徐勇明 任書嫻 常璐 曲志釗 李亞娜 王宏勤

·基礎(chǔ)研究·

MicroRNA-195對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株CCND1表達(dá)的影響

徐勇明1任書嫻1常璐1曲志釗2李亞娜2王宏勤2

目的研究microRNA-195對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株CCND1表達(dá)的影響。方法通過脂質(zhì)體Lipofectamin 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將microRNA-195過表達(dá)、microRNA-195抑制表達(dá)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251。以空白轉(zhuǎn)染組作為空白對(duì)照組 （K組）、microRNA-195過表達(dá)轉(zhuǎn)染組為 M組、microRNA-195抑制表達(dá)轉(zhuǎn)染組為I組。Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后microRNA-195的含量以確保轉(zhuǎn)染效率；再通過real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后CCND1mRNA的表達(dá)變化；western blotting檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中CCND1的表達(dá)水平。結(jié)果Real-time PCR結(jié)果顯示M組CCND1mRNA的表達(dá)低于I組 （M：758.264＜I：1398.04），western blotting實(shí)驗(yàn)顯示M組相對(duì)I組CCND1表達(dá)減少 （M：2029＜I：22365.66）。結(jié)論MicroRNA-195對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株CCND1表達(dá)有影響。

微小RNA-195； 細(xì)胞周期蛋白D1； 膠質(zhì)瘤

近年來，microRNA已經(jīng)成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。MicroRNA是一類長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸序列的非編碼的內(nèi)源性單鏈RNA分子。Lee等[1]首先在線蟲胚胎中發(fā)現(xiàn)lin-4小分子RNA，并命名為miRNA。microRNA-195定位于染色體的17p13.1，位于人類17號(hào)染色體的 6 881 953～6 862 065 bp間，是AK098506基因第7個(gè)內(nèi)含子的部分序列[2]。

有研究報(bào)道：microRNA-195靶點(diǎn)多為G1/S期的轉(zhuǎn)換調(diào)控因子，而這些因子與腫瘤細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換調(diào)控、 異常增殖、 凋亡密切相關(guān)。 過表達(dá)microRNA-195可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。利用數(shù)據(jù)庫TargetScan預(yù)測(cè)microRNA-195的作用靶點(diǎn)，以及目前已經(jīng)報(bào)道的microRNA-195的作用靶點(diǎn)，如 CCND1、CCND3、BCL-2等。CCND1過表達(dá)于多種人類腫瘤，包括膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、淋巴瘤等[3-5]。

因此，為闡明microRNA-195對(duì)膠質(zhì)瘤CCND1的影響，并初步驗(yàn)證CCND1為microRNA-195的作用靶點(diǎn)，筆者采用real-time PCR、western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后CCND1的變化。

材料與方法

一、材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251（武漢博士德生物工程有限公司）；質(zhì)粒miRNA-195過表達(dá)，miRNA-195抑制表達(dá)（廣州銳博）；CCND1鼠抗人（美國(guó)sigma）；βactin鼠抗人（武漢三鷹）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó) Invitrogen公司）；胎牛血清（美國(guó) Sigma公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%新胎牛血清、青霉素100 IU/ml和鏈霉素100 IU/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中置于5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每48 h更換一次新鮮培養(yǎng)液并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。48～72 h用0.25%的胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：在6孔板中接種對(duì)數(shù)期細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)平行孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為60%左右開始轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為microRNA-195過表達(dá)組、microRNA-195抑制表達(dá)組、空白轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后6 h換含10%小牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.RNA的提取：材料均用0.1%焦碳酸二乙酯水處理，排除RNA酶的干擾。按照RNA提取步驟進(jìn)行，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。A260/A280比值控制在1.8～2.2。

4.反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA反應(yīng)：使用 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。配制反應(yīng)液（反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行）在0.2 ml的離心管中加入下列反應(yīng)體系，條件按說明書進(jìn)行設(shè)置。將合成的cDNA儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

5.檢測(cè)microRNA-195相對(duì)表達(dá)量：采用realtime PCR檢測(cè)U251轉(zhuǎn)染前后microRNA-195相對(duì)表達(dá)量，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。分別計(jì)算microRNA-195及U6基因的Ct值，△Ct=Ct目的基因-CtU6內(nèi)參，△△Ct=Ct轉(zhuǎn)染組-Ct對(duì)照組，采用2-△△Ct值表示結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.檢測(cè)CCND1mRNA的表達(dá)水平：使用prime3.0設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)CCND1引物序列，CCND1：上游引物5’-3’：GCATGTTCGTGGCCTCTAAG，下游引物5’-3’：CGTGTTTGCGGATGATCTGT；GAPDH：上游引物5’-3’：CCACGATAACACCAGCTTCG，下游引物5’-3’：ACTTGAGCATGTAGGCCTGT，引物由廣州銳博合成。Real-time PCR檢測(cè)U251轉(zhuǎn)染前后CCND1mRNA相對(duì)表達(dá)量。采用相對(duì)定量比較CT值法：△Ct= CtCCND1-CtGAPDH，△△Ct=Ct轉(zhuǎn)染組-Ct對(duì)照組，采用2-△△Ct值表示結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.Western blotting實(shí)驗(yàn)：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化法提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量，配平蛋白濃度，再按20μl蛋白+5μl蛋白上樣緩沖液混勻后置于金屬儀中100℃變性5 min。配制5%濃縮膠及12%分離膠，點(diǎn)樣后90 V電壓下電泳30 min，130 V電壓下電泳90 min，轉(zhuǎn)膜90 min，5%封閉液封閉2 h，孵育相應(yīng)一抗于4℃過夜，TBST洗3次，每次洗10 min，加二抗孵育2 h，TBST洗3次，每次洗10 min，之后放于凝膠成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行顯影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，多個(gè)樣本比較采用單因素方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、各組microRNA-195相對(duì)表達(dá)量

轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞沉淀，提取RNA，realtime PCR檢測(cè)各組 microRNA-195相對(duì)表達(dá)量，microRNA-195過表達(dá)組與空白對(duì)照組相比，microRNA-195相對(duì)表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.877，P=0.035）；microRNA-195抑制表達(dá)組與空白對(duì)照組相比，microRNA-195相對(duì)表達(dá)量減少， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=2.437，P=0.001）；而microRNA-195過表達(dá)組與microRNA-195抑制表達(dá)組比，差異更加明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.215，P= 0.001）；表明轉(zhuǎn)染效果好（圖1）。

二、CCND1mRNA在人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的表達(dá)變化

圖1 各組microRNA-195相對(duì)表達(dá)量

Real-time PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：microRNA-195過表達(dá)組CCND1mRNA表達(dá)量明顯低于microRNA-195抑制表達(dá)組，空白對(duì)照組處于microRNA-195過表達(dá) 組 與 microRNA-195抑制表達(dá)組之間，而microRNA-195過表達(dá)組是轉(zhuǎn)染microRNA-195 mimics組，microRNA-195抑制表達(dá)組是轉(zhuǎn)染microRNA-195 inhibitors組，microRNA-195過表達(dá)組中microRNA-195表達(dá)高于microRNA-195抑制表達(dá)組，從而說明microRNA-195可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞CCND1mRNA的表達(dá)，見圖2。

圖2 各組CCND1mRNA相對(duì)表達(dá)量

三、CCND1在蛋白表達(dá)上的變化

Western blotting分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組CCND1蛋白、β-actin蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示microRNA-195過表達(dá)組與microRNA-195抑制表達(dá)組及空白對(duì)照組相比，CCND1蛋白相對(duì)蛋白表達(dá)量水平明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=9.495，P=0.000），與CCND1mRNA的表達(dá)結(jié)果一致。結(jié)合CCND1mRNA和 CCND1蛋白表達(dá)的結(jié)果，證明 miR-195對(duì)CCND1的表達(dá)有影響 ，并初步證實(shí)在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中，CCND1為microRNA-195的靶標(biāo)（圖3）。

圖3 以β-actin為參照western blotting檢測(cè)各組CCND1蛋白的表達(dá)

討論

證據(jù)表明，細(xì)胞周期蛋白家族的表達(dá)可受microRNA控制。據(jù)報(bào)道，microRNA-17、microRNA-20a、microRNA-106b直接針對(duì) 3’-UTR協(xié)同調(diào)控CCND1的表達(dá)，影響干細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程[6]。本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-195上調(diào)抑制CCND1的表達(dá)，下調(diào)反之?？傊?，microRNA-195可以通過調(diào)節(jié)CCND1的表達(dá)間接調(diào)控細(xì)胞周期。

作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子家族成員，CCND1過度表達(dá)可使細(xì)胞G1期縮短，體積變小，對(duì)分裂原的依賴性減弱，CCND1已被確認(rèn)為致癌基因[7]。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞周期素D1表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)，包括膠質(zhì)瘤、乳腺癌、膀胱癌等[8-10]。 細(xì)胞周期蛋白D1是眾所周知的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起重要作用的蛋白[11]。MicroRNA-195是一類調(diào)控RNA小分子，以序列特異性的方式控制它們的靶標(biāo)mRNA基因表達(dá)[12]。在多種致癌過程，已被確定為關(guān)鍵的監(jiān)管機(jī)構(gòu)，如細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞分化、侵襲和轉(zhuǎn)移，并可作為腫瘤抑癌基因或癌基因[13,14]。

本研究表明轉(zhuǎn)染microRNA-195類似物的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 CCND1mRNA低表達(dá)，而轉(zhuǎn)染microRNA-195抑制劑的 U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CCND1mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)。不僅如此，western blotting的結(jié)果也與其結(jié)果一致，這符合數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)，表明microRNA-195不僅在乳腺癌、結(jié)腸癌等能靶向調(diào)控 CCND1，同樣在膠質(zhì)瘤中也能調(diào)控CCND1，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)生影響，但具體作用機(jī)制還有待研究。

膠質(zhì)瘤發(fā)病率不斷上升，而臨床治療手段仍沒有大的變化，主要還是使用替莫唑胺進(jìn)行化療，隨著替莫唑胺在臨床治療上的廣泛應(yīng)用，許多膠質(zhì)瘤患者對(duì)其已經(jīng)產(chǎn)生耐藥，如替莫唑胺能通過激活PI3K/AKT信號(hào)途徑導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ不敏感甚至產(chǎn)生耐藥，而替莫唑胺發(fā)揮療效主要是影響細(xì)胞周期，影響有關(guān)細(xì)胞周期蛋白，包括CCND1、CCNE1等[15]。本研究證明microRNA-195對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株CCND1表達(dá)有影響，初步驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)，microRNA-195在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株中靶向調(diào)控CCND1，因此可預(yù)測(cè)，microRNA-195可能在改善膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺耐藥上有益，microRNA-195可能參與膠質(zhì)瘤替莫唑胺化療耐藥機(jī)制，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

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Effect o f microRNA-1 95 on the expression of CCND1 in glioma U251 cell

Xu Yongming1,Ren Shuxian1,Chang Lu1,Qu Zhizhao2,Li Yana2,Wang Hongqin2.1Department of Neurosurgery,The Graduate School of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2Department of Neurosurgery, The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

Wang Hongqin,Email:whq1968hq@163.com

Objective To research the effect of microRNA-195 on the expression of CCND1 in glioma U251 cell.MethodsMicroRNA-195 mimics,microRNA-195 inhibitors were transfected into human glioma U251 cell by lipofectamine 2000 transient transfection.The microRNA-195 mimics transfection group was M group,and the microRNA-195 inhibitors transfection group was group I(blank control group,K group).Real-time PCR was used to detect the content of microRNA-195 before and after transfection to ensure the transfection efficiency.The expression of CCND1 mRNA was detected by realtime PCR.The expression of CCND1 in glioma U251 cells was detected by western blotting.ResultsReal-time PCR results showed：the expression of CCND1 mRNA in group M was lower than that in group I（M：758.264＜I：1398.04）;western blotting：the expression of CCND1 was decreased in M group compared with I group(M：2029＜I：22365.66).ConclusionMicroRNA-195 has an effect on the expression of glioma U251 cellline CCND1.

MicroRNA-195;CCND1;Glioma

2017-03-09）

（本文編輯：張麗）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.03.007

國(guó)家自然科學(xué)基金（81470115）

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)研究生院1；030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科2

王宏勤，Email：whq1968hq@163.com

徐勇明,任書嫻,常璐,等.MicroRNA-195對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株CCND1表達(dá)的影響[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志, 2017,3(3)：155-158.