宋曉文， 陳金波， 吳欣彤， 李 斌， 徐文香， 魯文先， 董曉夢， 蘇毅鵬

瞬時感受電位香草酸亞家族蛋白1受體在慢性偏頭痛大鼠模型中的作用研究

宋曉文1， 陳金波1， 吳欣彤1， 李 斌1， 徐文香2， 魯文先1， 董曉夢1， 蘇毅鵬1

目的 本研究通過炎性湯(IS)反復刺激SD大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜建立慢性偏頭痛(CM)大鼠模型，探討瞬時感受電位香草酸亞家族蛋白1(TRPV1)受體在CM發(fā)病過程中的作用，為研究CM發(fā)病機制和治療藥物提供理論依據(jù)。方法 72只SD大鼠隨機數(shù)字表法分為空白對照組(A組)、假手術組(B組)、CM模型組(C組)及TRPV1受體拮抗劑Capsazepine組(D組)，采用免疫組織化學染色、Western-Blot、Real-time PCR技術檢測大鼠硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)(TG)、三叉神經(jīng)脊束尾側(cè)核(TNC)中的TRPV1受體、降鈣素基因相關肽(CGRP)表達量變化。結(jié)果 TRPV1受體和CGRP在CM大鼠硬腦膜、TG及TNC上的表達量均增加(P<0.05)，通過側(cè)腦室注射Capsazepine藥物后明顯緩解大鼠疼痛，且TRPV1受體、CGRP表達量均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 TRPV1受體通過影響CGRP釋放參與CM神經(jīng)源性炎癥反應及痛覺傳導，提示TRPV1可能通過TRPV1-CGRP信號通路參與CM病理生理過程。

慢性偏頭痛； 瞬時感受電位香草酸亞家族蛋白1受體； 降鈣素基因相關肽； 三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)； 機械刺激縮足反應閾值； 拮抗劑

偏頭痛是臨床常見的原發(fā)性頭痛，以搏動樣疼痛、活動時加重及反復發(fā)作為主要臨床表現(xiàn)，可導致失能，嚴重影響患者的生活和工作，全球發(fā)病率為12%[1]，是一個重大的全球公共衛(wèi)生問題。偏頭痛患者中每年約有2.5%～3%表現(xiàn)為“慢性化”趨勢，CM患者約占偏頭痛總數(shù)的8%，其人群患病率為1%～3%[2，3]。慢性偏頭痛(chronic migraine，CM)的病理生理機制尚不明確，目前發(fā)現(xiàn)中樞敏化、神經(jīng)源性炎癥反應、疼痛調(diào)控異常及皮質(zhì)興奮性增高可能參與慢性偏頭痛的發(fā)病過程，目前多數(shù)觀點認為神經(jīng)源性炎癥引起的“中樞致敏”與CM發(fā)病密切相關，但其細胞和分子機制仍不清楚[1，4]。最近研究提示神經(jīng)源性炎癥可引起瞬時感受電位香草酸亞家族蛋白1(Transient Receptor Potential Vanilloid subfamily member 1，TRPV1)的異常激活，對疼痛的維持起著重要作用。TRPV1屬于瞬時感覺電位(Transient Receptor Potential，TRP)陽離子通道超家族Ⅴ亞家族成員，是位于細胞膜及細胞器膜上的一種非選擇性陽離子通道蛋白，作為傷害性刺激分子整合器參與疼痛的產(chǎn)生及痛覺敏感的病理過程，但參與CM發(fā)病機制尚不清晰[5，6]。降鈣素基因相關肽(Calcition gene-related peptide，CGRP)是一種神經(jīng)肽類物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)頭部血管舒張的功能，被稱為三叉神經(jīng)血管激活的標志物質(zhì)[7]。大量研究證明，在CM患者的血液、腦脊液中CGRP含量明顯升高，發(fā)作間期CGRP血清濃度增高可作為CM的生物標記物[8]。注射外源性CGRP能誘發(fā)患者出現(xiàn)偏頭痛樣發(fā)作，使用CGRP受體拮抗劑能有效緩解偏頭痛臨床癥狀[9，10]。本實驗研究采用炎性湯(Inflammatory soup，IS)刺激大鼠硬腦膜建立CM模型大鼠模擬CM患者，通過免疫組織化學染色、Western-Blot、Real-time PCR技術檢測硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)(TG)、三叉神經(jīng)脊柱核尾側(cè)核(TNC)中的TRPV1受體表達量變化。通過側(cè)腦室注射TRPV1受體拮抗劑Capsazepine，觀察其鎮(zhèn)痛效果及對硬腦膜、TG和TNC組織上CGRP表達影響，初步探討TRPV1受體在CM發(fā)生中的可能作用，為探索CM發(fā)病機制及新的藥物治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 72只SPF級雄性SD大鼠(250～300 g)，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，在濱州醫(yī)學院SPF級動物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)，給予紫外線消毒后的標準顆粒和高壓蒸汽滅菌水喂養(yǎng)，溫度在18～25 ℃。大鼠按隨機數(shù)字法分為空白對照組(A組，n=18)、假手術組(B組，n=18，PE-10管滴注NS 20 μl)、慢性偏頭痛模型組[C組，n=18，PE-10管滴注IS 20 μl，皮下注射硝酸甘油(GTN)10 mg/kg建立CM大鼠模型]、Capsazepine組(D組，n=18，CM模型大鼠側(cè)腦室注射10 μl TRPV1受體拮抗劑Capsazepine)。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 復方致炎劑(Inflammatory soup，IS)，TRPV1抗體、CGRP抗體、Capsazepine(美國ABcam公司)，DAB染色液及蘇木素染色液(福州邁新生物技術有限公司)，RPIA、DPCPX、二甲基亞砜(美國sigma公司)，TRPV1、CGRP、β-actin引物(上海生工公司)，REAL-TIME PCR試劑盒(RNAIiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR⑧Premix Ex TaqTM II)(大連寶生物技術公司)。

1.2.2 主要儀器 ZHRXZ 柔性顱骨鉆及ZH藍星腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)，OLYMPUS BX51 顯微鏡 + DP72 顯微照相、單管微量給藥系統(tǒng)(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，微量注射器20μl(上海高鴿工貿(mào)有限公司)，低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)、酶標儀(美國Bio-rad公司)、實時熒光定量PCR儀(羅氏公司)。

1.3 方 法

1.3.1 建立慢性偏頭痛大鼠模型 參照Oshinsky法[11]，采用大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜炎性湯(IS)反復刺激，皮下注射硝酸甘油(GTN)建立慢性偏頭痛(CM)模型。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定在立體定位儀上，頭部正中去毛，皮膚消毒，逐層切開皮膚、肌肉，鈍性分離，H2O2清洗，暴露顱骨，腦立體定位儀定位前囟后1 mm、中線右1.5 mm處鉆孔，暴露上矢狀竇區(qū)(superior sagittal sinus，SSS)硬腦膜，顱骨下深1 mm置入PE-10軟管至SSS，牙托水泥封閉軟管周圍，逐層縫合軟組織、肌肉及皮膚，青霉素預防感染。術后大鼠單籠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，正常飲食，C、D組術后1 w后開始經(jīng)PE-10軟管腦膜給藥IS，20 μl，每周3次，共9次，GTN 10 mg/kg皮下注射，每周1次，共3次；A組不做任何處理，正常飲食；B組大鼠以0.01 mol/L 滅菌生理鹽水代替IS及GTN作為對照。D組CM造模建立1 d 后使用微量進樣器緩慢向側(cè)腦室注射TRPV1受體拮抗劑Capsazepine 10 μl。以上所有操作均在無菌條件下進行，操作過程保持動作輕柔、環(huán)境安靜，避免強光，室溫保持25 ℃左右。

1.3.2 行為學觀察及疼痛閾值測定 行為學觀察：注射IS或者滅菌生理鹽水后將大鼠置于安靜環(huán)境，1 h后觀察并記錄大鼠撓頭、打轉(zhuǎn)、舔毛及爬籠次數(shù)。行為學評分標準為：搔頭(10次記1分，每增加1次加記0.1分)；打轉(zhuǎn)(2次記1分，每增加1次加記1分)：爬籠(3次記1分，每增加1次加記1分)。注：1 h內(nèi)評分≥6為成功模型。

疼痛閾值測定：參照Oshinsky法[11]測定大鼠機械刺激縮足反應閾值(Paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)。各組大鼠給予IS后1 d測定PWMT，在安靜環(huán)境下，使用電子Von Frey測痛儀刺激大鼠足底皮膚，記錄引出大鼠縮足反應的刺激強度，重復測量3次，每次間隔15 s，取平均值作為PWMT(注：以埋管前一天PWMT作為基礎值)。

1.3.3 免疫組織化學染色 各組大鼠PE-10軟管最后一次給藥測定痛閾3 d后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，開胸經(jīng)左心室插管至升主動脈快速注射37 ℃生理鹽水至右心耳流出液變清、肝臟表白，預冷4 ℃ 4%多聚甲醛磷酸緩沖液先快速后慢速灌注至大鼠肝臟変韌，四肢抽搐且僵硬后取出硬腦膜、TG和TNC對應的低位腦干組織，分別置入4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定12-24后，常規(guī)脫色、包埋、切片(厚度3um)，取切片烤片后二甲苯脫蠟至水，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次流水沖洗，檸檬酸鹽緩沖液微波爐熱組織抗原修復，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，3% H2O2孵育 20 min(室溫)去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5 min×3次，滴加1% BSA 封閉 30 min(21 ℃恒溫)，加一抗(TRPV1抗體稀釋倍數(shù)1/2000，CGRP抗體1/400)4 ℃ 濕盒過夜(0.01 mol/L PBS代替一抗作陰性對照，余步驟相同)，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min后流水沖洗3 min，0.01 mol/L PBS洗3 min×3次，DAB 顯色、蘇木素復染、鹽酸酒精分化、常規(guī)梯度酒精脫水透明及中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。光鏡40×(硬腦膜切片100×)下觀察拍攝，每只大鼠取5張切片，每張切片隨機取6個視野，應用Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測定陽性細胞的光密度值(optical density，OD)，每組至少測定3次取均值(mean optical density，MOD)，所得數(shù)據(jù)以 表示，采用GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05作為判斷差異顯著性的標準。

1.3.4 Real-time PCR 各組大鼠麻醉后冰上快速斷頭取腦，將硬腦膜、TG及TNC分離干凈后置入離心管中，液氮冷凍后置于-80 ℃保存。按照試劑盒操作指南提取總RNA，采用260 nm紫外線吸收法進行RNA定量后進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在20 μl反應體系：4 μl×PrimeScript Buffer，1 μl PrimeScript RT Enzyme Mix 1，1 μl Oligo dT Primer(50 μM)，1 μl Random 6 mers(100 μM)，每個反應體系用RNase Free dH2O補足至20 μl，反轉(zhuǎn)錄設置反轉(zhuǎn)錄條件(37 ℃，15 min；85 ℃，5 s)，反轉(zhuǎn)錄完成后-20 ℃保存。參考大鼠TRPV1、CGRP受體cDNA序列進行特異性引物設計，選用β-actin作為內(nèi)參對照，TRPV1上游引物序列為：5’-GTG CCG GTT TAT GTT CGT CT-3’，下游引物序列：5’-GCA CTT GTG TGG CGT GGA CT-3’；CGRP的上游引物序列：5’-TCC TGG TTG TCA GCA TCT TG-3’，下游引物序列：5’-CTC AGC CTC CTG TTC CTC CT-3’；β-actin上游引物序列：5’-TGG TG TAT GGG TCA GAA GAA CT-3’，下游引物序列：5’-CAT GGC TGG GGT GTT GAA GGT CTC A-3’。所有引物均有上海生工生物技術有限公司合成及純化。在25 μl的反應體系中加入SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(2×)，PCR Forward Primer(10 μM)，PCR Reverse Primer(10 μM)，DNA模板(<100 ng)，dH2O。每個基因做三個復孔，放入設置好擴增程序的擴增儀中進行擴增，以β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法進行相對定量分析。

1.3.5 Western Blot測定蛋白濃度 各組大鼠測定痛閾后冰上斷頭處死，取硬腦膜、TG及TNC組織后分別置于玻璃勻漿器中，加入裂解液和蛋白酶抑制劑研磨均勻，12000 rpm 4 ℃離心15 min，取上清，BCA法測蛋白濃度，100 ℃變性5 min，放入-20 ℃保存；配置SDS-PAGE分離膠，在每個上樣孔中加入40 μg蛋白樣品進行電泳，轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗稀釋液(TRPV1 1/2000，CGRP 1/500)，β-actin(1/3000)作為內(nèi)參對照，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后滴加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1/5000)，37℃孵育2 h，TBST洗膜，顯影、定影、曝光，Image J軟件分析可視帶的吸光度值(A值)，結(jié)果以目的蛋白A值與內(nèi)參蛋白A值得比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 行為學觀察 行為學觀察結(jié)果顯示，A組及B組大鼠撓頭、打轉(zhuǎn)、舔毛及爬籠次數(shù)和行為學評分(評分<6分)前后無明顯差異(P>0.05)。C組CM模型建立大鼠行為學評分均>6分，造模成功，與A、B組相比，CM模型建立大鼠撓頭、打轉(zhuǎn)、舔毛及爬籠次數(shù)明顯增多，行為學評分顯著增高(P<0.05)。D組與C組相比撓頭、爬籠、打轉(zhuǎn)及舔毛次數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組行為學評分變化(見圖1)。

2.2 疼痛閾值測定 機械刺激縮足反應閾值(Paw Withdrawal Mechanical Threshold，PWMT)測定結(jié)果與行為學觀察結(jié)果一致。各組PWMT基礎值無顯著差異(P>0.05)。A、B組大鼠PWMT閾值無明顯差異(P>0.05)。與A、B組相比，C組大鼠PWMT閾值明顯降低(P<0.05)。D組大鼠與C組相比PWMT閾值顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組大鼠PWMT測定結(jié)果(見圖2)。

2.3 CM模型大鼠硬腦膜、TG及TNC組織上TRPV1受體表達情況

2.3.1 免疫組織化學染色檢測慢性偏頭痛模型大鼠硬腦膜、TG和TNC組織上TRPV1受體表達 A組與B組TRPV1受體在硬腦膜、TG及腦干TNC未見或僅可見少量表達，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與A組和B組相比，C組大鼠的TRPV1受體在硬腦膜、TG及腦干TNC組織均呈強陽性表達(P<0.05)，D組與模型組相比，表達量明顯減少，但高于A組和B組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見圖3)

2.3.2 Western Blot檢測慢性偏頭痛模型大鼠硬腦膜、TG和TNC組織TRPV1表達 Western Blot結(jié)果顯示，與A組和B組相比，C組大鼠硬腦膜、TG和TNC組織上TRPV1表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，D組與C組相比表達量均顯著降低，且高于A組和B組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組組內(nèi)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見圖4)。

2.3.3 Real-time PCR檢測慢性偏頭痛模型大鼠硬腦膜、TG及TNC組織TRPV1 mRNA的表達 Real-time PCR分析顯示，A組與B組mRNA表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，C組與A和B組比較，TRPV1 mRNA表達顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，D組與C組相比，TRPV1的mRNA表達量下調(diào)，且高于A組和B組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見表1和圖5)

2.4 TRPV1受體激活對CM大鼠硬腦膜、TG及TNC組織CGRP的影響 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，與A組、B組相比，C組CM大鼠硬腦膜、TG及TNC組織上CGRP陽性染色細胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與C組相比，D組側(cè)腦室注射Capsazepine大鼠硬腦膜、TG及TNC組織上CGRP陽性染色細胞明顯減少差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且多于A組和B組(見圖6)；Western Blot結(jié)果與免疫組織化學染色一致(見圖7)；Real-time PCR分析顯示，A組與B組mRNA表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，C組與A和B組比較，TRPV1 mRNA表達顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，D組與C組相比，TRPV1的mRNA表達量下調(diào)，且高于A組和B組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2和圖8)。

項目A組B組C組D組硬腦膜TGTNC1111．05±0．131．15±0．191．21±0．112．78±0．26?4．19±0．12?4．56±0．04?1．42±0．12#2．19±0．07#2．53±0．09#

與A組相比，B組、C組和D組大鼠硬腦膜、TG、TNC部位TPRPV1基因的相對表達量。與A組和B組相比較*P<0.05；與C組相比較#P<0.05

與A組或B組相比較*P<0.05；與C組相比較#P<0.05

圖1 大鼠行為學評分(n=18)

與A組或B組相比較*P<0.05；與C組相比較#P<0.05

圖2 大鼠機械刺激縮足反應閾值(n=18)

圖3 免疫組織化學染色檢測慢性偏頭痛模型大鼠硬腦膜、TG和TNC組織上TRPV1受體表達[硬腦膜免疫組化×100(a～d)，TG和TNC免疫組化×40(e～l)]

圖4 Western Blot檢測慢性偏頭痛模型大鼠硬腦膜、TG和TNC組織TRPV1表達(a：硬腦膜；b：TG；c：TNC)

與A組或B組相比較*P<0.05；與C組相比較#P<0.05

圖5 各組大鼠硬腦膜、TG、TNC部位TPRPV1基因的相對表達量(n=10)

項目A組B組C組D組硬腦膜TGTNC1111．16±0．121．26±0．241．07±0．156．06±0．42?6．3±0．13?6．25±0．05?2．04±0．16#3．12±0．14#3．76±0．27#

與A組相比，B組、C組和D組大鼠硬腦膜、TG、TNC部位CGRP基因的相對表達量。與A組和B組相比較*P<0.05；與C組相比較#P<0.05

圖6 免疫組織化學染色檢測慢性偏頭痛模型大鼠硬腦膜、TG和TNC組織上CGRP受體表達[硬腦膜免疫組化×100(a～d)，TG和TNC免疫組化×40(e～l)]

圖7 Western Blot檢測慢性偏頭痛模型大鼠硬腦膜、TG和TNC組織CGRP表達(a：硬腦膜；b：TG；c：TNC)

與A組和B組相比較*P<0.05；與C組相比較#P<0.05

圖8 與A組相比，B組、C組和D組大鼠硬腦膜、TG、TNC部位CGRP基因的相對表達量(n=10)

3 討 論

CM的發(fā)病機制尚不明確，目前研究發(fā)現(xiàn)可能與疼痛調(diào)控異常、中樞敏化、皮質(zhì)興奮性及神經(jīng)源性炎癥反應有關[12]。反復偏頭痛發(fā)作導致三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(trigenmi-novascular system，TVS)激活，可產(chǎn)生神經(jīng)源性炎癥反應產(chǎn)生神經(jīng)肽類物質(zhì)，如組胺、5-羥色胺(serotonin，5-HT)、緩激肽、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等，進一步促使腦干下行疼痛調(diào)控系統(tǒng)功能減弱及皮質(zhì)興奮性增高和痛閾值降低，其中TVS激活導致痛覺中樞敏化是核心過程[13～15]。TVS包括三級神經(jīng)元：一級神經(jīng)元是接受源自硬腦膜血管傳入沖動的TG，它將沖動傳至二級神經(jīng)元-TNC及C1、C2節(jié)段的脊髓后角表淺層，兩者共同構(gòu)成(trigerminocervical complex，TCC)，再將沖動傳導至丘腦的三級神經(jīng)元[14，16]?；谝陨献饔脵C制學說，Oshinsky等[17]利用IS，反復刺激大鼠硬腦膜建立CM大鼠模型，這種敏化狀態(tài)維持高達3 w時間，然后用硝酸甘油(GTN)誘導偏頭痛發(fā)作進行模擬CM發(fā)作。實驗通過觀察大鼠行為學及PWMT測定評估造模是否成功，行為學評分大于6分及PWMT測定降低可判定造模成功。根據(jù)三叉神經(jīng)血管理論學說[17]，TVS介導的疼痛中樞敏化和神經(jīng)源性炎癥反應在CM發(fā)病機制中的核心地位，以及在偏頭痛的痛覺產(chǎn)生和維持中的關鍵角色，硬腦膜、TG、TNC是TVS的重要組成部分，故在此三個部位組織探討CM的發(fā)病過程中活性物質(zhì)的表達水平可能性更大，結(jié)果也更具說服力。

TRPV1屬于TRP家族，是一種非選擇性陽離子通道，為顱內(nèi)主要的痛覺敏感受器之一，主要表達在中、小直徑傷害性感覺神經(jīng)元及其無髓C纖維和有髓A 纖維上[18]。研究顯示TRPV1主要表達于背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)、三叉神經(jīng)節(jié)、脊髓背角及脊髓三叉復合體尾核，其中大部分表達TRPV1的神經(jīng)元與神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)受體、P物質(zhì)或CGRP等一些傷害性感受傳遞的神經(jīng)肽之間存在“遞質(zhì)共存”現(xiàn)象，因此，IS激活支配腦膜的痛覺纖維傳遞痛覺信號，也可產(chǎn)生神經(jīng)肽類釋放導致腦膜神經(jīng)源性炎癥形成反復激活的正反饋連鎖反應，通過信號系統(tǒng)的逐級放大效應，促使疼痛閾值降低，TVS產(chǎn)生高反應性刺激，進而參與偏頭痛痛覺敏感化分子機制形成[19，20]。作為與痛覺傳遞有著緊密關聯(lián)的膜相關一類離子通道型受體，激活后引起膜外Ca2+內(nèi)流，可伴有少量Mg2+、Na+、K+等流入，也可介導增強了突觸傳遞效能和突觸可塑性改變，參與疼痛等生理病理發(fā)生過程[18]。TRPV1最初是在疼痛領域受到關注的，由于其極高的臨床和科研價值而被廣泛深入研究，目前，TRPV1在炎性痛、內(nèi)臟痛、癌性疼痛及痛覺敏化等起到重要作用[21]。有研究在體外培養(yǎng)的敲除TRPV1基因的初感覺神經(jīng)細胞對外界各種刺激反應都減弱，提示其在疼痛的發(fā)生形成過程中發(fā)揮重要作用[22]。炎癥介質(zhì)可提高TRPV1膜蛋白表達和通過蛋白激酶途徑激活磷酸化等途徑敏化TRPV1通道[19，23]。Szabo等研究大鼠慢性關節(jié)炎模型后，TRPV1缺失的大鼠對機械性刺激產(chǎn)生痛覺敏感性顯著低于野生型，推測出其對維持、增強痛覺敏感性起到重要作用，同時，該研究表明TRPV1也參與了模型大鼠關節(jié)炎慢性緩解節(jié)期緩解肽、PGE2和脂肪氧化酶產(chǎn)物激活TRPV1通道后產(chǎn)生對機械刺激高度敏感化的病理過程[23，24]。已有研究證實[18，23，25，26]，磷酸化的ERK(the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)可通過第二信使途徑敏化TRPV1通道傳遞傷害性信息至外周神經(jīng)末梢和腦干TNC，產(chǎn)生外周和中樞敏化介導痛覺信號傳導，TRPV1拮抗劑通過直接阻斷受體活性減輕辣椒素引起的疼痛超敏反應，提示TRPV1受體在CM發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

CGRP是由顱內(nèi)血管周圍感覺神經(jīng)末梢產(chǎn)生的一種具有強力舒張血管的神經(jīng)肽類物質(zhì)，廣泛表達于TVS[7，8]。CGRP可通過擴張腦血管和硬腦膜血管參與硬腦膜無菌性神經(jīng)源性炎癥反應，敏化初級感覺神經(jīng)纖維，也可與肥大細胞釋放炎癥因子和傷害性信號傳遞有關[7，27]。研究證實[9，10，28]，CGRP受體拮抗劑CGRP8-37可減弱辣椒素誘導的TVS痛覺過敏反應，TVS激活與CM密切相關，當TVS受到刺激后促使CGRP的釋放，促使頭部血管擴張、炎癥反應及神經(jīng)元激活一系列感覺神經(jīng)傳導，信號傳到丘腦及大腦皮質(zhì)產(chǎn)生搏動樣疼痛。大量研究顯示[8～10]，在CM患者的血液、腦脊液中的CGRP含量明顯升高。CGRP是引起神經(jīng)源性炎癥反應的重要血管活性物質(zhì)，CM發(fā)作期間CGRP血清濃度增高可作為CM的生物標志物重要的生物標記因子，其表達量增高可作為TVS激活的標志。靜脈注射外源性CGRP可以誘發(fā)偏頭痛發(fā)作，且CGRP受體拮抗劑Olcegepant能顯著緩解偏頭痛癥狀及其伴隨癥狀[28～30]。

本實驗研究參照Oshinsky造模方法通過IS反復刺激清醒大鼠硬腦膜促使大鼠產(chǎn)生穩(wěn)定持久的敏化狀態(tài)，利用GTN誘導偏頭痛發(fā)作進行模擬CM發(fā)作，模擬CM發(fā)作的臨床特點。反復炎性刺激通過周圍硬腦膜初級疼痛感覺纖維傳入，激活TG和TNC神經(jīng)元并使其產(chǎn)生敏化狀態(tài)，經(jīng)丘腦、藍斑及中央導水管周圍灰質(zhì)等傳遞到皮質(zhì)產(chǎn)生臨床癥狀。本實驗反復間斷刺激大鼠硬腦膜持續(xù)16 d，與國際頭痛協(xié)會發(fā)布的國際頭痛分類和診斷標準Ⅱ(ICHD-Ⅱ)定義的無先兆性偏頭痛發(fā)作≥15 d/m和排除藥物濫用等標準相符合。本實驗通過觀察評估大鼠行為學(如撓頭、打轉(zhuǎn)、爬籠等表現(xiàn)，行為學評分>6分)及PWMT測定判斷造模成功。行為學觀察和PWMT測定結(jié)果顯示，與正常空白組及假手術組相比，慢性偏頭痛大鼠撓頭、打轉(zhuǎn)、爬籠次數(shù)明顯增多(P<0.05)，PWMT明顯下降(P<0.05)；側(cè)腦室注射TRPV1受體拮抗劑Capsazepine后能顯著減少大鼠撓頭、打轉(zhuǎn)、爬籠等行為學次數(shù)，降低大鼠行為學評分，PWMT增高(P<0.05)，提示TRPV1受體在CM模型大鼠偏頭痛疼痛信號傳導起到重要作用。本實驗研究顯示，與正?？瞻捉M和假手術組相比，慢性偏頭痛模型大鼠硬腦膜、TG和TNC組織上TRPV1受體陽性細胞明顯增多(P<0.05)，此三個部位上TRPV1受體mRNA表達量與蛋白表達水平趨勢一致，即慢性偏頭痛大鼠TVS第一、二級神經(jīng)元上TRPV1活性物質(zhì)高表達，進一步提示TRPV1受體參與CM的發(fā)病機制形成，傷害性感覺刺激可由初級感覺纖維傳遞向二級感覺中樞，即TNC。

本實驗研究顯示，與正常組和假手術組相比，CM模型大鼠硬腦膜、TG及TNC組織上CGRP表達量明顯增高(P<0.05)，提示TRPV1受體與CGRP之間存在密切聯(lián)系，且在CM發(fā)生中二者表達上調(diào)存在正相關關系，提示分布在TVS組織上TRPV1受體表達上調(diào)激活后促使CGRP釋放；側(cè)腦室注射Capsazepine能明顯抑制CM大鼠硬腦膜、TG及TNC組織上CGRP表達水平(P<0.05)明顯下降，TRPV1與CGRP表達量均下調(diào)，二者在TVS組織上表達下調(diào)量呈正相關，提示TRPV1拮抗劑可明顯抑制TVS激活及偏頭痛的發(fā)生程度。我們推測，可能通過TRPV1-CGRP信號通路參與CM痛覺信號傳導及疼痛敏化的產(chǎn)生。

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The role of Transient Receptor Potential Vanilloid subfamily member-1 in chronic migraine rat model.

SONGXiaowen，CHENJinbo，WUXintong，etal.

(DepartmentofNeurology，TheAffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity，Binzhou256600，China)

Objective In this study，the model rats with chronic inflammation(chronic migraine，CM)was established by repeated stimulation of the superior sagittal sinus of SD rats with inflammatory soup(IS). In order to study the pathogenesis of chronic migraine(CM)and provide theoretical basis for the treatment of drugs，to explore the role of Transient Receptor Potential Vanilloid subfamily member-1(TRPV1)receptor in the pathogenesis of CM. Methods Seventy-two Rats were randomly divided into four groups：blank control group(A group)，sham operation group(B group)，CM group(C group)，Capsazepine group(D group). The dura mater，trigeminal ganglion(TG)and spinal trigeminal nucleus caudalis(TNC)were dissected to detect the expression of TRPV1 receptor and Calcition Gene-related Peptide(CGRP)by immunohistochemistry，Western blot and real-time PCR. Results The expression levels of TRPV1 receptor and CGRP in dura mater，TG and TNC were increased in CM rats(P<0.05)，and the behavioral of rats was significantly reduced in rats after intracerebroventricular injection of Capsazepine，and the expression of TRPV1 receptor and CGRP were decreased(P<0.05). Conclusion TRPV1 receptor is involved in CM neurogenic inflammatory response and pain transmission by affecting CGRP release，and the results suggest that TRPV1 maybe involved in the pathophysiology of CM via TRPV1-CGRP signaling pathway.

Chronic migraine； Transient Receptor Potential Vanilloid subfamily member-1； Calcition gene-related peptide； Trigenmi-novascular system； Paw withdrawal mechanical threshold； Antagonist

2017-03-25；

2017-04-29

山東省高等學?？萍加媱濏椖?No. J12LL63) 作者單位：(1.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濱州 256600；2.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科一病區(qū)護理部，山東 濱州 256600)

陳金波，E-mail：chenjinbo6720@126.com

1003-2754(2017)05-0398-08

R747.2

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