脈滑動，固定套管上移植動脈至少需要兩股線，打結(jié)固定前應(yīng)將血管兩端牽平、理順，保證移植動脈緊貼套管內(nèi)壁；(5)實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)大鼠的腹主動脈的直徑與大鼠體重、與大鼠平時活動量、大鼠手術(shù)前交感興奮程度等多種因素有關(guān)，一般大鼠體重低于300 g、平時活動量少或手術(shù)前大鼠交感過度興奮導(dǎo)致心率極快及血管收縮時，移植體的插入將較困難；(6)受體大鼠麻醉前可先輕微牽拉其尾巴促進(jìn)其排便，因為肛門上段腸管正位于腹主動脈及下腔靜脈之上，阻擋手術(shù)視野；(7)分離腹主動脈和下腔靜脈是手術(shù)關(guān)鍵點及難點，須十分小心，一旦分離出血，難以繼續(xù)分離；(8)插入移植體前在腹主動脈遠(yuǎn)心端縫合三針時確保縫合到腹主動脈內(nèi)膜、中膜、及外膜三層結(jié)構(gòu)，可避免移植體插入到動脈夾層中。由助手水平向右牽拉大鼠右側(cè)縫線、垂直向上牽拉中間縫線，術(shù)者左手水平向左牽拉大鼠左側(cè)縫線，右手持移植體插入腹主動脈剪口中。此過程是手術(shù)中另一極其關(guān)鍵的步驟；(9)縫合剪口時，待三針全部縫合后，再逐一打結(jié)，若先打結(jié)，縫合下一針時找進(jìn)針點及出針點困難，甚至進(jìn)針過深可能縫合到動脈后壁。

3.2 AV研究模型的比較

AV的研究模型以O(shè)no和 Lindsey[1]開創(chuàng)的大鼠心臟移植最為經(jīng)典, 將供心移植至受體腹腔中，供心主動脈與受體腹主動脈行端側(cè)吻合，供心肺動脈與受體下腔靜脈行端側(cè)吻合。在這種技術(shù)基礎(chǔ)上，Heron等[2]采用套管技術(shù)進(jìn)行兔和大鼠頸部異位心臟移植。運用心臟移植模型來研究AV需要切開心臟來檢測所有脈管[3],操作困難且由于不同個體心臟冠脈系統(tǒng)常存在變異，難以形成平行對照。后來，主動脈移植模型來研究AV逐漸被國內(nèi)外研究者所認(rèn)同并采用[3-5 ]。由于血管端端吻合或者端側(cè)吻合對顯微縫合技術(shù)要求高，且易發(fā)生吻合口出血和(或)狹窄，即使同一術(shù)者每次縫合的差異性可能會很大。為進(jìn)一步簡化實驗?zāi)Ｐ?，孫文宇等[4]使用Teflon管進(jìn)行大鼠胸主動脈腹腔移植，該套管分為管體和延長部兩部分，制作相對較復(fù)雜；李平等[5]也利用自制聚乙烯套管完成大鼠胸主動脈腹腔移植，較孫文宇等的方法在套管設(shè)計上有些改進(jìn)。我們嘗試并總結(jié)前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)我們的造模方式可能更加簡便，在移植體插入腹主動脈后僅需要在肉眼下縫合3～4針即可，大大縮短了動脈阻斷時間及整體手術(shù)時間，減輕了對大鼠的手術(shù)創(chuàng)傷，提高了手術(shù)成功率和模型穩(wěn)定性，容易學(xué)習(xí)和推廣。

[1] Ono K, Lindsey ES. Improved technique of heart transplantation in rats[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1969, 57(2): 225-229.

[2] Heron I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats[J]. Acta Pathol Microbiol Scand A,1971,79 (4): 366-372.

[3] Stubbendorff M, Deuse T, Hammel A,etal.Orthotopic aortic transplantation: a rat model to study the development of chronic vasculopathy [J].J Vis Exp，2010,(46).

[4] 孫文宇，劉蔚，孫軍遠(yuǎn)，等.大鼠胸主動脈腹腔移植模型的技術(shù)改良[J].中國胸心血管外科臨床雜志, 2000, 7(2): 141-142.

[5] 李平，高思海，趙金平，等.大鼠胸主動脈腹腔移植模型的建立及改進(jìn)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(51)：10226-10229.

A new model of rat artery transplantation

SUN Lai-long1，2,DU Jian-ping1,LIU Chao-bing1，2，ZHANG Song-lin1，2*

(1.First clinical medical college of the Three Gorges University, Yichang 443002, China;2.Central People's Hospital of Yichang, Yichang 443002)

Objective Allograft Vasculopathy(AV), which limits the function and long-term survival of transplanted organs, it is the most urgent problem need to be solved in the field of organ transplantation. Traditional vascular anastomosis requires excellent microsurgical techniques, it is difficult to carry out. To explore a simple and feasible AV model can provide ideas for clinical research. Methods We make vessel cannulas by using vein detained needles, pulling the thoracic aorta of donor rat in vessel cannula, both ends turned over and fixed，and then transplant it in recipient rat abdominal aorta. 1, 4 and 8 weeks after transplantation, we take out of the transplanted arteries, HE stain, to observe the histomorphology and measurement the vascular intimal thickness. Results 38 of the 40 recipient rats healthy survival to the detection time points, the legs and tail can move freely, defecating and urinating normally. It is found that transplanted arteries concentric circles thickening, its histomorphology just like the AV by using HE staining.Conclutions The method of rats artery transplantation is simple and feasible, significantly shorten the time of abdominal aortic blocking, reduce surgical trauma, can improve the success rate and the reproducibility of operation.

Allograft vasculopathy; Transplantation；Model

孫來龍(1989-)，男，碩士生，醫(yī)師，研究方向：心肺移植的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail： 136284046@qq.com

張松林(1975-)，男，博士生，副主任醫(yī)師，研究方向：心肺移植的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail： zhangsonglin1101@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0099-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.021

2016-09-07