李海燕+潘彥舒+程曉娜+王東輝+郭洋洋+劉錦林

摘要：目的 觀察黃芩苷對缺血性腦損傷雄性大鼠的腦保護(hù)作用及其對大鼠血清孕酮水平的影響，探討其可能的作用機制。方法 采用成年SD雄性大鼠制造永久性左側(cè)大腦中動脈梗阻模型，根據(jù)神經(jīng)功能評分，分為模型組、黃芩苷組和抑制劑組，假手術(shù)組不插入拴線。造模后于不同時間點進(jìn)行神經(jīng)功能評分及雙前肢抓力測定，計算抓力下降率；ELISA檢測血清孕酮和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）含量。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能受損，雙前肢抓力顯著減小。治療7 d后，與模型組比較，黃芩苷組神經(jīng)功能評分降低，雙前肢抓力恢復(fù)，抓力下降率減?。≒<0.05）；與黃芩苷組比較，抑制劑組黃芩苷神經(jīng)功能保護(hù)作用降低（P<0.05）。治療7 d后，與模型組比較，黃芩苷組血清孕酮水平顯著升高（P<0.01），ACTH水平有升高趨勢；與黃芩苷組比較，抑制劑組血清孕酮和ACTH水平均降低（P<0.05）。結(jié)論 黃芩苷對缺血性腦損傷雄性大鼠的腦保護(hù)作用可能與其調(diào)控孕酮生成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃芩苷；孕酮；促腎上腺皮質(zhì)激素；缺血性腦損傷；神經(jīng)功能；雄性大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.009

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）06-0035-04

Abstract： Objective To investigate the productive effects of baicalin on the male rats with ischemic brain injury and its effects on serum progesterone level in rats； To explore the possible mechanism of baicalin in brain protection. Methods Adult SD male rats were used to create a permanent left middle cerebral artery occlusion model. The rats were evenly divided into model group， baicalin group， inhibitor group， and sham-operation group （without inserted into the intraluminal thread） according to the neurological function scores. At different time points after modeling， the neurological function scores and the grip strength of double foreleg were measured， and the reduction rate of grip strength was calculated. Serum progesterone and adrenocorticotrophic hormone （ACTH） were detected by ELISA. Results Compared with the sham-operation group， the neurological function of rats in the model group was impaired， the grip strength of double foreleg was significantly reduced. 7 days after treatment， compared with the model group， the neurological function score of baicalin group was lowered， grip strength of double foreleg was recovered， reduction rate of grip strength was reduced （P<0.05）； compared with the baicalin group， protective effects of baicalin on neurological function was lowered in inhibitor group （P<0.05）. 7 days after treatment， compared with the model group， the serum progesterone level in baicalin group was significantly higher （P<0.01）， and ACTH level showed an increasing trend； compared with the baicalin group， serum progesterone and ACTH levels in the inhibitor group decreased （P<0.05）. Conclusion The protective effects of baicalin on the male rats with ischemic brain injury may be related to the regulation of progesterone.

Key words： baicalin； progesterone； adrenocorticotrophic hormone； ischemic brain injury； neurological function； male rats

有研究顯示，黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分之一，能夠發(fā)揮減少腦梗死體積、減輕腦水腫和抑制細(xì)胞凋亡等腦保護(hù)作用[1-2]，同時，也能提高懷孕小鼠的孕酮水平，起到保胎作用[3]。孕酮被證實有良好的腦保護(hù)作用[4-6]。本團隊在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以通過提高血清孕酮水平發(fā)揮對缺血性腦損傷雌性大鼠的腦保護(hù)作用[7]。本實驗觀察黃芩苷對缺血性腦損傷雄性大鼠的腦保護(hù)作用和對血清孕酮水平的影響，同時設(shè)立抑制劑組，觀察大鼠在血清孕酮生成受到抑制后，黃芩苷的腦保護(hù)作用是否也受到抑制，從而明確黃芩苷對缺血性腦損傷雄性大鼠的腦保護(hù)作用是否與其調(diào)控孕酮生成有關(guān)。endprint

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD大鼠50只，10周齡，SPF級，體質(zhì)量（240±20）g，北京維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001，常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)病理學(xué)三級科研實驗室動物房。

1.2 藥物及制備

黃芩苷，成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-15062716，純度98.59%；甲磺酸溴隱亭片，匈牙利吉瑞大藥廠，批次2015/06，規(guī)格2.5 mg/片。黃芩苷溶液配制：將黃芩苷粉末用PBS配制成7.5 mg/mL黃芩苷溶液，再用NaOH溶液將pH值調(diào)至7.0，用生理鹽水稀釋至2.5 mg/mL；溴隱亭混懸液配制：將溴隱亭片碾成粉末狀，置于蒸餾水中充分混勻，配成0.1 mg/mL溴隱亭混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠孕酮ELISA試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）ELISA試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；PBS，Solarbio。電子分析天平（AE160型，瑞士Mettler公司），高頻小電刀（1411型，上海醫(yī)療器械技術(shù)公司），低速冷凍醫(yī)用離心機（R320型，北京白洋醫(yī)療器械有限公司），抓力測定儀（47200型，UgoBasile公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

造模方法參照Longa法[8]，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.35 mg/kg體質(zhì)量）麻醉，碘伏消毒頸部皮膚，在頸部正中切開一個長約2～3 cm的切口，結(jié)扎左側(cè)頸外動脈（ECA）遠(yuǎn)心端，電凝刀電斷ECA，從ECA殘端剪一個V型口插入栓線，到達(dá)大腦中動脈起始端，抑制大腦中動脈血液供應(yīng)，結(jié)扎ECA殘端，剪斷多余栓線（假手術(shù)組僅結(jié)扎ECA），術(shù)區(qū)使用少許青霉素粉進(jìn)行消毒，縫合手術(shù)切口。神經(jīng)功能評分≥3分者為造模成功。

2.2 分組及給藥

根據(jù)神經(jīng)功能評分將模型大鼠均勻分為模型組、黃芩苷組和抑制劑組（即在給予模型大鼠黃芩苷治療的同時應(yīng)用溴隱亭抑制孕酮生成）。給藥劑量由預(yù)實驗結(jié)果確定。模型組和假手術(shù)組予6 mL/kg生理鹽水腹腔注射和5 mL/kg蒸餾水灌胃，黃芩苷組予6 mL/kg黃芩苷溶液腹腔注射和5 mL/kg蒸餾水灌胃，抑制劑組予6 mL/kg黃芩苷溶液腹腔注射和5 mL/kg溴隱亭混懸液灌胃。4組大鼠均于術(shù)后24 h開始給藥，每日1次，7 d后取材。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 神經(jīng)功能評分 參照Bederson法[9]，總分為10分。分別于術(shù)后2～4 h和1、3、7 d進(jìn)行神經(jīng)功能評分。方法：①提起鼠尾，觀察右前肢表現(xiàn)。1分：內(nèi)收，但不貼身；2分：內(nèi)收，貼于身體；3分：內(nèi)收貼于身體并踡縮；4分：大鼠軀體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)。②將動物置一金屬網(wǎng)上，向后輕提鼠尾，觀察兩側(cè)前肢肌力。0分：兩側(cè)前肢緊拉金屬網(wǎng)肌力無顯著差異；1分：右前肢拉金屬網(wǎng)但肌力顯著弱于左側(cè)；2分：右前肢不能拉金屬網(wǎng)。③將動物置光滑平面上，觀察側(cè)向推擋阻力。0分：雙側(cè)推擋阻力無顯著差異；1分：右側(cè)推擋阻力顯著弱于左側(cè)；2分：右推大鼠時其向右側(cè)傾倒。④大鼠左眼上瞼下垂，左眼分泌物增多者評2分。以上4項評分相加為神經(jīng)功能評分。

2.3.2 抓力測定 分別于大鼠造模前一晚斷食前，以及術(shù)后1、3、7 d，使用抓力測定儀進(jìn)行抓力測定。實驗者左手提鼠尾，右手輕輕握住大鼠的背部，將大鼠前肢輕輕放到T型拉桿上，左手沿著與拉桿垂直方向拉鼠尾，此時大鼠前肢會緊緊抓住T型拉桿，逐漸加大力量，直到大鼠的前肢從T型拉桿上脫離，儀器自動記錄大鼠在這個過程中的抓力最大值。重復(fù)3次，取其均值，計算大鼠抓力下降率[（術(shù)前抓力-術(shù)后抓力）÷術(shù)前抓力×100%]。

2.3.3 血清孕酮和促腎上腺皮質(zhì)激素含量檢測 術(shù)后7 d，將大鼠麻醉后進(jìn)行腹主動脈采血，靜置1～2 h，3000 r/min離心15 min，取血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。ELISA檢測血清孕酮和ACTH含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS8.2統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析或非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 黃芩苷對模型大鼠神經(jīng)功能評分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能受損，神經(jīng)功能評分顯著升高，且各個時間點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；與模型組比較，黃芩苷組大鼠神經(jīng)功能術(shù)后3 d有所恢復(fù)，術(shù)后7 d明顯恢復(fù)（P<0.05）；與黃芩苷組比較，抑制劑組黃芩苷神經(jīng)功能保護(hù)作用降低，術(shù)后7 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 黃芩苷對模型大鼠雙前肢抓力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠雙前肢抓力顯著減小，抓力下降率在各個時間點顯著增大（P<0.001）；與模型組比較，黃芩苷組抓力在術(shù)后3 d有所恢復(fù)，術(shù)后7 d明顯恢復(fù)（P<0.05）；與黃芩苷組比較，抑制劑組抓力恢復(fù)受到抑制，術(shù)后7 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 黃芩苷對模型大鼠血清孕酮水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清孕酮水平有一定程度降低；與模型組比較，黃芩苷組大鼠血清孕酮水平顯著升高（P<0.01）；與黃芩苷組比較，抑制劑組血清孕酮水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表3。

4.4 黃芩苷對模型大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清ACTH水平有所升高；與模型組比較，黃芩苷組大鼠血清ACTH水平有一定程度升高；與黃芩苷組比較，抑制劑組大鼠血清ACTH水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表4。

5 討論endprint

缺血性腦損傷是腦血管疾病中常見的一類疾病，2012年，衛(wèi)生部調(diào)査結(jié)果顯示，我國40歲以上腦卒中人口超過1000萬，并且呈現(xiàn)年輕化的趨勢，其中缺血性腦卒中占80%。而現(xiàn)有的治療方法和措施，并未明顯改變?nèi)毖阅X卒中致死率、致殘率和復(fù)發(fā)率極高的現(xiàn)狀。

孕酮是一種類固醇激素，主要在腎上腺、卵巢和胎盤合成；同時它也是一種神經(jīng)甾體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)均能合成。無論男性還是女性，其體內(nèi)孕酮大部分都是由腎上腺在ACTH的作用下產(chǎn)生和釋放的，而男性循環(huán)血中的孕酮起源于腎上腺[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，孕酮能夠發(fā)揮減少腦梗死的體積、減輕腦水腫、改善神經(jīng)功能及促進(jìn)血管再生等腦保護(hù)作用[4-6]。但孕酮在以往的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有很多不良反應(yīng)[13-15]。

黃芩具有悠久的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[16]。黃芩苷是黃芩中含量最多的黃酮類物質(zhì)[17]，現(xiàn)代藥理研究表明，黃芩苷具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等作用[18-21]。

溴隱亭是多巴胺激動劑，能夠抑制ACTH的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致孕酮在腎上腺中的產(chǎn)生和釋放減少。本實驗結(jié)果顯示，治療7 d后，黃芩苷發(fā)揮顯著的腦保護(hù)作用，同時大鼠血清孕酮水平升高；應(yīng)用溴隱亭抑制孕酮生成后，黃芩苷的腦保護(hù)作用降低，大鼠血清孕酮水平降低。說明黃芩苷發(fā)揮對缺血性腦損傷雄性大鼠的腦保護(hù)作用可能與其促進(jìn)孕酮的生成有關(guān)。而模型組與假手術(shù)組比較，血清孕酮水平出現(xiàn)降低趨勢，可能是由于孕酮在參加腦保護(hù)的過程中被消耗，血清ACTH水平出現(xiàn)升高趨勢，兩者變化趨勢并不完全一致，可能與機體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上，本實驗通過觀察黃芩苷對缺血性腦損傷雄性大鼠的腦保護(hù)作用及其對血清孕酮水平的影響，明確了黃芩苷發(fā)揮腦保護(hù)作用與其調(diào)控孕酮的生成有關(guān)。孕酮腦保護(hù)作用的研究已經(jīng)相當(dāng)成熟，且其在急性創(chuàng)傷性腦損傷方面的研究已通過了Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗，但孕酮的不良反應(yīng)成為其最終應(yīng)用于臨床的阻礙。黃芩苷作為天然藥物黃芩的主要成分，不良反應(yīng)較少，有望作為孕酮的替代藥物在臨床上應(yīng)用。

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（收稿日期：2016-12-12）

（修回日期：2017-01-22；編輯：華強）endprint