王琳，李新鳳，徐玉梅，暢引東，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

山西省植物病原鐮孢菌種群分布及遺傳變異分析

王琳，李新鳳，徐玉梅，暢引東，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

【目的】通過(guò)對(duì)鐮孢菌（Fusarium）ITS、EF-1α和β-tubulin 3個(gè)基因序列比較分析，篩選適合于鐮孢菌種類鑒定的基因序列，并以此序列分析山西省植物病原鐮孢菌種群分布及遺傳變異情況?！痉椒ā繌?013—2015年在山西省11市28縣（區(qū)）采集分離的625株鐮孢菌菌株中選取形態(tài)學(xué)清晰的菌株進(jìn)行ITS、EF-1α和β-tubulin基因序列聯(lián)合分析，運(yùn)用 Sequencher軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接和校對(duì)，將測(cè)序結(jié)果與 NCBI及FUSARIUM-ID數(shù)據(jù)庫(kù)中所有已公布的序列進(jìn)行 BLAST分析，結(jié)合下載概念清晰或標(biāo)準(zhǔn)種序列，運(yùn)用 ClustalX 和GelDoc軟件進(jìn)行序列對(duì)齊和編輯，運(yùn)用MEGA、Excel、DNAstar和TaxonGap軟件分析鐮孢菌種內(nèi)種間遺傳變異情況，從ITS、EF-1α和β-tubulin中篩選適合鐮孢菌種類鑒定的基因序列，并以此序列分析山西省鐮孢菌的種群分布特點(diǎn)等?！窘Y(jié)果】在3個(gè)候選基因序列中，EF-1α基因序列是最適用于鐮孢菌種類鑒定的基因序列，其種間平均遺傳距離分別是種內(nèi)平均遺傳距離的24倍，種內(nèi)差異小于種間差異的種的數(shù)量最多，達(dá)到供試種的73%，物種鑒定準(zhǔn)確率最強(qiáng)，達(dá)到87%?；贓F-1α基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，在供試的 27種鐮孢菌中，有 22種表現(xiàn)出單系性，相同種的不同菌株以較高支持率聚成獨(dú)立支。在 27種鐮孢菌中，F(xiàn). oxysporum是山西省鐮孢菌的優(yōu)勢(shì)種，分離頻率最高（22.1%），且分布最廣，在23個(gè)縣（區(qū)）均有分布；其次是F. solani（13.8%），在14個(gè)縣（區(qū)）有分布。從不同地區(qū)鐮孢菌的種群結(jié)構(gòu)及分布來(lái)看，運(yùn)城、臨汾、忻州、長(zhǎng)治、呂梁、晉中和太原均以F. oxysporum為優(yōu)勢(shì)種，朔州以F. lateritium為優(yōu)勢(shì)種，大同以F. solani為優(yōu)勢(shì)種，晉城以F. verticillioides為優(yōu)勢(shì)種，陽(yáng)泉以F. incarnatum為優(yōu)勢(shì)種；其中晉中和忻州的鐮孢菌種類最豐富，臨汾次之，朔州最少。從不同寄主鐮孢菌的種群結(jié)構(gòu)及分布來(lái)看，番茄上鐮孢菌的種類最多（15種），其次是馬鈴薯（13種）和大豆（12種）；番茄、黃瓜、西瓜、馬鈴薯、茄子、西葫蘆和甘藍(lán)，均以F. oxysporum為優(yōu)勢(shì)種，大豆和玉米以F. verticillioides為優(yōu)勢(shì)種，小麥以F. avenaceum和F. graminearum為優(yōu)勢(shì)種?！窘Y(jié)論】鐮孢菌種內(nèi)種間存在豐富的遺傳變異，其中 EF-1α基因序列的遺傳變異最適用于鐮孢菌種類的鑒定，但形態(tài)學(xué)種和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種不完全吻合。F. oxysporum是山西省鐮孢菌的優(yōu)勢(shì)種，不同地區(qū)、不同寄主上鐮孢菌種群存在明顯的遺傳分化；研究結(jié)果可為鐮孢菌的分類鑒定、DNA條形碼篩選、檢驗(yàn)檢疫及其綜合防治提供理論依據(jù)。

鐮孢菌；種群分布；種內(nèi)種間差異；遺傳變異；系統(tǒng)發(fā)育分析

0 引言

【研究意義】鐮孢菌是一類重要的植物病原菌，它可侵染誘發(fā)多種植物的萎蔫、根腐以及腐爛病等，對(duì)人類生產(chǎn)生活影響極大。由于鐮孢菌的多型性與易變異等特點(diǎn)，使得其被認(rèn)為是所有真菌類群中在形態(tài)分類上最難鑒定的屬之一[1]。而正確識(shí)別并鑒定其種類是鐮孢菌各個(gè)研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)[2]，因此，在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，選擇準(zhǔn)確的特異性分子鑒定方法，對(duì)鐮孢菌的鑒定具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定相結(jié)合的方法已在鐮孢菌分類鑒定中得到了廣泛應(yīng)用[3-4]，但微乎其微的形態(tài)學(xué)差異以及單一序列信息的局限性，仍使鐮孢菌屬種的鑒定面臨諸多困難。DIEPENINGEN 等[5]曾證實(shí)多基因位點(diǎn)聯(lián)合分析能更準(zhǔn)確對(duì)物種進(jìn)行鑒定。所以采取多基因位點(diǎn)聯(lián)合分析，是解決鐮孢菌屬種鑒定的有效途徑，篩選適合的基因序列片段并明確其在鑒定中的特異性和適用性，是首先需要解決的一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題。目前，有關(guān)利用多基因位點(diǎn)聯(lián)合分析對(duì)鐮孢菌種進(jìn)行鑒定的研究有些報(bào)道，曾莉莎等[6]評(píng)價(jià)了ITS、TEF-1α、IGS、histone H3、β-tubulin 等5個(gè)基因片段在香蕉枯萎病菌生理小種鑒定上的應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)TEF-1α、IGS和histone H3等3個(gè)基因片段可用于香蕉枯萎病菌生理小種鑒定；王容燕等[7]利用ITS、TEF-1α和β-tubulin 3個(gè)基因片段實(shí)現(xiàn)了對(duì)甘薯鐮孢菌腐爛與潰瘍病的病原菌鑒定。這些研究主要是用于少量鐮孢菌種和生理小種的鑒定，利用多基因位點(diǎn)聯(lián)合分析方法進(jìn)行較大范圍的鐮孢菌種類鑒定和種群分布研究尚無(wú)系統(tǒng)詳細(xì)的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】山西省地形獨(dú)特，氣候特殊，作物種類繁雜，因此鐮孢菌引起的病害數(shù)量和分布種類亦多。多年來(lái)，研究者對(duì)山西省多種植物病原鐮孢菌做了大量的分類鑒定基礎(chǔ)工作[8-12]，但往往都只是采用形態(tài)學(xué)鑒定的方法，針對(duì)局部范圍或局限在某一類寄主上，有關(guān)采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子鑒定方法分析山西省各地區(qū)的鐮孢菌種群分布情況的研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取ITS、EF-1α和β-tubulin 3個(gè)候選基因，從種內(nèi)種間差異、遺傳距離頻率分布和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)等方面，對(duì)鐮孢菌的種內(nèi)種間遺傳變異及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)3個(gè)候選基因在鐮孢菌種類鑒定上的適用性，從中篩選適合鐮孢菌種類鑒定的基因序列，對(duì)山西鐮孢菌進(jìn)行分子鑒定，并分析山西省鐮孢菌種群分布特點(diǎn)和遺傳分化情況，為今后開(kāi)展鐮孢菌的分類鑒定、篩選DNA條形碼、檢驗(yàn)檢疫以及病害診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及序列信息

供試菌株共27種43株，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供（所提供的菌株采集于2013 —2015年間，從山西省11個(gè)市共28個(gè)縣（區(qū)）的罹病植物分離獲得，分離部位包括果實(shí)、種子、莖部、根部、穗部、葉部等，并經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定），以Neonectria ramulariae為外群；供試序列共124條，其中自測(cè)序列39條，下載序列85條。供試菌株及序列詳細(xì)信息見(jiàn)附表1。

1.2 模板DNA的制備

菌體獲得：將活化后的鐮孢菌單孢菌株接種于查彼培養(yǎng)液中[13]，于25℃，150—200 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)5 d后，用真空抽濾泵抽濾菌絲，用無(wú)菌超純水沖洗2遍，置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，回收備用。

鐮孢菌基因組DNA制備：DNA提取采用CTAB 法[14]，于凝膠成像儀（WD-9413A，ABI）內(nèi)檢測(cè)DNA質(zhì)量，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2802S，ABI）檢測(cè)DNA濃度，貯存于-20℃冰箱中備用。

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR反應(yīng)在BIO-RAD C1000 PCR儀上進(jìn)行，所用引物信息見(jiàn)表 1，反應(yīng)體系及條件參考趙鵬等[20]，并稍加改動(dòng)。PCR產(chǎn)物經(jīng) BigDye Terminator Ready Reaction Mix v3.1（Applied Biosystems，USA）純化，使用ABI 3730型基因分析儀進(jìn)行雙向測(cè)序，由上海生工生物股份有限公司完成。

表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物Table 1 Primers used for PCR amplification and sequencing

1.4 序列編輯及比對(duì)

用Sequencher 5.2.2（Gene Codes Corp.）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)拼接，用ClustalX 1.81[21]進(jìn)行序列比對(duì)，GelDoc[22]將比對(duì)結(jié)果進(jìn)行編輯。登陸 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）及 FUSARIUMID數(shù)據(jù)庫(kù)（http://fusarium.cbio.psu.edu/），將 ITS、EF-1α和β-tubulin測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有已公布的序列進(jìn)行BLAST分析。

1.5 序列數(shù)據(jù)分析

下載概念清晰或標(biāo)準(zhǔn)種的相關(guān)序列，結(jié)合本研究形態(tài)學(xué)清晰的5種13株菌株，基于ITS、EF-1α和β-tubulin 3個(gè)候選基因，共15種34株102條序列，以Neonectria ramulariae為外群，使用MEGA4.0.2[23]軟件，分析序列特征，以 P-distancs模型計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離[24]，結(jié)合Excel 2010分析種內(nèi)種間遺傳距離的頻率分布情況[25]，應(yīng)用DNAstar 7.1.0[26]（Lasergene，WI，USA）計(jì)算遺傳相似性矩陣，將結(jié)果輸入TaxonGap[27]分析種內(nèi)種間序列差異情況，分析鐮孢菌種內(nèi)種間遺傳變異情況；構(gòu)建鄰接樹(shù)（NJ樹(shù)，neighbor-joining tree），采用自展法進(jìn)行1 000次檢測(cè)分支支持率，選用K2P（Kimura’s two-parameter）模型，系統(tǒng)樹(shù)支持率僅顯示高于50%的數(shù)值，以檢驗(yàn)種的單系性[28]。

1.6 種的鑒定方法

從形態(tài)學(xué)鑒定的種中選取一些代表性菌株，進(jìn)行基于EF-1α基因序列的PCR擴(kuò)增及測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果分別在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和FUSARIUM-ID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并下載同源性較高并來(lái)源可靠的序列，構(gòu)建鄰接樹(shù)。

1.7 山西省鐮孢菌種群分布分析

根據(jù)菌株分離頻率情況對(duì)山西省鐮孢菌優(yōu)勢(shì)種進(jìn)行分析；根據(jù)菌株類型和數(shù)量情況對(duì)不同地區(qū)和不同寄主鐮孢菌種群結(jié)構(gòu)及種群分布進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 ITS、EF-1α和β-tubulin 3個(gè)候選基因序列特征

序列經(jīng)過(guò)拼接、編輯、對(duì)齊和整理后，ITS序列長(zhǎng)度為405—541 bp，EF-1α序列長(zhǎng)度為443—509 bp，β-tubulin序列長(zhǎng)度為330—550 bp；堿基組成具有一定的 G+C含量偏向性；轉(zhuǎn)換/顛換依次為β-tubulin＞EF-1α＞ITS；變異位點(diǎn)依次為β-tubulin ＞EF-1α＞ITS；保守位點(diǎn)依次為 ITS＞β-tubulin＞EF-1α；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)依次為 EF-1α＞β-tubulin＞ITS（表2）。

2.2 基于遺傳相似性的種內(nèi)種間差異分析

基于EF-1α和β-tubulin基因序列分析的最小種間差異分別為3%和1%左右，均發(fā)生在F. graminearum 和F. culmorum之間，最大種間差異均發(fā)生在與外群之間；基于ITS序列分析的最小種間差異接近于0，發(fā)生在F. avenaceum和F. tricinctum之間，最大種間差異發(fā)生在F. lateritium和F. solani之間。ITS、EF-1α 和β-tubulin 3個(gè)候選基因，種內(nèi)差異小于種間差異的種分別達(dá)到供試種的40%（6/15）、73%（11/15）和53%（8/15），而種內(nèi)差異小于種間差異，有利于區(qū)分鑒定物種（圖1）。故EF-1α基因序列是3個(gè)候選基因中最適合用作區(qū)分鑒定鐮孢菌的基因序列。

2.3 基于遺傳距離頻率分布的種內(nèi)種間差異

基于ITS、EF-1α和β-tubulin基因序列分析，遺傳距離范圍分別為0—0.17、0—0.76和0—0.52，種內(nèi)平均遺傳距離分別為0、0.01和0.01，種間平均遺傳距離分別為0.09、0.24和0.18，種間平均遺傳距離分別是種內(nèi)平均遺傳距離的9、24和18倍（圖2）。故EF-1α基因序列是其中種間差異較種內(nèi)差異最大的基因序列。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

由圖3—圖5可看出，分別基于EF-1α、β-tubulin 和ITS基因序列構(gòu)建的NJ樹(shù)均以較高支持率被劃分為4個(gè)Clade（Clade I-IV）?；贓F-1α和β-tubulin序列分別構(gòu)建的 NJ樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，與基于ITS序列構(gòu)建的NJ樹(shù)存在差異，且在個(gè)別種的區(qū)分上三者均存在一定差異。在圖3中，有13個(gè)種表現(xiàn)出單系性，F(xiàn). verticillioides和F. tricinctum雖未表現(xiàn)出單系性，但也與其他種明顯區(qū)分開(kāi)，物種鑒定率達(dá)到87% （13/15）；在圖4中，有11個(gè)種表現(xiàn)出單系性，F(xiàn). tricinctum、F. subglutinans、F. incarnatum 和 F. lateritium 未表現(xiàn)出單系性，物種鑒定率為 73% （11/15）；在圖5中，有10個(gè)種表現(xiàn)出單系性，F(xiàn). verticillioides、F. tricinctum、F. incarnatum、F. graminearum和F. avenaceum未表現(xiàn)出單系性，物種鑒定率為67%（10/15）。綜上所述，EF-1α基因序列是3個(gè)候選基因中區(qū)分鑒定鐮孢菌準(zhǔn)確率最高的基因序列。

表2 序列堿基組成及變異率Table 2 Base composition and variation rate of sequences

圖1 各基因片段的種內(nèi)種間差異比較（使用TaxonGap和DNAstar軟件）Fig. 1 Comparisons of intra- and inter-specific variations of the gene sequence generated by the softwares TaxonGap and DNAstar

圖2 各基因序列種內(nèi)種間遺傳距離的頻率分布Fig.2 Frequency distribution of intra- and inter-specific pairwise distances of the gene sequence generated with MEGA and Excel

圖3 構(gòu)建基于EF-1α序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree inferred from EF-1α sequences

2.5 山西省鐮孢菌種的鑒定

在GenBank和FUSARIUM-ID數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果如表3所示，40株菌株的測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種的 EF-1α基因序列同源性均達(dá) 92%—98%，F(xiàn). aquaeductuum、F. sambucinum var. coeruleum和 F. trichothecioides測(cè)序失敗，未能進(jìn)行比對(duì)。將獲得的40條序列結(jié)合下載的24條同源性序列，以Neonectria ramulariae為外群，共65條序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，EF-1α序列長(zhǎng)度為423—666 bp，堿基組成具有一定的 G+C含量偏向性（52.1%）；轉(zhuǎn)換/顛換值為1.03；變異位點(diǎn)為 551（72.5%）；保守位點(diǎn)為 193（25.4%）；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)為460（60.5%）；自裔位點(diǎn)為90（11.8%）。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖6所示，相同種的不同菌株均能聚在一起，除了 F. tricinctum 和F. acuminatum未聚成獨(dú)立分支外，其余22種的不同菌株均以較高支持率分別聚成獨(dú)立分支，表現(xiàn)出單系性。結(jié)果說(shuō)明，系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種的鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果存在差異。

2.6 山西省鐮孢菌種群分布分析

圖4 構(gòu)建基于β-tubulin序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree inferred from β-tubulin sequences

2.6.1 山西省鐮孢菌分離頻率及地理分布 分離頻率＞8%的有4種，其中最高的為F. oxysporum（22.1%）；其他的依次為F. solani（13.8%）、F. verticillioides（10.1%）、F. incarnatum（8.6%）；分離頻率＞2%的有8種，依次為F. equiseti（6.7%）、F. coeruleum （6.1%）、F. redolens（4.6%）、F. acuminatum（3.4%）、F. lateritium（3.1%）、F. proliferum（2.2%）、F. subglutinans（2.2%）和F. avenaceum（2.1%）；分離頻率＜2%的有 15種，其中 F. heterosporum和 F. trichothecioides均為 1.8%，F(xiàn). sporotrichioides、F. camptoceras、F. ventricosum和F. chlamydosporum均為1.3%，F(xiàn). udum、F. tricinctum、F. culmorum和F. graminearum均為1%，F(xiàn). illudens、F. sambucinum和F. aquaeductuum 均為 0.6%，F(xiàn). sambucinum var. coeruleum 和 F. merismoides均為 0.3%。故 F. oxysporum為山西省鐮孢菌的優(yōu)勢(shì)種（圖7）。

以F. oxysporum分布范圍最廣泛，在23個(gè)縣（區(qū)）均有分布；其次是F. solani和F. incarnatum，分別在14和 13個(gè)縣（區(qū)）均有分布；F. sambucinum var. coeruleum和F. graminearum分布范圍最小，僅在五寨分離到（圖8）。

圖5 構(gòu)建基于ITS序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 5 Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree inferred from ITS sequences

2.6.2 不同地區(qū)鐮孢菌種群結(jié)構(gòu)及分布 運(yùn)城（33.3%）、臨汾（16.1%）、忻州（18.4%）、長(zhǎng)治（27.3%）、呂梁（15.8%）、晉中（23.1%）和太原（46.2%）均以F. oxysporum為主；朔州以F. lateritium為主（60%）；大同以F. solani為主（33.3%）；晉城以F. verticillioides為主（27.3%）；陽(yáng)泉以F. incarnatum為主（50%）（圖 9）。晉中市和忻州市分離到鐮孢菌種類最多（22種），其他依次為臨汾（19種）、呂梁（12種）、長(zhǎng)治（11種）、運(yùn)城和晉城（8種）、大同（7種）、陽(yáng)泉和太原（3種）和朔州（2種）（圖10）。因此，晉中市和忻州市的鐮孢菌種類最豐富，臨汾市次之，朔州市最少。

2.6.3 不同寄主中鐮孢菌種群結(jié)構(gòu)及分布 不同寄主中鐮孢菌種群結(jié)構(gòu)及分布分析如表4所示。由表4可看出，在番茄（果實(shí)）、黃瓜（莖基、根部）和玉米（莖部、穗部、種子）等10個(gè)寄主上均能分離到不同種類的鐮孢菌，分離種和菌株數(shù)量分別占到全部種和菌株數(shù)量的 92.6%和 71.5%。番茄上分離到的鐮孢菌種類最多（15種）；其次是馬鈴薯（13種）、大豆（12種）、黃瓜（6種）和玉米（8種），其余寄主也分離到3—4種。番茄、黃瓜、西瓜、馬鈴薯、茄子、西葫蘆以及甘藍(lán)，均以F. oxysporum為優(yōu)勢(shì)種；大豆和玉米以 F. verticillioides為優(yōu)勢(shì)種，小麥以 F. avenaceum 和 F. graminearum 為優(yōu)勢(shì)種；F. aquaeductuum和F. sambucinum var. coeruleum在上述幾種寄主中未分離到。

表3 基于EF-1α 基因序列的PCR 和分子鑒定結(jié)果Table 3 PCR result and molecular identification based on EF-1α sequences

圖6 基于EF-1α序列構(gòu)建的山西省鐮孢菌鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 6 Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree of Fusarium in Shanxi Province inferred from EF-1α sequences

3 討論

鐮孢菌種內(nèi)種間遺傳變異情況研究顯示，ITS基因序列的鑒定能力最差，且反映出的親緣關(guān)系與形態(tài)學(xué)分類存在差異，這可能與ITS基因序列進(jìn)化相對(duì)保守有關(guān)。有學(xué)者證實(shí)EF-1α序列較ITS序列更能正確區(qū)分鐮孢菌[29-30]，WATANABE[31]也曾評(píng)價(jià) β-tubulin基因序列是識(shí)別鐮孢菌的有效標(biāo)記，這些結(jié)果與本研究的結(jié)果一致。

圖7 山西省鐮孢菌菌株分離頻率Fig. 7 The Fusarium strains extraction frequency in Shanxi Province

圖8 山西省28個(gè)縣（區(qū)）鐮孢菌種群的地理分布Fig. 8 Geological distributions of Fusarium populations in 28 counties (areas) of Shanxi Province

圖9 山西省11個(gè)市鐮孢菌菌株分離頻率Fig. 9 The Fusarium strains extraction frequency in 11 cities of Shanxi Province

表4 山西省鐮孢菌種在不同寄主中的分布Table 4 Distribution of Fusarium species in different hosts in Shanxi Province

基于EF-1α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，形態(tài)學(xué)上差異較大的 F. tricinctum和 F. acuminatum雖然未表現(xiàn)出單系性，但在系統(tǒng)樹(shù)中表現(xiàn)較近的親緣關(guān)系。說(shuō)明形態(tài)學(xué)上的種和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種還是存在一定差異的，因此，在鐮孢菌鑒定時(shí)，在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，應(yīng)結(jié)合分子鑒定才能作出更加準(zhǔn)確的判斷。

山西省不同地區(qū)、不同寄主的鐮孢菌種群結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)種存在差異，說(shuō)明山西省鐮孢菌種群存在明顯的遺傳分化，可能與不同地區(qū)的耕作制度和氣候環(huán)境有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明，山西馬鈴薯以F. oxysporum為優(yōu)勢(shì)種，這與黑龍江[32]和新疆[33]的馬鈴薯干腐病鐮孢菌種群調(diào)查結(jié)果相似，但在優(yōu)勢(shì)種上存在差異，這可能與地域和氣候差異有關(guān)；大豆上以F. verticillioides為優(yōu)勢(shì)種，其次為 F. oxysporum、F. solani和 F. coeruleum，魏巍等[34]也曾報(bào)道過(guò)上述4種鐮孢菌為大豆根際土壤鐮孢菌優(yōu)勢(shì)種群，與本研究結(jié)果一致；黃瓜上分獲了 6種鐮孢菌，以 F. oxysporum和 F. solani為優(yōu)勢(shì)種群，與東北三省[35-36]等地的調(diào)查結(jié)果一致。

圖10 山西省11個(gè)市鐮孢菌種類及菌株數(shù)量Fig. 10 The species and amounts of Fusarium strains in 11 cities of Shanxi Province

本研究?jī)H從不同地區(qū)和不同寄主上的鐮孢菌種群結(jié)構(gòu)及分布進(jìn)行了研究，而且采集的地理范圍和寄主范圍有限，因此在今后的研究中，需要進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍，以使其結(jié)果更加全面準(zhǔn)確，同時(shí)應(yīng)對(duì)鐮孢菌年度間的種群結(jié)構(gòu)變化加以分析，以便更加準(zhǔn)確地了解其變化動(dòng)態(tài)。

4 結(jié)論

從基于ITS、EF-1α和β-tubulin 3個(gè)基因的序列分析可看出，鐮孢菌種內(nèi)種間存在豐富的遺傳變異，其中EF-1α基因序列的遺傳變異最適用于鐮孢菌種類的鑒定?；贓F-1α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，分子鑒定的結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果存在差異，所以在鐮孢菌種的鑒定中，采用形態(tài)學(xué)結(jié)合EF-1α基因序列分子鑒定的方法，更能提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。F. oxysporum是山西省鐮孢菌的優(yōu)勢(shì)種，不同地區(qū)、不同寄主上鐮孢菌種群存在明顯的遺傳分化。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Analysis of Population Distribution and Genetic Variation of Plant Pathogenic Fusarium in Shanxi Province

WANG Lin, LI XinFeng, XU YuMei, CHANG YinDong, WANG JianMing
(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi)

【Objective】The objectives of this study are to obtain the sequences of ITS, EF-1α and β-tubulin gene regions from plant pathogen, Fusarium spp., compare the suitable gene sequences for species identification, and to analyze the populationdistribution and genetic variation of Fusarium spp. in Shanxi Province by using the suitable gene sequences. 【Method】 A total of 625 Fusarium strains were collected from 28 counties and 11 cities in Shanxi Province from 2013 to 2015. The ITS, EF-1α and β-tubulin gene fragments of the morphology of clear strains from 625 strains were sequenced and analyzed. The sequences were assembled and edited using Sequencher software, then blasted in GenBank in NCBI and FUSARIUM-ID databases. The sequences from the clearly documented and reference species were downloaded. All the sequences were aligned and edited manually using ClustalX and GelDoc. The inter- and intra-specific variations of Fusarium spp. were analyzed with MEGA, Excel, DNAstar and TaxonGap. All the three gene sequences consisting of ITS, EF-1α and β-tubulin were selected for the taxonomy of the Fusarium species and then the best optimal fragment genes were used in the analysis of the population distributions of Fusarium spp. in Shanxi Province. 【Result】EF-1α was the best gene fragment for identifying Fusarium species among the three candidate gene fragments. Intra-specific pairwise distances was 24 times higher than that of the inter-specific pairwise distances. The intra-specific variation was smaller than those of the inter-specific variation by 73% of the tested species. The accuracy rate for identification was the highest, reached 87%. The phylogenetic relationships derived from the EF-1α sequences showed that different strains in 22 of 27 Fusarium species were monophyly, clustering in a same clade with high supporting values. Among the 27 species of Fusarium, F. oxysporum was the dominant species with 22.1% frequency and covered the largest geographical distribution in the 23 counties or regions in Shanxi Province. Followed by F. solani with 13.8% in 14 counties or regions. The results of population distribution of Fusarium in different geographical regions in Shanxi Province showed that F. oxysporum was the dominant species in Yuncheng, Linfen, Xinzhou, Changzhi, Lüliang, Jinzhong and Taiyuan city; F. lateritium was the dominant species in Shuozhou, F. solani in Datong, F. verticillioides in Jincheng and F. incarnatum in Yangquan. Among the different regions in Shanxi Province, the most abundant Fusarium species was in Jinzhong and Xinzhou, followed by Linfen, and the least distribution was in Shuozhou. The results of the population distribution of Fusarium from different hosts showed that the 15 Fusarium species extracted from Lycopersicon esculentum, 13 species from Solanum tuberosum and 12 from Glycine max. In these hosts, F. oxysporum was the dominant species in Lycopersicon esculentum, Cucumis sativus, Citrullus lanatus, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Cucurbita pepo and Brassica oleracea. F. verticillioides was the dominant species in Glycine max and Zea mays. F. avenaceum and F. graminearum were the dominant species in Triticum aestivum. 【Conclusion】There are abundant genetic variation between interand intra-specific of Fusarium. Of the three gene regions, EF-1α is the most suitable region for Fusarium species identification. Fusarium morphological taxonomy results are not fully agreed with the molecular phylogenetic results using EF-1α sequences. F. oxysporum is the dominant Fusarium species in Shanxi Province. There are obvious genetic variations of Fusarium populations in different districts and hosts. The research results will provide a theoretic and scientific basis for Fusarium taxonomy, DNA barcode screening, quarantine and integrated control.

Fusarium; population distribution; intra- and inter-specific variation; genetic variation; phylogenetic analysis

2017-01-25；接受日期：2017-03-27

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20120311019-3）、山西省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（1105-0104）

聯(lián)系方式：王琳，E-mail：wwll0621@163.com。通信作者王建明，E-mail：jm.w@163.com