周 萌，唐倩倩，劉 婷，郭劍鋒 （華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢430022）

基于DNA甲基化的宮頸癌基因治療進展

周 萌，唐倩倩，劉 婷，郭劍鋒 （華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢430022）

宮頸癌是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一．研究表明伴隨遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變的HPV感染，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展以及惡變密不可分，而DNA甲基化正是這個復(fù)雜的癌變過程中很早發(fā)生，并且最頻繁的一系列分子行為，其改變隨著疾病進展而積累，目前已被認為是惡性宮頸癌的先兆，并被提議用于宮頸癌的早期監(jiān)測、診斷和預(yù)后評估．本文主要討論DNA甲基化對于臨床上宮頸癌基因治療的意義．

DNA甲基化；宮頸癌；基因治療

0 前言

宮頸癌是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，據(jù)GLOBOCAN統(tǒng)計，每年有近53萬宮頸癌新發(fā)病例，超過26萬患者因此失去了生命，其中85%以上來自發(fā)展中國家．在中國，由于宮頸篩查工作的不完善及女性對宮頸疾病的忽視，每年新增發(fā)病人數(shù)超過13萬，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的73%～93%，更占據(jù)了約全球新發(fā)病例的1／4．值得注意的是，由于環(huán)境污染和生活中的不良衛(wèi)生習(xí)慣，原本多發(fā)于50歲左右的女性宮頸癌，如今也“盯上”了年輕女性．分子流行病學(xué)研究已明確顯示HPV感染與宮頸癌有著密切聯(lián)系［1］．

宮頸癌的發(fā)展是由正常上皮到低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial leision，LSIL）、LSIL到高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial leision，HSIL），再到宮頸原位癌（carcinoma in situ，CIS），最后形成轉(zhuǎn)移癌．感染高危型HPV對于宮頸癌的來說是一個關(guān)鍵但不充分的條件［2-3］．研究表明伴隨遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變的HPV感染與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及惡變密不可分，而DNA甲基化正是這個復(fù)雜的癌變過程中發(fā)生很早并且最頻繁的一系列分子行為．DNA甲基化改變隨著疾病進展而積累，目前已被認為是惡性宮頸癌的先兆，并被提議用于宮頸癌的早期監(jiān)測、診斷和預(yù)后評估［4］．

1 DNA甲基化

DNA甲基化是甲基基團在一系列DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)移至CpG二核苷酸胞嘧啶第五位點［5-7］，在原核生物及真核生物，甚至病毒中都起著調(diào)控基因表達的重要作用［8］，但有研究證明即使DNA不具備CpG位點，也能發(fā)生甲基化，只是程度會小得多［8-9］．哺乳動物70%～80%的CpG胞嘧啶都有經(jīng)過甲基化［10］．在正常細胞中，DNA甲基化影響著基因表達調(diào)控、染色質(zhì)激活／失活狀態(tài)的控制、組織特異性表達以及基因印記［11］．而在腫瘤細胞中，一方面，基因啟動子區(qū)域的DNA超甲基化可以導(dǎo)致抑癌基因失活；另一方面，普遍的DNA低甲基化又會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加和細胞轉(zhuǎn)化［12-13］．可見，無論是DNA的超甲基化還是低甲基化都在宮頸癌發(fā)展過程中頻繁發(fā)生，引起復(fù)雜的基因錯誤表達，包括致癌基因激活，抑癌基因失活，轉(zhuǎn)座因子活動，印記丟失等，加劇了基因組的不穩(wěn)定性和癌癥發(fā)生［14］．

2 宮頸癌和低甲基化

DNA的低甲基化是在包括癌癥在內(nèi)的許多疾病早期便存在并且頻繁發(fā)生的重要基因激活機制．寄生序列、轉(zhuǎn)座因子、致癌基因和原癌基因等被激活帶來的甲基化導(dǎo)致了基因組不穩(wěn)定性加劇和癌癥的發(fā)生［15-16］．在早期的研究中，通過與正常樣本進行對照，Kim等［17］已證明宮頸癌和宮頸發(fā)育異常均與逐步發(fā)生的普遍DNA低甲基化有關(guān)．據(jù)報道，由于低甲基化所導(dǎo)致頻繁發(fā)生的雜合性丟失與印記丟失也發(fā)生在宮頸癌中［18］．Flowler等［19］的研究表明宮頸癌基因組的確與普遍的DNA低甲基化有關(guān)，而后者又與葉酸水平相關(guān)．大量的研究表明宿主基因組和HPV基因組在宮頸癌發(fā)生過程中都經(jīng)歷了低甲基化．Badal等［20］證明HPV基因組超甲基化可抑制瘤性轉(zhuǎn)化，而低甲基化卻能促進癌癥發(fā)生．Missaoui等［21］的研究表明盡管癌前病變和正常人的甲基化水平差距甚微，但侵襲性宮頸癌樣本卻有明顯的低甲基化．

3 宮頸癌與超甲基化

CpG島和啟動子區(qū)域的DNA超甲基化是基因沉默的重要機制，也是宮頸癌發(fā)生過程中的一類頻繁并且早期出現(xiàn)的分子事件［22］．在宮頸癌中，抑癌基因的失活與從低度鱗狀上皮內(nèi)病變到轉(zhuǎn)移癌的每一步變化都緊密相連．過去幾十年的表觀遺傳學(xué)研究已經(jīng)證明DNA甲基化改變是宮頸癌的重要致病因素，能用于其早期監(jiān)測、診斷、預(yù)后以及新治療方法的發(fā)展［22］．事實上已經(jīng)證明超甲基化和基因沉默可干擾不受HPV感染影響的多條信號通路，涉及到細胞增殖、凋亡、細胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細胞連接、血管再生、侵襲和轉(zhuǎn)移［22］．

4 宮頸癌與甲基化的臨床應(yīng)用

一些研究已經(jīng)表明，基因的異常甲基化在宮頸癌發(fā)生的較早階段就出現(xiàn)了，可用來作為早期檢測的生物標(biāo)記物．近來研究已明確鱗狀細胞癌和腺癌中確定的甲基化模式，使之成為用于疾病分級和預(yù)后評估的合理選擇［23］．Thangavelu等［24］發(fā)現(xiàn)COL17A1啟動子在乳腺癌中超甲基化，而在宮頸癌中低甲基化．COL17A1啟動子的甲基化狀態(tài)準(zhǔn)確地預(yù)測了基因錯誤表達的方向和包括宮頸癌在內(nèi)的五種上皮癌侵襲性的增加．這意味著COL17A1啟動子甲基化的狀態(tài)可用來預(yù)測患者結(jié)局，而且，針對COL17A1的表觀遺傳預(yù)示著能阻止患者癌灶轉(zhuǎn)移的新方法．

4．1 甲基化的早期監(jiān)測作用由于HPV可以被機體的免疫反應(yīng)清除出體內(nèi)，所以HPV感染并不都會導(dǎo)致宮頸癌，因此很有必要發(fā)展具有高度敏感性和特異性的選擇性標(biāo)記物，找出DNA甲基化特征將得到最佳臨床效果．表觀遺傳改變被認為遠早于遺傳學(xué)改變，并在癌癥的發(fā)生、進展及惡變過程中扮演了非常重要的角色［25］．另外，異常的DNA甲基化早在低度鱗狀上皮內(nèi)病變時就有發(fā)生，因此可以單獨或與現(xiàn)有監(jiān)測方法聯(lián)合用于宮頸癌早期診斷［22］，該方法已被證實可以增加現(xiàn)有監(jiān)測方法的敏感性和特異性．

與宮頸癌發(fā)生有關(guān)并且早期即發(fā)生DNA甲基化的例子有：CADM1、CACNA2D2、C13ORF18、DAPK1、MAI、MGMT、miR124-2、JAM3、PAX1、PCDHA4、PCDHA13、JAM3、RASSF1A、RAR-β2、SOX9、VIM［26-31］．這些基因中某些基因的超甲基化可以在血、尿以及脫落細胞樣本中檢測到．DNA甲基化檢測、HPV篩查及細胞學(xué)監(jiān)測一起可以作為宮頸癌早期檢查的有效方法．

4．2 甲基化的預(yù)后作用盡管目前宮頸癌的診斷是基于陰道鏡、MRI及CT等多重檢查手段的結(jié)果，但要預(yù)測藥物治療的敏感性卻仍相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性［32-33］．一些學(xué)者認為異常的DNA甲基化可被有效運用于抗癌藥物敏感性預(yù)測及預(yù)后評估．例如：Banno等［34］證明了CHFR基因超甲基化可作為預(yù)測紫杉醇在宮頸腺癌治療敏感性的敏感性標(biāo)記物．抗癌藥物伊立替康（CRT-11）的敏感性是由Werner DNA解旋酶基因（WRN基因）的甲基化決定的；WRN基因被證明在人類宮頸鱗癌和腺癌細胞系中超甲基化并沉默，抑制WRN基因表達可以增加CRT-11的抗癌效果［35］．宮頸癌 DNA甲基化調(diào)節(jié)基因中 APC1A、CHD1、CHD13、CACNA2D2、COX-2、DKK3、HPV-L1、LRIG1、MYOD1、RASSF1A、RASSF2、VIM有很明顯的預(yù)后意義［29，36-44］．除了甲基化調(diào)節(jié)基因，某些基因的異常表達在宮頸癌中也具有預(yù)后意義．例如：CD44v6、COX-2、CXCR7、EGFR、HIF-1α、MYC、survivin和XRCC1已被當(dāng)作宮頸癌的主要治療靶向，它們的高水平表達導(dǎo)致宮頸癌細胞對鉑類藥物反應(yīng)不佳［45-46］．盡管還未被結(jié)論性地證明，這些基因卻很可能是通過DNA甲基化而得到調(diào)節(jié)．目前，針對HIF-1α的拓撲替康正處于宮頸癌治療的第1和第2臨床試驗階段［47-48］．超甲基化基因在宮頸癌的預(yù)后總結(jié)于表1．

表1 超甲基化基因在宮頸癌的預(yù)后總結(jié)

4．3 甲基化與表觀遺傳治療與遺傳學(xué)改變不同，表觀遺傳改變的可逆性使得將它應(yīng)用與疾病早期監(jiān)測、診斷、療效及預(yù)后評估成為可能．表觀遺傳的可逆性可用來恢復(fù)癌細胞對化療藥物的敏感性［49］．目前，放化療聯(lián)合是宮頸癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，即在進行放療時聯(lián)用一種放射增敏劑——順鉑［50］．目前用于表觀遺傳的藥物分為兩類：核苷類似物和非核苷類似物．①核苷類似物整合于DNA，并通過構(gòu)成共價鍵封鎖DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，現(xiàn)階段正試驗用于惡性血液病治療［51］．②非核苷類似物通過結(jié)合催化亞基封鎖DNA甲基轉(zhuǎn)移酶并限制其表達［52］．一些研究表明在宮頸癌細胞系的治療中通過啟動子超甲基化可使沉默基因復(fù)活，Zambrano等［53］通過對4名患者管理肼苯噠嗪產(chǎn)生了APC和MGMT的去甲基化．ER，GSTP1，DAPK，RAR-β，F(xiàn)HIT以及p16INK4A這些基因中至少有一個發(fā)生去甲基化，程度如下：0 mg／d，40%；75 mg／d，52%；100 mg／d，43%；150 mg／d，32%．肼苯噠嗪劑量在50～100 mg／d之間的耐受性很好，達到明顯的去甲基化效應(yīng)以及在不改變普遍甲基化水平下的基因復(fù)活．Tanaka等［54］的研究則表明宮頸鱗狀細胞癌對于SN38的耐藥性可通過去甲基化藥物治療恢復(fù)敏感性．除此之外，去甲基化藥物的細胞治療也可使宮頸癌細胞對順鉑敏感［55-56］．綜上所述，表觀遺傳藥物作為放療增敏劑或化療增敏劑具有巨大的潛力．

5 結(jié)論

不論是HPV還是宿主細胞基因組，在宮頸癌各個階段都發(fā)生著大量表觀遺傳改變，包括普遍的低甲基化、關(guān)鍵腫瘤抑癌基因的超甲基化和組蛋白修飾．識別這些異常甲基化的基因可以生成非侵襲性生物標(biāo)記物以用于早期監(jiān)測、診斷、治療方案的選擇、評估療效以及新治療方法的探索．DNA甲基化標(biāo)記物及甲基化程度千差萬別，目前我們?nèi)匀狈σ粋€穩(wěn)定的甲基化基因模版以應(yīng)用于臨床．因此，新的甲基化標(biāo)記物需要被識別、監(jiān)測、實踐．一方面需要增加利用現(xiàn)有去甲基化藥物的臨床探索試驗，借用甲基化譜分析識別應(yīng)答因子及毒副作用．另一方面是要找出宮頸癌特異性的表觀遺傳驅(qū)動因子，然后對嚴(yán)格篩選后的患者行臨床試驗．這些標(biāo)記物在目前宮頸癌監(jiān)測和預(yù)后評估方面的應(yīng)用很可能促進宮頸癌的個性化治療及達到更好的臨床結(jié)局．我們可以期待DNA去甲基化在未來的宮頸癌治療中將占據(jù)一席之地．由于甲基化監(jiān)測試驗簡單快速，穩(wěn)定可靠，易于實現(xiàn)和理解，可以提供高度敏感和特異的信息．因此，我們需要后續(xù)的研究來闡明用于宮頸癌早期監(jiān)測、診斷、預(yù)后評估及新治療方法設(shè)計的標(biāo)記物以更好地管理宮頸癌患者．對這些表觀遺傳改變的進一步研究將加深我們對宮頸癌的理解．另外，探索新的表觀遺傳改變標(biāo)記物的實驗正在進行中，這些將用于疾病監(jiān)測．伴隨DNA甲基化及組蛋白脫乙酰酶抑制劑，表觀遺傳的可逆性使得表觀遺傳治療前景大好．

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R737．33

A

2095-6894（2017）05-70-04

2017-02-07；接受日期：2017-02-23

周 萌．E-mail：535911946＠qq．com

郭劍鋒．副主任醫(yī)師，副教授．E-mail：jianfguo＠outlook．com