趙小明，賈盼,2，勾昕,2，劉衛(wèi)敏，馬恩波，張建珍

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

飛蝗內(nèi)表皮蛋白基因LmAbd-5的表達(dá)與功能分析

趙小明1，賈盼1,2，勾昕1,2，劉衛(wèi)敏1，馬恩波1，張建珍1

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

【目的】基于飛蝗（Locusta migratoria）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得內(nèi)表皮蛋白（endocuticle structural glycoprotein）基因LmAbd-5的cDNA序列，分析該基因的序列特征和mRNA表達(dá)特性，采用RNAi方法分析其生物學(xué)功能，探討其在飛蝗表皮形成中的作用，為害蟲防治提供新的分子靶標(biāo)?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W(xué)方法搜索飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得LmAbd-5 cDNA全長(zhǎng)序列并克隆驗(yàn)證；采用SignalP在線軟件分析蛋白的信號(hào)肽，利用SMART網(wǎng)站預(yù)測(cè)其功能域，使用MEGA 7.0軟件中neighbor-joining（NJ）方法，與其他昆蟲同源序列進(jìn)行聚類分析；采用reverse-transcription quantitative PCR（RT-qPCR）方法檢測(cè)LmAbd-5在飛蝗5齡第2天若蟲不同組織部位和5齡不同發(fā)育時(shí)期體壁組織中的表達(dá)情況，揭示其組織和時(shí)期表達(dá)模式；采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)及透射電鏡技術(shù)（TEM）觀察沉默LmAbd-5后對(duì)飛蝗生長(zhǎng)發(fā)育和表皮結(jié)構(gòu)的影響?！窘Y(jié)果】通過搜索得到LmAbd-5 cDNA全長(zhǎng)序列并進(jìn)行了克隆和測(cè)序驗(yàn)證，獲得520 bp全長(zhǎng)cDNA序列，其中ORF為303 bp；基因結(jié)構(gòu)分析顯示該基因含有3個(gè)外顯子；功能域分析發(fā)現(xiàn)其含有1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin binding domain 4，ChtBD4），與沙漠蝗、白蟻、赤擬谷盜等的Abd-5結(jié)構(gòu)類似；BLAST分析結(jié)果表明Abd-5在昆蟲中高度保守，飛蝗與沙漠蝗Abd-5序列一致度高達(dá)81%；對(duì)其保守基序進(jìn)行WebLogo分析發(fā)現(xiàn)LmAbd-5屬于表皮蛋白CPR家族中的RR-1亞類；聚類分析結(jié)果顯示，LmAbd-5與沙漠蝗和白蟻的Abd-5顯示出較近的親緣關(guān)系；RT-qPCR結(jié)果顯示LmAbd-5在前腸、后腸、氣管和體壁等由外胚層形成的組織中高表達(dá)，而在胃盲囊、中腸、馬氏管、脂肪體和翅芽中低表達(dá)或不表達(dá)；不同時(shí)期表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，LmAbd-5在4齡若蟲蛻皮后0—72 h（5齡早期）具有高表達(dá)，其中蛻皮后72 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量，隨后表達(dá)量急劇降低（96—168 h），其表達(dá)時(shí)期與內(nèi)表皮形成時(shí)間一致；采用RNAi技術(shù)分析該基因的生物學(xué)功能，對(duì)5齡第2天若蟲分別注射等量的dsLmAbd-5和dsGFP（對(duì)照），發(fā)現(xiàn)注射dsLmAbd-5的5齡若蟲和對(duì)照組相同，均可正常蛻皮，發(fā)育至成蟲第2天目的基因表達(dá)量顯著降低，但未出現(xiàn)肉眼可見的異常表型。分別取成蟲第2天處理組和對(duì)照組成蟲表皮進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，處理組成蟲內(nèi)表皮片層結(jié)構(gòu)較為疏松，導(dǎo)致內(nèi)表皮片層變厚，最終表現(xiàn)為整個(gè)內(nèi)表皮變厚?！窘Y(jié)論】根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析獲得1個(gè)CPR家族表皮蛋白LmAbd-5，該蛋白含有1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域ChtBD4，屬于RR-1亞類；LmAbd-5主要在外胚層起源的組織中高表達(dá)，沉默LmAbd-5后飛蝗沒有肉眼可見的表型，但超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其參與飛蝗內(nèi)表皮片層結(jié)構(gòu)的形成。

飛蝗；表皮蛋白；LmAbd-5；RNAi；透射電鏡

0 引言

【研究意義】中國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)生物災(zāi)害頻發(fā)、生態(tài)環(huán)境脆弱的農(nóng)業(yè)大國(guó)，毀滅性的農(nóng)作物病蟲害頻繁暴發(fā)，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失與環(huán)境破壞。飛蝗（Locusta migratoria）作為世界性農(nóng)業(yè)害蟲，具有暴發(fā)性、群集性和遷飛性等特點(diǎn)，蝗災(zāi)發(fā)生面積廣，致災(zāi)嚴(yán)重。因此，對(duì)飛蝗的研究和蝗災(zāi)的綜合治理對(duì)經(jīng)濟(jì)和民生發(fā)展具有重要意義。昆蟲體壁具有重要的保護(hù)作用和生理功能，能夠保護(hù)蟲體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，是抵御外界環(huán)境的第一道防線，在抵御水分蒸發(fā)和應(yīng)對(duì)外界不良環(huán)境的影響等方面起著重要作用。表皮蛋白是昆蟲體壁的重要組成成分，其成分的缺失或含量變化都可引起表皮功能異常，從而影響昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，從飛蝗表皮蛋白分子特性和生理功能入手，探索表皮蛋白在飛蝗表皮結(jié)構(gòu)中的作用，可篩選蝗蟲防治新分子靶標(biāo)，從而為蝗災(zāi)有效治理提供新的思路和方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲體壁具有保護(hù)和防御等功能，在生命過程中發(fā)揮著重要作用。昆蟲體壁由上表皮、原表皮（內(nèi)表皮和外表皮）和真皮細(xì)胞構(gòu)成，昆蟲蛻皮包括皮層溶離和蛻去舊表皮兩個(gè)連續(xù)的過程，昆蟲表皮在蛻皮液作用下首先發(fā)生皮層溶離，最先形成表皮質(zhì)層，然后形成上表皮和外表皮，在上表皮開始沉積的同時(shí)，舊表皮逐漸被消化，在舊表皮蛻去后開始合成內(nèi)表皮[1-3]。原表皮主要成分是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)，它們隨蛻皮過程而周期性的合成和降解。幾丁質(zhì)是一種多糖類物質(zhì)，是由N-乙酰胺基葡糖以β-l,4糖苷鍵組成的線性生物聚合物，從真菌界到節(jié)肢動(dòng)物門都大量存在[4]。在自然界中，幾丁質(zhì)與結(jié)構(gòu)蛋白、酶和抗菌蛋白序列中的幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin-binding domains，CBDs）以非共價(jià)鍵形式結(jié)合形成糖蛋白，糖蛋白在外表皮中經(jīng)鞣化后形成堅(jiān)固穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。昆蟲表皮蛋白（insect cuticular proteins，ICP）是結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)幾丁質(zhì)結(jié)合域的不同可分為兩類：第一類幾丁質(zhì)結(jié)合域?yàn)镽&R consensus（Rebers and Riddiford consensus），具有RR-1、RR-2、RR-3 等 3種形式[5-6]，此類表皮蛋白富含組氨酸，缺失半胱氨酸一段68個(gè)氨基酸的序列，也稱為CPR家族。隨著果蠅（Drosophila melanogaster）、家蠶（Bombyx mori）和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）等模式昆蟲全基因組測(cè)序相繼完成，ICP的鑒定也隨之展開。學(xué)者已在黑腹果蠅[7]、赤擬谷盜[8]、家蠶[9]和煙草天蛾（Manduca sexta）[10]等昆蟲基因組中分別鑒定獲得101、102、148和207個(gè)屬于CPR家族的表皮蛋白。目前含有R&R consensus結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)[5,11]。另一類幾丁質(zhì)結(jié)合域是含有6個(gè)半胱氨酸殘基，形成3個(gè)二硫鍵的保守序列，稱為the type 2 chitin-binding domain （ChtBD2 domain），此類表皮蛋白主要存在于昆蟲表皮和圍食膜中[12-13]。目前，對(duì)昆蟲CPR家族表皮蛋白的研究中，以家蠶、果蠅和赤擬谷盜等模式昆蟲的研究較為深入，如日本學(xué)者從翅原基化蛹前cDNA庫中隨機(jī)選出cDNA進(jìn)行序列測(cè)定，鑒定了10種不同的表皮蛋白基因，命名為BmWCPs[14]，韓國(guó)全南國(guó)立大學(xué)Yasuyuki Arakane課題組以赤擬谷盜為對(duì)象，研究鞘翅中高豐度的表皮蛋白功能[15-18]，這些研究為表皮蛋白在昆蟲變態(tài)發(fā)育和表皮形成過程的作用機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)。然而，盡管國(guó)內(nèi)外多個(gè)課題組正在開展表皮蛋白在昆蟲表皮重塑過程中的作用及其機(jī)制研究，但尚未在超微結(jié)構(gòu)水平開展昆蟲內(nèi)外表皮蛋白的作用機(jī)制研究工作?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】20世紀(jì)90年代，JESPERSEN等通過質(zhì)譜分析方法從飛蝗和沙漠蝗（Schistocerca gregaria）的腹部表皮中分別鑒定出了1個(gè)內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)糖蛋白（endocuticle structural glycoprotein），分別命名為L(zhǎng)mAbd-5和SgAbd-5，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了初步分析[19]，然而其生物學(xué)功能尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】了解飛蝗蛻皮過程中內(nèi)外表皮的形成規(guī)律，合理設(shè)計(jì)取樣點(diǎn)研究LmAbd-5在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性，明確該基因的表達(dá)與內(nèi)表皮形成的相關(guān)性。進(jìn)一步采用 RNAi技術(shù)和透射電鏡技術(shù)分析其對(duì)飛蝗內(nèi)表皮發(fā)育的影響，為篩選新型分子靶標(biāo)提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2015—2016年在山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)ハx：將筆者實(shí)驗(yàn)室保存的飛蝗蟲卵置于人工氣候箱內(nèi)孵化，待其孵化為1齡若蟲后轉(zhuǎn)移至紗籠內(nèi)置于人工氣候箱中，控制人工氣候箱內(nèi)環(huán)境：溫度為（30±2）℃，相對(duì)濕度為（40±10）%，光周期為14 h﹕10 h（L﹕D），以新鮮小麥苗飼喂，3齡后開始輔以麥麩飼喂。

試驗(yàn)試劑：RNAisoTMPlus，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑購自TaKaRa公司；pMD18 Cloning Kit購自TransGen Biotech公司；SYBR?Premix EX TaqTM購自TaKaRa公司；PCR Master Mix購自天根公司；E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit試劑盒購于Omega公司；T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒購于Promega公司。

1.2 LmAbd-5序列搜索及cDNA全長(zhǎng)序列獲得

在筆者實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，通過NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)、分析，確定LmAbd-5的cDNA部分序列。根據(jù)已報(bào)道的飛蝗翅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫對(duì)LmAbd-5 cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析[20]，獲得cDNA全長(zhǎng)序列并設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證（引物見表1，由上海生工生物公司合成），序列已上傳至 NCBI （GenBank登錄號(hào)：KX503039）。LmAbd-5的cDNA序列用ExPASy網(wǎng)站translate tool翻譯后（http://web. expasy.org/translate/），SignaIp4.1Server對(duì)其信號(hào)肽進(jìn)行分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/），利用SMART分析其結(jié)構(gòu)域（http://smart. embl-heidelberg. de/），利用WebLogo進(jìn)行保守基序分析（http://weblogo. berkeley.edu/logo.cgi）。

1.3 昆蟲Abd-5系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

從NCBI網(wǎng)站下載昆蟲Abd-5氨基酸序列，使用MEGA 7.0軟件中neighbor-joining（NJ）方法，將飛蝗LmAbd-5的氨基酸序列與其他昆蟲Abd-5進(jìn)行聚類分析，進(jìn)行1 000次獨(dú)立分析，數(shù)值代表bootstrap估算值。用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的物種和 Abd-5的GenBank登錄號(hào)見表2。

1.4 LmAbd-5 組織部位和發(fā)育時(shí)期表達(dá)特性

1.4.1 LmAbd-5的組織特異性表達(dá) 選用發(fā)育整齊的飛蝗5齡第2天若蟲，雌、雄各半，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭蟲體，解剖體壁、前腸、胃盲囊、中腸、后腸、馬氏管、氣管、脂肪體和翅芽等9個(gè)組織部位，凍存于液氮中。利用RNAisoTMPlus提取試劑（TaKaRa公司）提取上述不同組織的總RNA，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取 RNA的質(zhì)量，Nanodrop 2000對(duì)總RNA進(jìn)行定量，然后以1 μg總RNA為模板，依據(jù)TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑說明書合成cDNA模板。采用RT-qPCR檢測(cè)LmAbd-5在飛蝗不同組織部位的表達(dá)情況，RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR?Premix EX TaqTM10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板（20×）2 μL，上下游引物2 μL（2 μmol·L-1），補(bǔ)dH2O 至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線程序?yàn)锳BI Prism 7300 SDS 1.1軟件自動(dòng)添加。采用ABI Prism 7300 SDS 1.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄，以β-actin作為內(nèi)參（KX276642），引物見表1（由上海生工生物公司合成）。

1.4.2 LmAbd-5在飛蝗5齡若蟲體壁不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性 解剖5齡剛蛻皮（0 h）、蛻皮后24、48、72、96、120、144 和168 h若蟲的第2、3腹節(jié)處體壁，并凍存于液氮中，4頭蟲體為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)3個(gè)重復(fù)?？俁NA提取和cDNA模板合成、反應(yīng)體系及方法同1.4.1。采用RT-qPCR檢測(cè)LmAbd-5在飛蝗5齡若蟲體壁不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性，引物見表1（由上海生工生物公司合成）。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

表2 本研究中用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的物種和Abd-5的GenBank登錄號(hào)Table 2 Species and GenBank accession number for phylogenetic tree used in this study

1.5 基于RNAi和透射電鏡技術(shù)的生物學(xué)功能分析

根據(jù)LmAbd-5和綠色熒光蛋白（GFP）的cDNA序列，設(shè)計(jì)合成雙鏈引物。使用PCR Master Mix（天根公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：12.5 μL PCR Master Mix，5 μL引物（上游/下游，2 μmol·L-1，引物見表1），2 μL表皮cDNA，加去離子水至25 μL，PCR程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，72℃延伸10 min。產(chǎn)物用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit按照說明書進(jìn)行回收，然后參照 T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒說明書體外合成dsRNA。隨機(jī)挑選發(fā)育整齊的飛蝗5齡第2天若蟲進(jìn)行 dsRNA注射，每頭蟲體注射 10 μg dsRNA，對(duì)照組注射等量dsGFP，每組注射30頭蟲體。正常飼喂至成蟲第2天，觀察表型并剪取腹部第2、3腹節(jié)表皮，同一蟲體的表皮一部分用于提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，RT-qPCR檢測(cè)沉默效率，另一部分（每頭蟲體均取相同部位）經(jīng)3%戊二醛固定，用于透射電鏡觀察，透射電鏡樣品切片制備和染色等工作委托青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室完成。

1.6 數(shù)據(jù)分析

LmAbd-5的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析[21]，采用student t-test方法進(jìn)行表達(dá)差異分析，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 LmAbd-5的cDNA序列及基因結(jié)構(gòu)分析

基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組搜索獲得 1條 LmAbd-5基因Unigene序列。根據(jù)已報(bào)道的飛蝗翅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫對(duì)LmAbd-5 cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得cDNA全長(zhǎng)序列并進(jìn)行克隆驗(yàn)證。結(jié)果顯示，該基因 cDNA序列全長(zhǎng)為520 bp，ORF長(zhǎng)303 bp，編碼100個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為4.58，分子量為10.7 kD，是一種偏酸性小分子量的表皮蛋白。結(jié)合飛蝗基因組序列對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[22]，結(jié)果顯示該基因含有3個(gè)外顯子，與大多數(shù)物種表皮蛋白基因結(jié)構(gòu)類似[9]，第1外顯子阻斷信號(hào)肽（圖1-A）；將得到的LmAbd-5基因編碼的氨基酸進(jìn)行功能域分析，發(fā)現(xiàn)其含有1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域ChtBD4（圖1-B）。

圖1 LmAbd-5基因結(jié)構(gòu)和序列分析Fig. 1 Gene structure and sequence analysis of LmAbd-5

2.2 LmAbd-5蛋白結(jié)構(gòu)域分析、序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

LmAbd-5的全長(zhǎng)氨基酸序列信息及功能域分析見圖 2，結(jié)果顯示飛蝗與沙漠蝗、白蟻和赤擬谷盜等Abd-5類似，不同的是沙漠蝗SgAbd-5僅為部分序列，缺少信號(hào)肽（圖2-A）；通過NCBI進(jìn)行BLAST分析顯示飛蝗 LmAbd-5與沙漠蝗 SgAbd-5高度同源，氨基酸序列一致度高達(dá)81%，其中幾丁質(zhì)結(jié)合域序列完全一致（39—94 aa），與白蟻Abd-5一致度次之（70%），而與赤擬谷盜 Abd-5序列一致度較差（52%）（圖2-B）。將其保守基序進(jìn)行WebLogo分析發(fā)現(xiàn)，LmAbd-5屬于表皮蛋白 CPR家族中的RR-1亞類，該基因的RR-1基序與前人在家蠶、按蚊和赤擬谷盜等昆蟲中研究的 RR基序在關(guān)鍵氨基酸的位點(diǎn)上是保守的，但 RR基序之外的氨基酸位點(diǎn)變化較大（圖2-C）。

從NCBI網(wǎng)站下載不同物種Abd-5氨基酸序列，物種名和登錄號(hào)如表2所示，主要包括雙翅目、鱗翅目、鞘翅目、蜚蠊目和直翅目昆蟲。將得到的飛蝗LmAbd-5全長(zhǎng)序列與其他物種Abd-5氨基酸全長(zhǎng)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類分析結(jié)果顯示，雙翅目和鱗翅目的Abd-5蛋白分別聚為一支，鞘翅目?jī)H有赤擬谷盜一個(gè)Abd-5蛋白，直翅目飛蝗LmAbd-5與沙漠蝗、蜚蠊目白蟻的Abd-5聚為一支，并且與沙漠蝗Abd-5有最近的親緣關(guān)系（圖3）。

2.3 LmAbd-5的組織部位和發(fā)育時(shí)期表達(dá)特性

為了探討LmAbd-5在飛蝗不同組織部位和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性，首先利用 RT-qPCR方法對(duì)LmAbd-5在飛蝗5齡第2天若蟲不同組織部位表達(dá)進(jìn)行了分析（圖4）。結(jié)果顯示LmAbd-5在飛蝗前腸、后腸、氣管和體壁等由外胚層形成的組織中高表達(dá)，而在胃盲囊、中腸、馬氏管、脂肪體和翅芽中低表達(dá)或不表達(dá)（圖4-A），表明LmAbd-5可能參與表皮的形成；其次，選用5齡不同發(fā)育時(shí)期體壁組織進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)LmAbd-5在4齡若蟲蛻皮后0—72 h（5齡早期）具有高表達(dá)，其中蛻皮后72 h達(dá)到最大表達(dá)量，隨后表達(dá)量急劇降低（蛻皮后96—168 h）（圖4-B），LmAbd-5的表達(dá)時(shí)期與內(nèi)表皮形成時(shí)間一致，推測(cè)其可能參與飛蝗內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)的形成。

圖2 LmAbd-5蛋白結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)和RR-1基序分析Fig.2 Domain structure and alignment of LmAbd-5 and analysis of RR-1 motifs

圖3 LmAbd-5與其他昆蟲Abd-5的系統(tǒng)聚類分析Fig. 3 The phylogenetic analysis of LmAbd-5 and Abd-5 from different insect species

圖4 LmAbd-5在飛蝗 5 齡若蟲期不同組織部位和不同時(shí)期的表達(dá)Fig. 4 The relative expression of LmAbd-5 in different tissues and different stages of the 5th instar nymphs

2.4 基于RNAi的LmAbd-5生物學(xué)功能分析

為了探討LmAbd-5在飛蝗表皮形成中的作用，體外合成dsRNA并向5齡第2天若蟲分別注射等量的dsLmAbd-5和dsGFP（對(duì)照），正常飼養(yǎng)至蛻皮后，觀察成蟲表型并檢測(cè)沉默效率（圖5-A），發(fā)現(xiàn)注射dsLmAbd-5的5齡若蟲和對(duì)照組相同，均能正常蛻皮，盡管目的基因在成蟲第2天表達(dá)量顯著降低（處理組LmAbd-5表達(dá)量顯著降低了85.5%），但未出現(xiàn)肉眼可見的異常表型。分別取處理組和對(duì)照組蛻皮至成蟲第2天表皮進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果表明與對(duì)照組相比，注射 dsLmAbd-5的成蟲內(nèi)表皮片層結(jié)構(gòu)疏松，導(dǎo)致內(nèi)表皮片層變厚，使得整個(gè)內(nèi)表皮變厚（圖5-B）。

3 討論

昆蟲表皮具有保護(hù)和防御等功能，在昆蟲生命過程中發(fā)揮著重要作用。昆蟲表皮由上表皮、外表皮、內(nèi)表皮和細(xì)胞層構(gòu)成，各層表皮的成分和機(jī)械性能不同[23]，其中上表皮和外表皮主要在蛻皮前合成和沉積，內(nèi)表皮是在蛻皮后合成和沉積。昆蟲表皮的主要成分是由幾丁質(zhì)和大量表皮蛋白構(gòu)成，其中CPR家族是最大的表皮蛋白家族，包括RR-1、RR-2 和RR-3等3種類型，在雙翅目、鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目和直翅目等昆蟲中均有發(fā)現(xiàn)[6]。早在1988年，REBERS等[24]最先鑒定了CPR家族保守基序（R&R motif）G-x(8)-G-x(6)-Y-x-A-x-E-x-GY-x(7)-P-x(2)-P（x表示氨基酸，括弧內(nèi)的數(shù)字為該處x的數(shù)目）。

圖5 注射dsLmAbd-5后LmAbd-5的相對(duì)表達(dá)量和蛻皮至成蟲第2天的表皮超微結(jié)構(gòu)觀察Fig. 5 The relative expression of LmAbd-5 and ultrastructure observation of day 2 adult cuticle after injected with dsRNA in 5th instar nymphs

20世紀(jì)90年代，NOHR等[25]利用雙向電泳技術(shù)，發(fā)現(xiàn)飛蝗內(nèi)外表皮蛋白組成具有明顯的差異性。隨后，ANDERSEN[26]利用MALDI-MS技術(shù)，從沙漠蝗中分析鑒定出 8個(gè)內(nèi)表皮蛋白，分別命名為 SgAbd-1、SgAbd-2、SgAbd-3、SgAbd-4、SgAbd-5、SgAbd-6、SgAbd-8和 SgAbd-9。隨著昆蟲基因組學(xué)的發(fā)展，越來越多昆蟲的Abd-5被鑒定，如雙翅目、鱗翅目、鞘翅目、蜚蠊目和直翅目等昆蟲。然而，在這些昆蟲中，Abd-5僅僅是序列被報(bào)道，具體功能尚未見深入研究。

本研究克隆獲得飛蝗內(nèi)表皮蛋白基因LmAbd-5，其編碼的蛋白含有一個(gè)RR-1保守基序，屬于CPR家族中 RR-1亞類。組織分布研究發(fā)現(xiàn)，其主要在外胚層形成的組織中高表達(dá)，如前腸、后腸、氣管和體壁，而在胃盲囊、中腸、馬氏管、脂肪體和翅芽中低表達(dá)或不表達(dá)，表明 LmAbd-5可能參與表皮的形成；發(fā)育研究顯示其主要在蛻皮后72 h內(nèi)具有高表達(dá)，而在96 h后表達(dá)急劇降低。飛蝗蛻皮后0—72 h是內(nèi)表皮完全形成的時(shí)期，之后皮層出現(xiàn)溶離，新表皮開始合成。因此，LmAbd-5的表達(dá)與飛蝗內(nèi)表皮合成和沉積時(shí)期一致，表明LmAbd-5可能是一種內(nèi)表皮蛋白，參與昆蟲內(nèi)表皮的形成。有研究發(fā)現(xiàn)，RR-1亞類的表皮蛋白主要存在于柔軟和具有韌性的水化角質(zhì)層中，如雙翅目和鱗翅目昆蟲幼蟲表皮和節(jié)間膜以及飛蝗的內(nèi)表皮[27]，昆蟲內(nèi)表皮中的幾丁質(zhì)和表皮蛋白通過共價(jià)鍵與氫鍵結(jié)合，不被鞣化。CPR家族的保守RR基序具有幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，能夠結(jié)合幾丁質(zhì)，已在部分昆蟲研究中得到證實(shí)[11-13]。而飛蝗表皮蛋白LmAbd-5是否能結(jié)合幾丁質(zhì)仍有待于進(jìn)一步研究。

目前，RNAi技術(shù)是研究基因生物學(xué)功能的有效工具，筆者課題組利用RNAi在飛蝗幾丁質(zhì)合成、降解和表皮蛋白家族等方面開展了大量工作[28-30]。飛蝗對(duì)RNAi極為敏感，本研究采用RNAi技術(shù)對(duì)飛蝗5齡第2天若蟲分別注射等量的dsLmAbd-5和dsGFP（對(duì)照），正常飼養(yǎng)觀察飛蝗表皮發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)注射dsLmAbd-5的5齡若蟲和對(duì)照組相同，均能正常蛻皮，盡管目的基因表達(dá)量顯著降低，但未發(fā)現(xiàn)可見的異常表型。分別取dsLmAbd-5注射組蛻皮后2 d的成蟲表皮（LmAbd-5表達(dá)量顯著降低）及對(duì)照組成蟲表皮進(jìn)行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，注射dsLmAbd-5的成蟲內(nèi)表皮片層結(jié)構(gòu)較為疏松，導(dǎo)致內(nèi)表皮片層變厚，表明LmAbd-5在飛蝗內(nèi)表皮的形成中具有重要作用。在飛蝗和其他昆蟲中，Abd是一個(gè)家族基因。根據(jù)節(jié)肢動(dòng)物表皮蛋白數(shù)據(jù)庫[31]和飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，共發(fā)現(xiàn)包括LmAbd-5在內(nèi)的8個(gè)Abd類型的表皮蛋白基因，然而其表達(dá)特性和功能以及它們相互之間是否具有協(xié)同或互補(bǔ)作用尚有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析獲得飛蝗LmAbd-5，其編碼的蛋白含有1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域ChtBD4，屬于CPR家族中的RR-1亞類；LmAbd-5主要在外胚層起源的組織中高表達(dá)，發(fā)育表達(dá)特性表明該基因主要在內(nèi)表皮形成時(shí)期表達(dá)；沉默LmAbd-5后飛蝗未出現(xiàn)肉眼可見的表型，但超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)其參與飛蝗內(nèi)表皮片層結(jié)構(gòu)的形成。

[1] CHARLES J P. The regulation of expression of insect cuticle protein genes. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 40(3): 205-213.

[2] CHAPMAN R F, SIMPSON S J, DOUGLAS A E. The Insects Structure and Function. 5th ed. Cambridge University Press, 2013.

[3] 王蔭長(zhǎng). 昆蟲生理學(xué). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2004. WANG Y C. Insect Physiology. Beijing: China Agriculture Press, 2004. (in Chinese)

[4] TETREAU G, DITTMER N T, CAO X, AGRAWAL S, CHEN Y R, MUTHUKRISHNAN S, HAOBO J, BLISSARD G W, KANOST M R, WANG P. Analysis of chitin-binding proteins from Manduca sexta provides new insights into evolution of peritrophin A-type chitinbinding domains in insects. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 62: 127-141.

[5] REBERS J E, WILLIS J H. A conserved domain in arthropod cuticular proteins binds chitin. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 31: 1083-1093.

[6] WILLIS J H. Structural cuticular proteins from arthropods: annotation, nomenclature, and sequence characteristics in the genomics era. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 40(3): 189-204.

[7] KAROUZOU M V, SPYROPOULOS Y, ICONOMIDOU V A, CORNMAN R S, HAMODRAKAS S J, WILLIS J H. Drosophila cuticular proteins with the R＆R consensus: Annotation and classification with a new tool for discriminating RR-1 and RR-2 sequences. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2007, 37(8): 754-760.

[8] GIBBS R A, BROWN S J, BEEMAN R W, WEINSTOCK1 G M. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature, 2008, 452(7190): 949-955.

[9] FUTAHASHI R, OKAMOTO S, KAWASAKI H, ZHONG Y S, IWANAGA M, MITA K, FUJIWARA H. Genome-wide identification of cuticular protein genes in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2008, 38(12): 1138-1146.

[10] DITTMER N T, TETREAU G, CAO X, JIANG H, WANG P, KANOST M R. Annotation and expression analysis of cuticular proteins from the tobacco hornworm, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 62: 100-113.

[11] DENG H M, LI Y, ZHANG J L, LIU L, FENG Q L. Analysis of expression and chitin-binding activity of the wing disc cuticle protein BmWCP4 in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science, 2016, 23(6): 782-790.

[12] ARAKANE Y, ZHU Q, MUTHUKRISHNAN S, MATSUMIY M, KRAMER K J. Properties of catalytic, linker and chitin-binding domains of insect chitinase. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2003, 33: 631-648.

[13] WANG P, LI G, GRANADOS R R. Identification of two new peritrophic membrane proteins from larval Trichoplusia ni: structural characteristics and their functions in the protease rich insect gut. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 34(3): 215-227.

[14] TAKEDA M, MITA K, QUAN G X, SHIMADA T, OKANO K, KANKE E, KAWASAKI H. Mass isolation of cuticle protein cDNAs from wing discs of Bombyx mori and their characterizations. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 31(10): 1019-1028.

[15] NOH M Y, KRAMER K J, MUTHUKRISHNAN S, KANOST M R, BEEMAN R W, ARAKANE Y. Two major cuticular proteins are required for assembly of horizontal laminae and vertical pore canals in rigid cuticle of Tribolium castaneum. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 53: 22-29.

[16] MUN S, YOUNG NOH M, DITTMER N T, MUTHUKRISHNAN S, KRAMER K J, KANOST M R, ARAKANE Y. Cuticular protein with a low complexity sequence becomes cross-linked during insect cuticle sclerotization and is required for the adult molt. Scientific Reports, 2015, 5: 10484.

[17] NOH M Y, MUTHUKRISHNAN S, KRAMER K J, ARAKANE Y. Tribolium castaneum RR-1 cuticular protein TcCPR4 is required for formation of pore canals in rigid cuticle. PLoS Genetics, 2015, 11(2): e1004963.

[18] ARAKANE Y, LOMAKIN J, GEHRKE S H, HIROMASA Y, TOMICH J M, MUTHUKRISHNAN S, BEEMAN R W, KRAMER K J, KANOST M R. Formation of rigid, non-flight forewings (Elytra) of a beetle requires two major cuticular proteins. PLoS Genetics, 2012, 8(4): e1002682.

[19] JESPERSEN S, HOJRUP P, ANDERSENT S O, ROEPSTORFF P. The primary structure of an endocuticular protein from two locust species, Locusta migratoria and Schistocerca gregaria, determined by a combination of mass spectrometry and automatic Edman degradation. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology, 1994, 109(1): 125-138.

[20] LIU S, WEI W, CHU Y, ZHANG L, SHEN J, AN C. De novo transcriptome analysis of wing development related signaling pathways in Locusta migratoria Manilensis and Ostrinia furnacalis (Guenée). PLoS ONE, 2014, 9(9): e106770.

[21] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔ Ctmethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[22] WANG X, FANG X, YANG P, JIANG X, JIANG F, ZHAO D, LI B, CUI F, WEI J, MA C, WANG Y, HE J, LUO Y, WANG Z, GUO X, GUO W, WANG X, ZHANG Y, YANG M, HAO S, CHEN B, MA Z, YU D, XIONG Z, ZHU Y, FAN D, HAN L, WANG B, CHEN Y, WANG J, YANG L, ZHAO W, FENG Y, CHEN G, LIAN J, LI Q, HUANG Z, YAO X, LV N, ZHANG G, LI Y, WANG J, WANG J, ZHU B, KANG L. The locust genome provides insight into swarm formation and long-distance flight. Nature Communications, 2014, 5: 2957.

[23] MOUSSIAN B, SEIFARTH C, MULLER U, BERGER J, SCHWARZ H. Cuticle differentiation during Drosophila embryogenesis. Arthropod Structure & Development, 2006, 35(3): 137-152.

[24] REBERS J E, RIDDIFORD L M. Structure and expression of a Manduca sexta larval cuticle gene homologous to Drosophila cuticle genes. Journal of Molecular Biology, 1988, 203(2): 411-423.

[25] NOHR C, ANDERSEN S O. Cuticular proteins from fifth instar nymphs of the migratory locust, Locusta migratoria. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1993, 23(4): 521-531.

[26] ANDERSEN S O. Amino acid sequence studies on endocuticular proteins from the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1998, 28: 421-434.

[27] NOH M Y, MUTHUKRISHNAN S, KRAMER K J, ARAKANE Y. Cuticle formation and pigmentation in beetles. Current Opinion Insect Science, 2016, 17: 1-9.

[28] 劉曉健, 崔淼, 李大琪, 張歡歡, 楊美玲, 張建珍. 飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因的表達(dá)特性、功能及調(diào)控. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(7): 1330-1340. LIU X J, CUI M, LI D Q, ZHANG H H, YANG M L, ZHANG J Z. Expression, function and regulation of chitin synthase 2 gene in Locusta migratoria. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(7): 1330-1340. (in Chinese)

[29] LI D, ZHANG J, WANG Y, LIU X, MA E, SUN Y, LI S, ZHU K Y, ZHANG J. Two chitinase 5 genes from Locusta migratoria: Molecular characteristics and functional differentiation. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 58: 46-54.

[30] 王燕, 李大琪, 劉曉健, 李濤, 馬恩波, 范仁俊, 張建珍. 飛蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(1): 73-82. WANG Y, LI D Q, LIU X J, LI T, MA E B, FAN R J, ZHANG J Z. Molecular characterization and RNAi-based functional analysis of Obstructor family genes in Locusta migratoria. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(1): 73-82. (in Chinese)

[31] MAGKRIOTI C K, SPYROPOULOS I C, ICONOMIDOU V A, WILLIS J H, HAMODRAKAS S J. cuticleDB: a relational database of Arthropod cuticular proteins. BMC Bioinformatics, 2004, 5: 138.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Expression and Functional Analysis of Endocuticle Structural Glycoprotein Gene LmAbd-5 in Locusta migratoria

ZHAO XiaoMing1, JIA Pan1,2, GOU Xin1,2, LIU WeiMin1, MA EnBo1, ZHANG JianZhen1
(1Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;2College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006)

Locusta migratoria; cuticular proteins; LmAbd-5; RNAi; transmission electron microscopy

2016-11-28；接受日期：2017-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金（31640075，31672364）、山西省青年科學(xué)基金（201601D021102）、山西省高?？萍紕?chuàng)新基金（2016113）

聯(lián)系方式：趙小明，Tel：0351-7018871；E-mail：zxming@sxu.edu.cn。通信作者張建珍，Tel：0351-7018871；E-mail：zjz@sxu.edu.cn

Abstract:【Objective】The objective of this study is to obtain a cDNA sequence of endocuticle structural glycoprotein LmAbd-5 based on Locusta migratoria transcriptome, clarify its molecular characteristics and biological function, reveal its role in the formation of cuticle in L. migratoria, and provide a new molecular target for pest control. 【Method】The full length cDNA of LmAbd-5 was searched from transcriptome database of L. migratoria using bioinformatics method. The cDNA was cloned and sequenced. The signal peptide and function domain of deduced amino acid were analyzed by SignalP and SMART, respectively. Phylogenetic tree was constructed using the sequences of amino acid from different insect species by the MEGA 7.0 software with the neighbor-joining (NJ) method. Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) was applied to reveal the expression patterns of LmAbd-5 in different tissues on day 2 of 5th instar nymph and different developmental stages of integument. The effects of LmAbd-5 on locust growth development and the structure of cuticle were investigated by using RNA interference (RNAi) and transmission electron microscopy (TEM).【Result】The full length cDNA of LmAbd-5 was got from transcriptome database, which had 520 bp including ORF 303 bp. The gene structure analysis showed that LmAbd-5 has three exons. The deduced protein contains a signal peptide and one chitin binding domain 4 (ChtBD4) through the BLAST analysis, Abd-5 was highly conserved among insect species, and the sequence identity is as high as 81% between LmAbd-5 and SgAbd-5. Abd-5 belongs to the RR-1 class of CPR family by WebLogo analysis. The result of phylogenetic tree showed that LmAbd-5 has a close genetic relationship with SgAbd-5. RT-qPCR results showed that LmAbd-5 was predominately expressed in the tissues originated from ectoderm, such as the foregut, hindgut, trachea and integument, and lower expressed or not detected in the gastric caecum, midgut, Malpighian tube, fat body and wing pads. The expression at different stages showed that LmAbd-5 mainly expressed at early of 5th instar (0-72 h after ecdysis from 4th instar nymph), and up to the peak at 72 h after molting, then markedly decreased at 96-168 h. The expression pattern is related with the formation of endocuticle. Compared with dsGFP injected control, the nymphs with the injection of dsLmAbd-5 could normally molt, and no visible abnormal phenotypes was found although the expression of LmAbd-5 was decreased significantly after dsLmAbd-5 injection. However, compared to the control group, the lamellar structure from adult cuticle with injection of dsLmAbd-5 was loose, and lamellar became thicker, finally led to the endocuticle thickening.【Conclusion】LmAbd-5 was obtained from locust transcriptome database, which contains a signal peptide and ChtBD4, belonging to the RR-1 class of CPR family. LmAbd-5 mainly expressed in the tissues derived from ectoderm and in integument at early of 5th instar. Although there was no visible phenotypes after silencing LmAbd-5, but it was found that the lamellar structure of endocuticle is loose and endocuticle becomes thicken from ultrastructure by TEM, suggesting it may be participated in the formation of endocuticle in L. migratoria.