崔曼莉，葉文廣，王景杰，張明鑫 （第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安710038）

miR-302b在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義

崔曼莉，葉文廣，王景杰，張明鑫 （第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安710038）

目的：檢測不同結(jié)腸組織（結(jié)腸癌、癌旁組織、結(jié)腸腺瘤性息肉組織）中miR-302b的表達(dá)差異，明確其與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系．方法：采用實時熒光定量PCR（qRTPCR）檢測30例結(jié)腸腺瘤組織和60對結(jié)腸癌及其癌旁組織中miR-302b的表達(dá)，分析結(jié)腸癌中miR-302b表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系．結(jié)果：miR-302b在結(jié)腸癌組織、腺瘤性息肉、癌旁組織的表達(dá)依次升高，且各組間表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）．在結(jié)腸癌中，miR-302b在不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組間表達(dá)有顯著差異（P＜0．05）．結(jié)論：miR-302b在結(jié)腸癌中低表達(dá)，提示其可能發(fā)揮抑癌基因的功能．

miR-302b；結(jié)腸癌；表達(dá)；臨床相關(guān)性

0 引言

microRNA（miRNA）在多種生理及病理過程中發(fā)揮重要作用，是近年來研究的熱點［1-2］．其在腫瘤也發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控不同的靶基因在增殖、凋亡、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等中扮演癌基因或者抑癌基因的角色［3-4］．課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌中miR-302b表達(dá)顯著下調(diào)，生存分析顯示其低表達(dá)是食管鱗癌不良預(yù)后的獨立風(fēng)險因子，功能學(xué)分析證實miR-302b可通過結(jié)合ERBB4的3’-非編碼區(qū)下調(diào)ERBB4的表達(dá)，進(jìn)而抑制增殖和侵襲，并促進(jìn)凋亡，從而發(fā)揮抑癌基因功能．miRNAs在不同類型腫瘤中可能靶向不同的靶基因，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，而未見在結(jié)腸癌中有關(guān)miR-302b的文獻(xiàn)報道．因此，本研究通過應(yīng)用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測結(jié)腸癌、癌旁組織、腺瘤性息肉組織中miR-302b的表達(dá)變化，同時分析miR-302b的表達(dá)變化與結(jié)腸癌患者的分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、性別等臨床病理參數(shù)的關(guān)系，從而探討miR-302b在結(jié)腸癌中的可能作用．

1 材料和方法

1．1 材料本研究收集2013-01／2015-12第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院行結(jié)腸癌根治術(shù)或者腸鏡下結(jié)腸息肉切除術(shù)的標(biāo)本，術(shù)后病理診斷證實為結(jié)腸癌或腺瘤性息肉．所有患者均簽署知情同意書，且術(shù)前均未接受化療、放療及其他針對腫瘤的特殊治療．共收集結(jié)腸癌患者60例，其中男39例，女21例，平均年齡40歲，腺瘤性息肉患者30例，其中男20例，女10例，平均年齡47歲．對診斷為結(jié)腸癌的病例切除原發(fā)灶后，在距結(jié)腸癌組織邊緣＞5 cm處切取組織，記為癌旁組織．所有標(biāo)本切除后室溫放置時間不超過10 min，均經(jīng)DEPC-PBS沖洗后迅速置于液氮中保存．

1．2 方法

1．2．1 組織總RNA的提取及濃度測定 按照TRIzol總RNA抽提方法提取組織的總 RNA，然后通過RNeasy mini kit RNA試劑盒分離純化總RNA溶液．所提取總 RNA均經(jīng) NanoDrop?ND-1000測定在260 nm、280 nm和230 nm的分光光度吸收值，應(yīng)用公式計算RNA濃度并評估純度．

1．2．2 qRT-PCR檢測miR-302b在不同組織中的表達(dá)變化 應(yīng)用qRT-PCR進(jìn)行miR-302b表達(dá)的定量檢測［5］，以U6作為內(nèi)參，引物序列見文獻(xiàn)［5］，每個樣本設(shè)置4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次．應(yīng)用2-△△GT法對qRT-PCR的結(jié)果進(jìn)行分析．以結(jié)腸癌為例，癌miR-302b／癌旁組織miR-302b的相對含量（%）＝2-△△CT，-△△GT＝［miR-302bCt-U6Ct］癌旁-［miR-302bCt-U6Ct］結(jié)腸癌．

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理用獨立樣本t檢驗分析不同結(jié)腸組織中miR-302b的表達(dá)差異變化．對于結(jié)腸癌中miR-302b的表達(dá)變化，通過平均表達(dá)值作為截點將結(jié)腸癌患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，應(yīng)用χ2檢驗法分析miR-302b在不同臨床病理指標(biāo)中的表達(dá)差異．所有的檢驗均為雙側(cè)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 腺瘤性息肉、結(jié)腸癌組織及癌旁組織的病理結(jié)果所有腺瘤性息肉、結(jié)腸癌組織及癌旁組織的診斷均通過手術(shù)后病理報告確診或經(jīng)結(jié)直腸鏡病理活檢證實，部分患者病理結(jié)果見圖1．

圖1 部分患者病變組織的病理結(jié)果（HE染色×200）

2．2 miR-302b在不同結(jié)腸組織內(nèi)的表達(dá)變化通過RT-PCR檢測miR-302b在腺瘤性息肉、結(jié)腸癌組織內(nèi)與癌旁組織內(nèi)的表達(dá)，結(jié)果顯示：miR-302b在腺瘤性息肉中的表達(dá)顯著低于癌旁組織（P＜0．05），而結(jié)腸癌組織中的表達(dá)則顯著低于癌旁組織和腺瘤性息肉（P＜0．05，圖2）．

圖2 miR-302b在不同組織的表達(dá)

2．3 結(jié)腸癌中miR-302b在不同臨床病理參數(shù)間的表達(dá)差異結(jié)腸癌患者60例中，低表達(dá)組45例，高表達(dá)組15例．結(jié)果表明：miR-302b在更低分化、有淋巴轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著低于分化較好、無淋巴轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（P＜0．05）；而在不同年齡、性別、腫瘤大小和T分期組間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05，表2）．

表2 miR-302b的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

miRNAs在腫瘤中的作用及意義受到了越來越多的關(guān)注和報道．miR-302b屬于 miR-302基因簇，miR-302基因簇共有5個成員，分別為miR-367、miR-302a、miR-302b、miR-302c和 miR-302d，由于miR-302a-d含有共同的種子區(qū)（5’-aagugcu-3’），故最初的研究常將miR-302a-d放在一起研究．研究表明，miR-302-367簇主要通過抑制靶基因蛋白質(zhì)的翻譯，通過促進(jìn)間質(zhì)上皮化、調(diào)控細(xì)胞分化等方式誘導(dǎo)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞，在維持干細(xì)胞干性中發(fā)揮重要作用［7-8］．最新研究表明，miR-302-367簇的靶基因主要為干細(xì)胞相關(guān)蛋白OCT4、NANOG、SOX1和SHH，通過轉(zhuǎn)錄后抑制上述蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的集落形成，發(fā)揮抑癌基因功能［9］．進(jìn)一步的研究證實miR-302s在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的功能［10］．但后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，miR-302s家族在不同腫瘤中功能存在差異，主要是因為一個miRNA可靶向多個靶基因，而不同腫瘤類型中靶基因的表達(dá)豐度存在差異，而且miR-302a-d序列仍存在差異，靶基因雖然有很多重疊，但是還存在一些差異．因此，有必要將四者區(qū)分開來．

課題組持續(xù)關(guān)注miR-302b在腫瘤中的作用，首次發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中miR-302b表達(dá)下調(diào)，是不良預(yù)后的獨立風(fēng)險因子，且可通過靶向ErbB4抑制增殖和侵襲并促進(jìn)凋亡［5］．我們還發(fā)現(xiàn)miR-302b在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，其他研究也顯示miR-302b在胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌基因功能，但其在結(jié)腸癌中的表達(dá)及意義未見相關(guān)報道［11-15］．

結(jié)腸癌常經(jīng)歷結(jié)腸炎-息肉-腺瘤性息肉-結(jié)腸癌的進(jìn)展過程，本研究通過比較miR-302b在不同結(jié)腸組織的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著組織的異性程度的加重，即從正常-腺瘤-癌的過程中miR-302b表達(dá)呈進(jìn)行性的下調(diào)，提示miR-302b的低表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)．進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-302b的表達(dá)水平越低，腫瘤分化程度越差，存在淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能性越大，TNM分期越晚．提示miR-302b是腫瘤抑制因子，在結(jié)腸癌可能發(fā)揮抑癌基因功能．

根據(jù)已經(jīng)明確的miR-302b的靶基因，如E2F1、CDK2、ERBB4等，均在結(jié)腸癌中發(fā)揮癌基因功能，結(jié)腸癌miR-302b表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其靶向的大量癌基因表達(dá)上調(diào)，通過一系列信號通路誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生［15-17］．此外，結(jié)腸癌及結(jié)腸腺瘤中miR-302b的表達(dá)是否具有診斷及預(yù)后意義，也需要進(jìn)一步的研究和臨床驗證．

［1］Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al．Cancer incidence and mortality worldwide：sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012［J］．Int J Cancer，2015，136（5）：E359-E386．

［2］Chen W，Zheng R，Baade PD，et al．Cancer statistics in China，2015［J］．CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132．

［3］Hollis M，Nair K，Vyas A，et al．MicroRNAs potential utility in colon cancer：Early detection，prognosis，and chemosensitivity［J］．World J Gastroenterol，2015，21（27）：8284-8292．

［4］Rupaimoole R，Slack FJ．MicroRNA therapeutics：towards a new era for the management of cancer and other diseases［J］．Nat Rev Drug Discov，2017，16（3）：203-222．

［5］Zhang M，Yang Q，Zhang L，et al．miR-302b is a potential molecular marker of esophageal squamous cell carcinoma and functions as a tumor suppressor by targeting ErbB4［J］．J Exp Clin Cancer Res，2014，33：10．

［6］張鵬江，崔曼莉，張 超，等．炎癥相關(guān)細(xì)胞因子對食管癌細(xì)胞株miR-302b表達(dá)的影響［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016，24（5）：690-693．

［7］Suh MR，Lee Y，Kim JY，et al．Human embryonic stem cells express a unique set of microRNAs［J］．Dev Biol，2004，270：488-498．

［8］Rosa A，Brivanlou AH．A regulatory circuitry comprised of miR-302 and the transcription factors OCT4 and NR2F2 regulates human embryonic stem cell differentiation［J］．EMBO J，2011，30（2）：237-248．

［9］Fareh M，Turchi L，Virolle V，et al．The miR 302-367 cluster drastically affects self-renewal and infiltration properties of glioma-initiating cells through CXCR4 repression and consequent disruption of the SHH-GLI-NANOG network［J］．Cell Death Differ，2012，19（2）：232-244．

［10］Lin SL，Chang DC，Ying SY，et al．MicroRNA miR-302 inhibits the tumorigenecity ofhuman pluripotentstem cellsby coordinate suppression of the CDK2 and CDK4／6 cell cycle pathways［J］．Cancer Res，2010，70（22）：9473-9482．

［11］馬明銘，張明鑫．miR-302b在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23（19）：2741-2743．

［12］Liu FY，Wang LP，Wang Q，et al．miR-302b regulates cell cycles by targeting CDK2 via ERK signaling pathway in gastric cancer［J］．Cancer Med，2016，5（9）：2302-2313．

［13］Wang L，Yao J，Zhang X，et al．miRNA-302b suppresses human hepatocellular carcinoma by targeting AKT2［J］．Mol Cancer Res，2014，12（2）：190-202．

［14］Ge T，Yin M，Yang M，et al．MicroRNA-302b suppresses human epithelial ovarian cancer cell growth by targeting RUNX1［J］．Cell Physiol Biochem，2014，34（6）：2209-2220．

［15］Cataldo A，Cheung DG，Balsari A，et al．miR-302b enhances breast cancer cell sensitivity to cisplatin by regulating E2F1 and the cellular DNA damage response［J］．Oncotarget，2016，7（1）：786-797．

［16］Williams CS，Bernard JK，Demory Beckler M，et al．ERBB4 is over-expressed in human colon cancerand enhancescellular transformation［J］．Carcinogenesis，2015，36（7）：710-718．

［17］Sulzyc-Bielicka V，Domagala P，Bielicki D，et al．E2F1／TS Immunophenotype and Survival of Patients with Colorectal Cancer Treated with 5FU-Based Adjuvant Therapy［J］．Pathol Oncol Res，2016，22（3）：601-608．

［18］Lim TG，Lee SY，Huang Z，et al．Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2［J］．Cancer Prev Res（Phila），2014，7（4）：466-474．

The expression and significance of miR-302b in colon cancer tissues

CUI Man-Li，YE Wen-Guang，WANG Jing-Jie，ZHANG Ming-Xin Department of Gastroenterology，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi’an 710038，China

AIM：To analyze the expression of miR-302b in adenomatous polyps（AP）and colon cancer（CC）compared with non-tumor adjacent tissues（NAT），and to investigate the clinical relevance of miR-302b expression in CC．METHODS：Expression of miR-302b was detected by quantitative real time PCR（qRT-PCR）in 30 AP patients and 60 paired CC patients with NAT．In CC tissues，the relationship between miR-302b expression and clinical features were analyzed．RESULTS：The expression level of miR-302b in CC was significantly lower than that of AP，and the expression of miR-302b in AP was lower than that of NAT，with statistically significant differences（P＜0．05）．Then，the low expression of miR-302b was significantly related to tumor differentiation，lymph node metastasis，distant metastasis，and TNM stage．CONCLUSION：miR-302b lowly expressed in CC，which revealed that implicating it might play as a tumor suppressor gene in the CC development．

miR-302b；colon cancer；expression；clinical relevance

R735．3

A

2095-6894（2017）05-34-03

2017-04-03；接受日期：2017-04-26

國家自然基金項目（81302055）

崔曼莉．碩士，主治醫(yī)師．研究方向：消化道腫瘤．E-mail：cuiml1587＠163．com

張明鑫．博士，副主任醫(yī)師．研究方向：消化道腫瘤．E-mail：zmx3115＠163．com