劉曉慧，劉 謙，吳新欣，郭力強，劉 萍

（河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心保定分中心，保定071051）

高效液相色譜法測定不同基質(zhì)的食品中防腐劑含量

劉曉慧，劉 謙＊，吳新欣，郭力強，劉 萍

（河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心保定分中心，保定071051）

取固體樣品（如糕點、肉腸等）2.000g，或液態(tài)樣品（如飲料等）10.00mL，加少量水稀釋后，加入220g·L－1乙酸鋅和106g·L－1亞鐵氰化鉀溶液各2mL沉淀蛋白質(zhì)并離心除去；取半固體樣品（如果凍等）2.000g，加水稀釋后用氨水（1＋1）溶液調(diào)節(jié)其酸度至pH 7～8，上述3種樣品溶液均分別用水定容至25.0mL。所得溶液進(jìn)行高效液相色譜分離，以TSK Eclipse XDB－C18色譜柱為固定相，和pH 5.0的甲醇－三乙胺緩沖溶液（1＋9）為流動相。苯甲酸和山梨酸的質(zhì)量濃度均在0.1～10.0mg·L－1內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，檢出限（3S／N）分別為1.8，1.2mg·kg－1。按標(biāo)準(zhǔn)加入法在3個濃度水平上進(jìn)行回收試驗，回收率在90%～97%之間，測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）均小于10%。

高效液相色譜法；防腐劑；食品；不同基質(zhì)

近年來，食品安全事件頻發(fā)，消費者對食品的安全性日益關(guān)注，特別是食品中的添加劑的使用情況越來越受到重視。過量使用添加劑會對人體健康造成一定的損害，因此衛(wèi)生部制定了《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［1］。苯甲酸和山梨酸是使用時間較長的食品防腐劑，對酵母、霉菌和部分細(xì)菌的抑制效果較好，在很多行業(yè)被廣泛使用。如果苯甲酸添加過量，不僅能破壞維生素B1，影響人體對鈣的吸收，刺激胃腸道，而且還會對人體肝臟造成危害，甚至致癌［2］。大多數(shù)文獻(xiàn)只介紹了基質(zhì)比較簡單的固體樣品或液體樣品中防腐劑的測定方法［3］，在國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 5009.29－2003中，也僅有幾類基質(zhì)簡單的食品中防腐劑的測定方法。在實際工作中，由于樣品種類繁多，基質(zhì)復(fù)雜，樣品進(jìn)樣后常會出現(xiàn)柱壓力升高、干擾物質(zhì)與被測物質(zhì)不能達(dá)到基線分離、目標(biāo)峰保留時間飄忽不定等各類問題［4－9］，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本工作優(yōu)化了前處理條件和高效液相色譜條件，采用高效液相色譜法對基質(zhì)復(fù)雜的肉腸、奶制品等樣品中防腐劑含量進(jìn)行了測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC－20AT型高效液相色譜儀，配LC－10Avp型紫外檢測器；KQ－500型超聲波清洗機(jī)；BAS224S型電子天平；3－30K型離心機(jī)。

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：1.00g·L－1。

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：1.00g·L－1。

乙酸鋅溶液：220g·L－1，稱取乙酸鋅220g，用少量水溶解，加入冰乙酸30mL，再用水定容至1L。

亞鐵氰化鉀溶液：106g·L－1，稱取亞鐵氰化鉀106g，用水溶解并定容至1L。

三乙胺緩沖溶液：移取三乙胺2.0mL，加水溶解并稀釋至1L，用冰乙酸調(diào)pH至5.0，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。

甲醇為色譜純，試驗用水為超純水，二者使用時均經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。

1.2 儀器工作條件

TSK Eclipse XDB－C18色譜柱（4.6mm× 150mm，5μm）；流動相為甲醇－三乙胺緩沖溶液（1＋9）混合液（pH 5.0）；檢測波長230nm；流量1mL·min－1；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL。

1.3 試驗方法

1.3.1 糕點、肉腸類固體樣品

稱取已制備的粉碎均勻的試樣2.000g，分別置于小燒杯中，用20mL水分?jǐn)?shù)次清洗小燒杯，將樣品完全移入25mL容量瓶中，超聲振蕩提取5min。取出后加亞鐵氰化鉀溶液2mL，搖勻，再加入乙酸鋅溶液2mL，搖勻，用水定容，移入離心管中，以4 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心5min，吸取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，按儀器工作條件進(jìn)行測定。

1.3.2 果凍等半固體樣品

稱取已粉碎均勻的試樣2.000g，加水適量，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，再加水至約20mL，置于60～70℃水浴中加熱片刻，加塞，劇烈振搖，使樣品在水中分散均勻。用氨水（1＋1）溶液調(diào)節(jié)酸度至pH 7～8，加塞，劇烈振搖，使樣品在水中分散均勻，置于60～70℃水浴中加熱30min，取出后趁熱超聲5min，冷卻后用水定容至25mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，按儀器工作條件進(jìn)行測定。

1.3.3 含乳飲料樣品

移取乳飲料、植物蛋白飲料等含蛋白較多的樣品10.00mL置于25mL容量瓶中，加亞鐵氰化鉀溶液2mL搖勻，再加入乙酸鋅溶液2mL搖勻，以沉淀蛋白質(zhì)，加水定容至25mL，以4 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心5min，吸取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，按儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的選擇

用乙酸鋅－亞鐵氰化鉀溶液沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，具有沉淀快速、濾液澄清的特點，但是易產(chǎn)生大量絮狀沉淀，且對目標(biāo)物也有不同程度的吸附作用，從而使樣品回收率難以達(dá)到要求［2］。根據(jù)苯甲酸、山梨酸屬于酸性防腐劑［5］的特點，對于果凍等食品樣品，試驗先加入少量氨水，調(diào)節(jié)溶液酸度至pH 7～8，使苯甲酸、山梨酸轉(zhuǎn)變成易溶于水的苯甲酸鹽及山梨酸鹽，再進(jìn)行后續(xù)的沉淀處理，即可達(dá)到滿意的效果。試驗選擇的前處理條件見1.3節(jié)。

2.2 流動相組分的選擇

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 5009.29－2003的色譜條件，在流動相為乙酸銨溶液的條件下，3種樣品基質(zhì)中苯甲酸的色譜圖見圖1。

由圖1可知：肉腸樣品中苯甲酸在8.9min出峰，而此處有基質(zhì)峰干擾，形成很寬的坡峰，目標(biāo)峰與干擾峰無法達(dá)到完全分離，不能滿足測定的要求；糕點基質(zhì)中苯甲酸在13.7min出峰，而13.0，14.4min均有干擾峰，目標(biāo)峰與干擾峰無法完全分離，易疊加；飲料基質(zhì)中苯甲酸也受到干擾。

由于流動相中水相比例為95%，過多的水相會使色譜柱的C18填料變性而無法使用，且不能使目標(biāo)峰和干擾峰完全分離，對日常測定工作帶來困難。試驗中考慮采用離子抑制法即向含水流動相中加入酸、堿或緩沖溶液等改性劑，以提高分離的選擇性［6］。三乙胺作為一種常見的離子對試劑，經(jīng)常被用在電離能力比較強的酸性化合物的測定中。使用離子對試劑后，在反相色譜柱上保留時間很短或根本不保留的樣品會形成有效地保留。但經(jīng)常使用三乙胺，會對色譜柱造成一定的影響。每次測定完畢后，及時用水相沖洗以避免對柱子填料的損傷。試驗選用三乙胺溶液作為流動相，以苯甲酸為例，基質(zhì)干擾峰明顯能與目標(biāo)峰分離，見圖2。

圖1 乙酸銨體系不同基質(zhì)中苯甲酸的液相色譜圖Fig.1 LC chromatograms of benzoic acid in different matrices in ammonium acetate system

圖2 三乙胺體系不同基質(zhì)中苯甲酸的色譜圖Fig.2 Chromatograms of benzoic acid in different matrices in triethylamine

2.3 流動相酸度的選擇

控制流動相的酸度，能有效抑制溶質(zhì)的離子化，減少譜帶拖尾現(xiàn)象，改善峰形。試驗發(fā)現(xiàn)，流動相酸度的改變對目標(biāo)峰的保留時間和選擇性都有較大的影響。以肉腸樣品為例，pH為6.0時，苯甲酸保留時間為8.1min，山梨酸保留時間為13.1min，此時苯甲酸前面有一個雜質(zhì)峰干擾；當(dāng)pH為5.0時，苯甲酸的保留時間延長至11.2min，與之前的干擾峰能完全分離，山梨酸保留時間延長至15.4min，見圖3。

圖3 不同酸度下三乙胺體系肉腸基質(zhì)中苯甲酸和山梨酸的色譜圖Fig.3 Chromatograms of benzoic acid and sortic acid in sausage matrix of different acidities in triethylamine systerm

通過多次試驗發(fā)現(xiàn)，飲料類樣品和果凍類半固體樣品均存在此種現(xiàn)象。因此，試驗選擇流動相的pH為5.0。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

將苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用水適當(dāng)稀釋后，配制成0.1，0.5，1.0，2.0，10.0mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：苯甲酸、山梨酸的質(zhì)量濃度在0.1～10.0mg·L－1內(nèi)呈線性，苯甲酸、山梨酸的線性回歸方程分別為y＝4 516 x＋13.16，y＝2 316 x－1.86，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

按3倍信噪比計算苯甲酸和山梨酸的檢出限（3S／N）分別為1.8，1.2mg·kg－1。

2.5 精密度和回收試驗

選取空白肉腸、QQ星奶、果凍樣品，分別添加3個濃度水平苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每個濃度水平平行測定6次，其加標(biāo)回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1可知：在肉腸、奶制品、果凍等復(fù)雜基質(zhì)食品中，加標(biāo)回收率都在90%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，回收率和精密度均滿足GB／T 27404－2008的要求。

2.6 樣品分析

按試驗方法分析糕點、肉腸、奶制品TFFU復(fù)雜基質(zhì)樣品1 300多批次，其中呈陽性樣品的包括糕點180批和肉腸類64批，奶制品里未檢出防腐劑，這是因為測定的奶制品主要是預(yù)包裝的奶粉和酸奶類，未添加防腐劑。將陽性樣品分別用本法和GB／T 5009.29－2003標(biāo)準(zhǔn)中氣相色譜法進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果Tab.2 Analytical results of samples mg·kg－1

由表2可知：使用本法測定，苯甲酸從陽性樣品改為陰性樣品，山梨酸的測定結(jié)果均明顯降低到GB 2760－2014中對糕點和肉腸規(guī)定的合格限量以下（糕點中山梨酸1 000mg·kg－1，肉腸中山梨酸1 500mg·kg－1）。

2015年，本實驗室參加了中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心的肉腸中苯甲酸的測定審核，采用GB／T 5009.29－2003標(biāo)準(zhǔn)方法中氣相色譜法進(jìn)行測定，結(jié)果為98.0mg·kg－1，與認(rèn)定值（4.9mg·kg－1）偏差大，Z值為91.0，原因是肉腸基質(zhì)中有干擾峰，改用本方法進(jìn)行了分析，測定結(jié)果為5.3mg·kg－1，在合格范圍內(nèi)。

本工作采用高效液相色譜法對糕點、肉腸、果凍、奶制品、醬油等復(fù)雜基質(zhì)食品中防腐劑進(jìn)行測定，使用甲醇－三乙胺緩沖溶液（1＋9）混合液（pH 5.0）為流動相，有效解決了柱壓過高、保留時間漂移、陽性檢出樣品定性困難、基質(zhì)干擾現(xiàn)象嚴(yán)重等問題。方法快捷可靠，具有較好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

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HPLC Determination of Preservatives in Food of Various Matrixes

LIU Xiao－h(huán)ui，LIU Qian＊，WU Xin－xin，GUO Li－qiang，LIU Ping
（Baoding Branch，Technical Center of Hebei Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Baoding071051，China）

The solid sample，e.g.cake，sausage and etc.，（2.000g）or liquid sample，e.g.，drinks etc.（10.00mL）was taken and diluted with some water.2mL of 220g·L－1zinc acetate solution and 2mL of 106g· L－1potassium ferrocyanide solution were added to precipitate protein and to remove it by centrifuge.In case of semisolid sample，e.g.，jelly，2.000g were taken and diluted with water.The acidity was adjusted to pH 7to 8with ammonia（1＋1）solution.The sample solution described above was made up to 25.0mL with water，and separated by HPLC using TSK Eclipse XDB－C18column as stationary phase and mixed solution of methanol and triethylamin（1＋9）（pH 5.0）as mobile phase.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of benzoic acid and sorbic acid were found in the same range of 0.1－10.0mg·L－1，with detection limits（3S／N）of 1.8，1.2mg·kg－1，respectively.Test for recovery was made by standard addition method at 3concentration levels，giving results in the range of 90%－97%，with RSDs（n＝6）less than 10%.

HPLC；Preservative；Food；Various matrixes

O652.63

A

1001－4020（2017）04－0447－04

10.11973／lhjy－h(huán)x201704016

2016－03－17

劉曉慧（1980－），女，河北保定人，博士，研究方向為食品中微生物的檢測。

＊通信聯(lián)系人。E－mail：chemliuq＠163.com