梁日深， 陳冬青， 蘇國茂 ， 周 萌， 吳灶和， 鄒記興

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510642)

基于COI及RAG2基因序列15種金線魚科魚類分子系統(tǒng)進化關(guān)系*

梁日深1， 陳冬青1， 蘇國茂1， 周 萌1， 吳灶和1， 鄒記興2

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510642)

本研究基于線粒體DNACOI及核DNARAG2基因部分序列分析了印度-太平洋金線魚科4屬15種魚類分子系統(tǒng)進化關(guān)系，綜合2基因序列采用最大似然法構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。研究獲得15種金線魚科魚類COI基因序列651 bp及RAG2基因序列726 bp，2基因片段均不存在插入與缺失。構(gòu)建的進化樹上，(1)15種金線魚科魚類種內(nèi)不同個體間均聚為一支，形成物種內(nèi)的單系，節(jié)點支持率為100%。(2)金線魚科4個屬主要分成2個分支，金線魚屬與錐齒鯛屬聚為一支，眶棘鱸屬與副眶棘鱸屬聚為另一支，與形態(tài)分類一致。(3)對于金線魚屬物種間的聚類情況，六齒金線魚與深水金線魚，印度洋金線魚與金線魚，蘇門答臘金線魚與日本金線魚均緊密聚成姐妹分支，紅金線魚與姬金線魚分類地位較為原始，位于上述金線魚大分支的基部。而該物種間聚類結(jié)果與Mohd在形態(tài)上根據(jù)尾鰭上下葉的長度性狀把金線魚分成2大組群的結(jié)果不同。對于該分歧是由于分子進化速率與表型進化速率不一致導(dǎo)致，還是體色斑紋、鰭條數(shù)等性狀不能作為區(qū)分金線魚屬魚類分類關(guān)系的有效指標，還需今后進一步的研究。

金線魚科；系統(tǒng)發(fā)育；COI基因；RAG2基因

1 研究背景

金線魚科(Nemipteridae)隸屬鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Percoidei)，主要分布于印度-西太平洋亞熱帶、熱帶海區(qū)。目前世界金線魚科主要分為金線魚屬(Nemipterus)、錐齒鯛屬(Pentapodus)、眶棘鱸屬(Scolopsis)、副眶棘鱸屬(Parascolopsis)和裸顳鯛屬(Scaevius)5個屬，共64種，我國記載有4屬約30余種，主要分布在南海[1-5]。金線魚科屬內(nèi)種間形態(tài)差異很小，基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的分類手段，許多物種的分類關(guān)系存在很大的爭議[2-7]。如目前形態(tài)學(xué)對金線魚科所劃分的4個屬中，金線魚屬與錐齒鯛屬形態(tài)較為接近，眶棘鱸屬與副眶棘鱸屬形態(tài)也異常相似，過去的分類資料曾認為副眶棘鱸屬應(yīng)歸為眶棘鱸屬中[2,4-5]，而另有資料卻認為副眶棘鱸屬可單獨形成一個屬[3]。在金線魚屬內(nèi)種間的分類中，有研究依據(jù)金線魚尾鰭上下葉長度是否一致將其分為2大類，上葉長度與下葉一致的歸為一類，上葉延長大于下葉的歸為另一類[8]，而另有資料卻依據(jù)體表條紋顏色、大小、數(shù)量或鰭條數(shù)目來劃分[2-3,6]，導(dǎo)致金線魚屬魚類種間的分類關(guān)系無法統(tǒng)一，而進一步的分子水平的研究報道相對較少[9-10]。形態(tài)分類混亂，物種分類不清已嚴重制約了金線魚科種質(zhì)資源的正確開發(fā)與有效利用。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，物種的分類也逐漸由形態(tài)學(xué)向分子水平的方向前進。物種進化本質(zhì)上是基因組的進化，物種分類在DNA水平上更精確地反應(yīng)物種之間的聚類關(guān)系。線粒體DNA、核DNA等不同類型的基因可作為有效的遺傳標記應(yīng)用在物種系統(tǒng)分類研究中，有效解決許多魚類形態(tài)分類上懸而未決的難題[11-13]。線粒體DNA中細胞色素C氧化酶亞基I(COI)基因，進化速率適中，在魚類分子系統(tǒng)進化研究中已被驗證為是可靠的遺傳標記。同時，其5端一段長度為648 bp的片段，能在基因水平上成功區(qū)分物種，可作為物種分子鑒定有效的DNA條形碼標準序列，為生物的分類提供一種快速簡便、可信可靠的分類方法[14]。重組激活基因(Recombination Activating Genes，RAGs)是脊椎動物特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵基因，由RAG1和RAG2 2個基因組成[15-16]。其中，RAG2序列相對保守，適用于分子系統(tǒng)進化分析，已廣泛應(yīng)用于各種魚類系統(tǒng)分類研究[17-19]。線粒體DNACOI及核DNARAG2 2基因序列各有特點，可應(yīng)用于科、屬、種等分類階元的研究。兩基因相結(jié)合，優(yōu)勢互補，將提供更多更完善的基因信息與數(shù)據(jù)，更有效的解決物種分類問題。

本研究通過測定和比較金線魚科4個屬15種29個個體線粒體DNACOI及核DNARAG2基因部分序列，共同分析這15種金線魚科魚類分子系統(tǒng)分類關(guān)系。同時，驗證COI基因在金線魚屬魚類DNA條形碼識別技術(shù)的有效性，為該類群物種的分類爭議提供分子水平的依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料來源

金線魚科實驗樣品主要采集于印度-西太平洋沿海區(qū)域，我國分布的種類主要采集于南海，國外樣品來源于南非水生物多樣性研究院及新喀里多尼亞瀉湖水族館，樣品材料依照《中國魚類檢索系統(tǒng)》進行形態(tài)學(xué)鑒定與分類。樣品的分類信息、采集地及編號見表1。

表1 金線魚科15種魚類樣品基本信息

2.2 總基因組DNA的提取

基因組DNA提取采用動物組織DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)進行提取。提取的DNA溶解于100 μL洗脫緩沖液中， 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR擴增和測序

實驗用的COI及RAG2基因片段的PCR擴增引物分別參考國外相關(guān)文獻進行設(shè)計，由上海英駿生物公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中10×緩沖液5 μL， dNTPs (各2.5 mmol/L)2 μL，上下游引物各1 μL，Ex Taq酶(1 U/μL) 2 μL。引物序列如下：

COI上游引物: 5- TCA ACY AAT CAY AAA GAT ATY GGC AC-3。

COI下游引物: 5- ACT TCY GGG TGR CCR AAR AAT CA-3[20]。

RAG2上游引物: 5’-GAG GGC CAT CTC CTT CTC CAA-3’。

RAG2下游引物: 5’-GAT GGC CTT CCC TCT GTG GGT AC-3’[21-22]。

PCR反應(yīng)條件如下：對于COI基因，先94 ℃預(yù)變性5 min，隨后運行35個循環(huán)(94 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min；對于RAG2基因，除了退火溫度58 ℃ 30 s，其他條件與COI基因一致。

COI與RAG22基因擴增結(jié)束后，電泳檢測，純化回收，產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

2.4 數(shù)據(jù)分析

所得序列采用 NCBI 的Blastn 工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行在線比對，驗證序列是否為所得目的片段。利用Clustal W[23]對所有序列進行排序并輔以手工校正。利用 MEGA5.0[24]計算核苷酸組成、堿基變異及轉(zhuǎn)換顛換信息，基于K-2-P雙參數(shù)模型計算樣品種內(nèi)、種間及屬間遺傳距離。利用COI，RAG2及COI+RAG2整合序列，以鯻科及裸頰鯛科魚類作為外類群，基于最大似然法(Maximum likelihood，ML)構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹，進化樹采用重復(fù)抽樣分析(Bootstrap analysis)1 000次的方法檢驗各分支的置信度。

3 結(jié)果分析

3.1 序列分析

擴增得到的15種金線科魚類COI基因為651 bp的片段，堿基組成A、T、G、C 平均含量分別為 23.3%、30.6%、18.6%、27.4%，其中 A+T 含量(53.9%)略高于G+C 含量(46.0%)。無堿基的插入、缺失，編碼227個氨基酸。在密碼子第一位，G-1含量最高(30.7%)；密碼子第二位，T-2含量(41.0%)明顯高于其他3種，A-2，G-2較低，約15%；密碼子第三位T-3含量最高(32.0%)，G-3含量僅有9.6%(見圖1)。可見堿基A、T、G、C的含量在密碼子不同位置差異很大，使用頻率存在偏倚。此外，在長度為651 bp序列中，15種金線科魚類共有保守位點413個，約63.4%；變異位點238個，約占36.6%；簡約性信息位點214個，約占32.9%。

RAG2基因部分序列比對分析得到一致序列為729 bp，編碼243個氨基酸。堿基A、T、G、C平均含量分別為20.5%，21.5%，27.9%和30.2%，顯示A堿基相對缺乏，其中A + T的含量(42.0%)明顯低于G + C含量(58.1%)。密碼子第1，第2位四種堿基含量均相差不大，而密碼子第3位四種堿基含量有較大差異，其中C-3含量最高，為42.9%，而A-3含量最低，為9.9%，表現(xiàn)出反A偏倚(見圖2)。序列的保守位點579個，約占79.4%；變異位點150個，約占20.6%；簡約性信息位點93個，約12.8%?？芍cCOI基因相比，RAG2基因相對較為保守，物種間序列差異性較小。

圖1 COI基因3個位置密碼子的堿基組成

圖2 RAG2基因3個位置密碼子堿基組成

3.2 種間及種內(nèi)的遺傳距離

利用MEGA5.0基于Kimura 2-parameter模型計算出15種金線魚科魚類COI及RAG2基因遺傳距離如表2、3所示。在COI基因中，物種種內(nèi)遺傳距離為0.000～0.004，平均遺傳距離0.002，低于Hebert等[25]所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離值0.020。種間遺傳距離為0.129～0.257，遺傳距離最大在蘇門答臘金線魚與雙斑眶棘鱸之間，最小在日本金線魚與蘇門答臘金線魚之間，平均遺傳距離0.203，均高于Hebert等[25]設(shè)定的0.020的遺傳差異值。種間平均遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的101.5倍。顯示COI基因序列在金線魚科物種具有足夠大的種間差異區(qū)分各物種。對于物種數(shù)量最多的金線魚屬中，遺傳距離范圍為0.129～0.226，其中最大是六齒金線魚與蘇門答臘金線魚，最小是日本金線魚與蘇門答臘金線魚。

表2 15種金線魚科魚類COI基因遺傳距離(Kimura-2模型)

注: 1.日本金線魚N.japonicus; 2.蘇門答臘金線魚N.mesoprion; 3.印度洋金線魚N.bipunctatus; 4.金線魚N.virgatus; 5.深水金線魚N.bathybius; 6.六齒金線魚N.hexodon; 7.紅金線魚N.furcosus; 8.姬金線魚N.zysron; 9.黃帶錐齒鯛P.aureofasciatus; 10.長崎錐齒鯛P.nagasakiensis; 11.寬帶副眶棘鱸P.eriomma; 12.伏氏眶棘鱸S.vosmeri; 13.二線眶棘鱸S.bilineatus; 14.帶尾眶棘鱸S.frenatus; 15.雙斑眶棘鱸S.bimaculatus

表3 15種金線魚科魚類RAG基因遺傳距離(Kimura-2模型)

注: 1.日本金線魚N.japonicus; 2.蘇門答臘金線魚N.mesoprion; 3.印度洋金線魚N.bipunctatus; 4.金線魚N.virgatus; 5.深水金線魚N.bathybius; 6.六齒金線魚N.hexodon; 7.紅金線魚N.furcosus; 8.姬金線魚N.zysron; 9.黃帶錐齒鯛P.aureofasciatus; 10.長崎錐齒鯛P.nagasakiensis; 11.寬帶副眶棘鱸P.eriomma; 12.伏氏眶棘鱸S.vosmeri; 13.二線眶棘鱸S.bilineatus; 14.帶尾眶棘鱸S.frenatus; 15.雙斑眶棘鱸S.bimaculatus

在RAG2基因中，15種金線魚科魚類種內(nèi)遺傳距離范圍在0.000～0.004之間，平均遺傳距離為0.001。種間遺傳距離范圍在0.015～0.097之間，平均遺傳距離為0.065?？芍?，RAG2基因序列差異性比COI基因要小。其中，遺傳距離最小的是黃帶錐齒鯛與長崎錐齒鯛，遺傳距離最大是六齒金線魚與帶尾眶棘鱸。在金線魚屬內(nèi)部，遺傳距離范圍為0.018～0.059，其中最大是六齒金線魚與紅金線魚，最小是金線魚與印度洋金線魚。

圖3 基于COI序列利用最大似然法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹

3.3 分子系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

基于所得COI、RAG2及COI+RAG2整合序列，以鱸形目中魚類中真鯛和鯻作為外類群進行系統(tǒng)進化分析，采用最大似然法ML法分別構(gòu)建了3棵系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖3～5。3棵系統(tǒng)進化樹的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致，具有較高的節(jié)點支持率。這里我們主要基于COI+RAG2整合序列構(gòu)建的進化樹進行分析。進化樹上，金線魚科魚類種內(nèi)不同個體均聚為一支，形成物種內(nèi)單系，節(jié)點支持率為100%。金線魚科4個屬主要分成2個分支，金線魚屬與錐齒鯛屬聚為一支，眶棘鱸屬與副眶棘鱸屬聚為另一支。對于各物種間的聚類情況，在金線魚屬中，六齒金線魚與深水金線魚，印度洋金線魚與金線魚，蘇門答臘金線魚與日本金線魚均兩兩緊密聚成姐妹分支，紅金線魚與姬金線魚分類地位較為原始，位于上述金線魚大分支的某端，其中姬金線魚最先分化出來，位于整個金線魚屬類群底部。

圖4 基于RAG2序列利用最大似然法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹

4 討論

COI及RAG2是魚類分子系統(tǒng)發(fā)育研究常用的標記基因，國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用并有效解決許多魚類系統(tǒng)分類問題。COI基因進化速率適中，主要應(yīng)用于分類階元較低，如屬內(nèi)種間以及種內(nèi)樣品分類關(guān)系；RAG2進化比較保守，應(yīng)用于種級以上分類階元的研究。本研究基于COI、RAG2及COI+RAG2整合序列，分別構(gòu)建了金線魚科魚類分子系統(tǒng)進化樹，3個基因得出系統(tǒng)樹的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致，僅少數(shù)節(jié)點分枝及支持率有區(qū)別，如金線魚、印度洋金線魚的分類位置，說明COI及RAG2基因均能有效揭示金線魚科物種間的分類關(guān)系。COI+RAG2整合序列結(jié)合兩者基因的序列信息，優(yōu)勢互補，并豐富了可分析的位點數(shù)目，得到支持率更高，金線魚科物種聚類關(guān)系更清晰更真實的系統(tǒng)進化樹。

關(guān)于金線魚科屬級階元的分類，不同的資料存在爭議。目前國內(nèi)外主流的分類趨向認為金線魚科分為金線魚屬、錐齒鯛屬、眶棘鱸屬、副眶棘鱸屬、裸頰鯛屬5個屬[3,6,26-27]。其中金線魚屬與錐齒鯛屬形態(tài)較為接近，其身體大都呈長梭形，前鰓蓋骨均被鱗片，部分種類尾鰭上葉有絲狀延長等[3,26]?？艏|屬與副眶棘鱸屬形態(tài)也異常相似，過去的分類資料曾認為副眶棘鱸屬應(yīng)歸為眶棘鱸屬中[2,4-5]，近期部分學(xué)者基于前者的第一眶下骨棘短小，將其獨立出來[3]，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)二者在頜骨構(gòu)造、上側(cè)肋骨數(shù)目、眶下骨以及第二臀鰭鰭棘發(fā)達程度等方面均存在明顯的差異，認為副眶棘鱸屬可單獨形成一個屬[26]。本研究的進化樹上，金線魚科4個屬以高支持率分為2個主要的分支，金線魚屬和錐齒鯛屬聚為一支，眶棘鱸屬和副眶棘鱸屬聚為另外一支，與形態(tài)學(xué)大分類結(jié)果一致。同時，進化樹上，副眶棘鱸屬單獨形成一支，沒有聚類于眶棘鱸屬種類的類群中，初步支持上述副眶棘鱸屬可單獨形成一個屬的分類觀點。

圖5 基于COI+RAG2整合序列15種金線魚科魚類最大似然法(ML)分子系統(tǒng)樹

金線魚屬是金線魚科中物種數(shù)量最多的一個屬。形態(tài)上對金線魚屬魚類分類的依據(jù)主要體型體色、斑紋的差異以及尾鰭上葉末端是否延長等。Mohd等[8]曾依據(jù)金線魚尾鰭上下葉長度是否一致將其分為兩大類群，上葉長度與下葉一致的歸為一類，上葉存在延長大于下葉的歸為另一類。本研究的進化樹上，六齒金線魚與深水金線魚，印度洋金線魚與金線魚，蘇門答臘金線魚與日本金線魚兩兩緊密聚成姐妹分支，形態(tài)上，六齒金線魚、印度洋金線魚尾鰭上葉均不存在絲狀延長，蘇門答臘金線魚具絲狀延長或延長不明顯。可知，在進化樹上沒有形成以尾鰭上葉末端是否延長的為區(qū)分標準的2大分支，與前期形態(tài)學(xué)研究結(jié)論有一定的出入，但與近年的部分系統(tǒng)分類學(xué)研究結(jié)果相似。如寧平[28]基于16S rRNA分子標記分析的金線魚科魚類結(jié)果也沒有形成以尾鰭上下葉形態(tài)不一致的兩大類群，尾鰭上下葉不一致的種類相互交錯聚類在一起，本研究前期基于核DNA S7基因分析的7種金線魚屬魚類系統(tǒng)進化研究也得出相似的結(jié)果[10]。

在上述形成的多個姐妹分支組合中，部分組合與形態(tài)學(xué)的分類特征一致[3,8]，如日本金線魚與蘇門答臘金線魚，兩者形態(tài)尾鰭上葉長于下葉，肩部具有紅色斑點，背鰭中間有縱行斑紋，體側(cè)有數(shù)條縱帶等。Mohd等[8]分析了11種金線魚的形態(tài)數(shù)據(jù)，曾依此依據(jù)將兩者歸為一類群。Murty[29]比較形態(tài)學(xué)研究也得出相似的結(jié)果。但也有部分聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類有出入，如金線魚與印度洋金線魚，金線魚的尾鰭上葉絲狀延長，體側(cè)具數(shù)條明顯的黃色縱帶，而印度洋金線魚不具有該典型特征。另外，金線魚具有一可與其他金線魚屬魚類明顯區(qū)分的典型特征——其臀鰭鰭條數(shù)目為8，其它金線魚臀鰭鰭條均為7。部分資料根據(jù)這一特點把金線魚最先劃分出來[3]。在本研究的系統(tǒng)進化樹上，金線魚并沒有獨立形成一支，而是與印度洋金線魚聚在一起，位于整個金線魚屬類群內(nèi)部，處于中間的進化位置。由此可知，部分金線魚屬魚類的分子分類與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果存在出入，這在寧平的研究中也出現(xiàn)該情況，至于該分歧是分子進化速率與表型進化速率不一致導(dǎo)致，還是體色、花紋、鰭條數(shù)等主要性狀不能作為分清金線魚屬魚類分類關(guān)系的有效形態(tài)指標，還需今后更深一步的研究。

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責任編輯 高 蓓

Molecular Phylogenetic Relationship of 15 Nemipteridae Fishes Based on MitochondrialCOIand NuclearRAG2 Gene Sequnces

LIANG Ri-Shen1, CHEN Dong-Qing1, SU Guo-Mao1, ZHOU Meng1, WU Zao-He1, ZOU Ji-Xing2

(1.College of Animal Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2.College of Marine Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Fishes of the family Nemipteridae, belong to the suborder Percoidei of order Perciformes, which are mainly found in the oceanic waters of tropical, subtropical areas throughout the Indo-Western Pacific. Morphologically, classification and identification within Nemipteridae remains problematic because of their spectacular morphological diversification. Currently, few comprehensive molecular studies was concentrated on the Nemipteridae group to resolve the confused classificational issues. In the present study, molecular phylogenetic relationships among 15 Nemipteridae fish of 4 genera were analyzed based onCOIandRAG2 genes and the phylogenetic tree were constructed using maximum likelihood method. The sequences ofCOIandRAG2 genes were determined to be 651 bp and 726 bp, respectively, with no insertion and deletion existed. In the phyogenetic tree, (1) Individuals in each species were clustered together as a monophyletic group, with high bootstrap support value of 100%; (2) In the family Nemipteridae, four genera were divided into two major group, one group composed ofNemipterusandPentapodus, another group composed ofScolopsisandParascolopsis. (3) Within the genusNemipterus,N.japonicusandN.mesoprion,N.virgatusandN.bipunctatus,N.bathybiusandN.hexodonwere cluster tightly as sister species, indicating their close relationships with each other,N.zysronandN.furcosuswere first separated and rooted at the base of the above bigNemipterusgroup. The phylogenetic result was inconsistent with Mohds’ of hypothesis of dividingNemipterusspecies into two morphologically distinct groups according to the length of upper and lower of their caudal fin lobes, because some species in the same clusters share different characters of . Besides, the relationships of some clusters were somewhat different from the morphological classifications. To this divergence, it was due to the inconsistence between the molecular evolution rate and phenotypic evolution rate, or the morphological characters of color, stripes, shapes, fin ray numbers etc could not be used as effective morphological index to distinguish the taxonomic relationships of the Nemipterus fish, further investigation will be needed.

Phylogeny; nemipteridae;COIgene;RAG2 gene

廣東省自然科學(xué)基金項目(2016A030310236)；廣東省教育廳青年創(chuàng)新人才類項目(2014KQNCX16)；廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201511347028)資助 Supported by the Natural Science Foundation of Guangdong Province(2016A030310236);Foundation for Young Talents in Higher Education of Guangdong(2014KQNCX164);Undergraduate Training Program for Innovation and Entrepreneurship(201511347028)

2016-12-12;

2017-04-12

梁日深(1984-)，男，講師，研究方向：水生生物資源及保護利用。E-mail: cheetahliang@126.com

Q953

A

1672-5174(2017)08-074-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160407

梁日深，蘇國茂，陳冬青, 等. 基于COI及RAG2基因序列15種金線魚科魚類分子系統(tǒng)進化關(guān)系[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2018, 47(8): 74-81.

LIANG Ri-Shen, CHEN Dong-Qing, SU Guo-Mao, et al. Molecular phylogenetic relationship of 15 nemipteridae fishes based on mitochondrialCOIand nuclearRAG2 gene sequnces [J]. Periodical of Ocean University of China, 2018, 47(8): 74-81.