趙瑞杰， 王 坤， 劉雅林， 楊銀鋒， 李喜朋， 孫 莉， 程 焱

羥基紅花黃色素A對腦組織蛋白質(zhì)羰基化影響的體外研究

趙瑞杰1， 王 坤2， 劉雅林1， 楊銀鋒1， 李喜朋1， 孫 莉3， 程 焱3

目的 研究羥基紅花黃色素A(HSYA)對體外ONOO-途徑和亞鐵血紅素/亞硝酸鈉/過氧化氫(heme/NaNO2/H2O2)途徑引起腦組織蛋白質(zhì)羰基化的影響。方法 分別模擬體內(nèi)ONOO-、heme/NaNO2/H2O2羰基化途徑，以腦組織蛋白為羰基化底物，分為空白對照組、對照組及低、高濃度組(以HSYA 0.1 mmol/L、1 mmol/L干預(yù))。以2、4-二硝基苯肼(2、4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)法檢測蛋白質(zhì)羰基化水平。結(jié)果 ONOO-途徑和heme/NaNO2/H2O2途徑均可以增加腦組織勻漿中羰基蛋白的含量。HSYA預(yù)處理可濃度依賴性地降低ONOO-途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化水平，低、高濃度組羰基蛋白含量分別降低了26.13%、46.23%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 14.265，P<0.05)。HSYA預(yù)處理對體外heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化沒有明顯抑制作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 HSYA可劑量依賴性地抑制ONOO-途徑在體外對腦組織蛋白的羰基化修飾；提示HSYA抑制蛋白質(zhì)羰基化反應(yīng)可能是其對抗腦血管疾病與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的分子機制之一。

羥基紅花黃色素A； 過氧亞硝基離子； 亞鐵血紅素； 蛋白質(zhì)羰基化

氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化防御系統(tǒng)的平衡遭到破壞，體內(nèi)生成過多的高活性分子如活性氧自由基(reactire oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)超過了細胞內(nèi)抗氧化劑的代償能力，從而引起蛋白質(zhì)氧化和組織損傷[1]。蛋白質(zhì)氧化損傷伴隨著蛋白質(zhì)羰基的形成，而蛋白質(zhì)羰基化已被廣泛認為是蛋白質(zhì)氧化的生物學(xué)標志[2]。研究表明，過氧亞硝基離子(peroxynitrite，ONOO-)依賴途徑和亞鐵血紅素/亞硝酸鈉/過氧化氫(heme/NaNO2/H2O2)途徑是體內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化的兩條通路[3]。目前，對ONOO-依賴途徑研究較多，而對heme/NaNO2/H2O2途徑關(guān)注較少。紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L，)的干燥花，是傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥。研究表明，紅花活血化瘀的主要成分集中在水溶性的黃色素部分，紅花黃色素中含量最高且具有活性的成分為羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflower yellow A，HSYA)[4]。研究表明，HSYA具有神經(jīng)保護作用，其機制與抑制血小板聚集、抗氧化應(yīng)激等作用有關(guān)[5～7]。本研究通過體外構(gòu)建ONOO-途徑以及heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)的腦組織蛋白質(zhì)氧化模型，觀察這兩種途徑能否產(chǎn)生腦組織蛋白質(zhì)氧化修飾以及HSYA對其是否具有抑制作用，為HSYA在預(yù)防和治療腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等領(lǐng)域提供分子機制方面的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠20只，體重(340±10)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。分籠喂養(yǎng)，于室溫、自然光環(huán)境下給予充足的食物和水，自然晝夜循環(huán)。所有動物均于實驗室飼養(yǎng)1 w后進入實驗。

1.1.2 主要試劑和藥品 (1)過氧亞硝酸鹽(Peroxynitrite)購自美國Millipore公司。(2)氯化高鐵血紅素(ferriprotoporphyrin IX，Hemin)為美國Sigma公司產(chǎn)品，Hemin溶于二甲亞砜(DMSO，美國Sigma公司)溶液中，儲存液濃度為10 mmol/L，使用時以濃度為0.1 mmol/L的氫氧化鈉稀釋至所需工作濃度，避免反復(fù)凍融。(3)其他試劑和藥品：2，4-二硝基苯肼(DNPH)為上海申翔化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；PBS磷酸鹽緩沖液為北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司 產(chǎn)品；苯甲基磺酰氟(PMSF)為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；鹽酸胍為美國Amresco 公司產(chǎn)品；羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor yellow A，HSYA)凍干粉由山西華輝凱德制藥有限公司惠贈；無水乙醇、三氯乙酸、鹽酸、乙酸乙酯、過氧化氫(H2O2)、亞硝酸鈉(NaNO2)等均為國產(chǎn)優(yōu)級純或國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器 恒溫水浴箱購自德國Julabo公司；低溫超速離心機為德國Heraeus公司產(chǎn)品；UV-240紫外可見分光光度儀為日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 (1)空白對照組；在50 mmol/L PBS溶液中僅加入正常大鼠皮質(zhì)腦組織勻漿；(2)對照組；反應(yīng)底物為正常大鼠皮質(zhì)腦組織勻漿，反應(yīng)體系為ONOO-或heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系；(3)低、高藥物濃度干預(yù)組：在對照組的基礎(chǔ)上分別加入終濃度為0.1 mmol/L、1 mmol/L的 HSYA。

1.2.2 組織蛋白提取 SD大鼠處置前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛麻醉后斷頭處死，冰盒內(nèi)快速分離大腦，用4 ℃生理鹽水漂洗組織，并仔細去除蛛網(wǎng)膜，用濾紙吸干組織表面的液體。組織稱重后，切碎置于4℃磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7.4)中，并加入PMSF(終濃度為0.2 mmol/L)，于冰上研缽充分研磨，靜置30 min，4 ℃ 13000 r/min離心15 min，取上清備用。Lowry法進行蛋白濃度測定。

1.2.3 體外蛋白質(zhì)羰基化模型的建立 ONOO-反應(yīng)體系：ONOO-5 mmol/L；heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系：hemin 100 μmol/L、NaNO210 mmol/L、H2O21 mmol/L。不同濃度的HSYA(終濃度分別為0 mmol/L、0 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L)與腦組織(終濃度為4 mg/ml)37 ℃水浴預(yù)孵育5 min，之后加入ONOO-或heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系，繼續(xù)37 ℃水浴孵育30 min，取出冰上終止反應(yīng)。

1.2.4 2，4-二硝基苯肼(2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)法檢測蛋白質(zhì)羰基化水平 將腦組織勻漿上清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，室溫靜置15 min；滴加質(zhì)量體積分數(shù)為10%的硫酸鏈霉素，快速攪拌(使其終濃度為1%以沉淀DNA)，劇烈震蕩，充分混勻，室溫間斷震蕩30 min；室溫下高速離心機離心11000 r/min 15 min，以分離沉淀；取上清液，均分放入5個離心管中，3個離心管中加入等體積10 mmol/L DNPH，2個離心管中加入等體積2 mol/L的HCI?；旌暇鶆蚝蟊芄夥磻?yīng)2 h以上，每10 min充分震蕩混勻1次；反應(yīng)完畢后，加入等體積20%的三氯乙酸溶液，靜置15 min；11000 r/min離心3 min，棄上清(小心傾倒)，留沉淀物；相同條件下，沉淀物用1 ml等體積混合的無水乙醇和乙酸乙酯洗滌3次，除去未反應(yīng)的DNPH，每次室溫靜置10 min，11000 r/min離心3 min，小心棄上清，留沉淀物；沉淀物中加入1 ml 6 mol/L的鹽酸胍溶液，37 ℃水浴30 min，使沉淀充分溶解后，11000 r/min離心5 min，沉淀未溶物；用鹽酸胍溶液調(diào)零，取上清液于分光光度計370 nm處測定蛋白腙衍生物的吸光值，280 nm處測蛋白濃度；計算羰基蛋白的含量，計算公式為：，其中，C = 濃度(mol/L)；A = 吸光度值(A370DNPH-A370HCL)；b=吸光杯的內(nèi)徑或光程厚度(cm)，ε =摩爾吸光系數(shù)[22000/(M·cm)]。最后根據(jù)蛋白總量[A280×1.8(mg/ml)]算出每單位蛋白中羰基蛋白的含量(nmol/mgprot)。

2 結(jié) 果

2.1 HSYA 對ONOO-途徑誘導(dǎo)腦組織蛋白質(zhì)羰基化的影響 蛋白質(zhì)羰基化檢測顯示：與空白對照組相比，ONOO-途徑使腦組織勻漿中羰基蛋白的含量增加了95.10%，提示該途徑可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)羰基化；與對照組相比，HSYA預(yù)處理可濃度依賴性地降低蛋白質(zhì)羰基化水平，低、高濃度組羰基蛋白含量分別降低了26.13%、46.23%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 14.265，P<0.05)(見表1、圖1)。

2.2 HSYA對heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)羰基化的影響 蛋白質(zhì)羰基化檢測顯示：與空白對照組相比，heme/NaNO2/H2O2途徑使腦組織勻漿中羰基蛋白含量增加了62.98%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 8.784，P<0.05；見表2、圖2)，提示該途徑可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)羰基化。HSYA預(yù)處理對體外蛋白質(zhì)羰基化沒有明顯抑制作用，反而表現(xiàn)出輕微促氧化作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；見表2、圖2)。

組別樣本例數(shù)羰基蛋白含量(nmol/mgprot)F值P值空白對照組?對照組▽低濃度組△高濃度組▲55552．04±0．433．98±0．652．94±0．392．14±0．4014．2650．000

注：組間兩兩比較行LSD-t檢驗：*▽P=0.000；*△P=0.020；*▲P=0.778；▽△P=0.010；▽▲P=0.000；△▲P=0.034；

圖1 HSYA 對ONOO-途徑誘導(dǎo)腦組織蛋白質(zhì)羰基化的影響；對照組與空白對照組相比aP<0.05；各HSYA干預(yù)組與對照組比較bP<0.05；與低濃度組比較cP<0.05

圖2 HSYA對heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)羰基化的影響；對照組、低濃度組、高濃度組與空白對照組相比aP<0.05

組別樣本例數(shù)羰基蛋白含量(nmol/mgprot)F值P值空白對照組?對照組▽低濃度組△高濃度組▲55551．81±0．312．95±0．603．26±0．623．66±0．558．7840．002

注：組間兩兩比較行LSD-t檢驗：*▽P=0.011；*△P=0.002；*▲P=0.000；▽△P=0.429；▽▲P=0.087；△▲P=0.315

3 討 論

蛋白質(zhì)羰基化是一個比較復(fù)雜的過程，羰基的生成是由ROS攻擊氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基，經(jīng)一系列反應(yīng)最終生成NH3和相應(yīng)的羰基衍生物(如醛基)。蛋白質(zhì)羰基在體內(nèi)的形成主要是通過金屬離子催化氧化系統(tǒng)完成的，其中Fe2+和Cu2+起了重要作用。蛋白質(zhì)氧化損傷伴隨著蛋白質(zhì)羰基的形成，而蛋白質(zhì)羰基化已被廣泛認為是蛋白質(zhì)氧化的生物學(xué)標志[2]。研究表明，ONOO-依賴途徑和heme/NaNO2/H2O2途徑是體內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化的兩條通路[3]。其實質(zhì)是基于自由基的化學(xué)反應(yīng)。目前對ONOO-依賴途徑研究較多，而對heme/NaNO2/H2O2途徑關(guān)注較少。Heme/NaNO2/H2O2途徑是蛋白質(zhì)羰基化途徑之一，在該途徑中H2O2與NaNO2是使氧化發(fā)生的必需物質(zhì)[8]；heme的主要成分是原卟啉IX和鐵，而鐵是其發(fā)揮催化作用的關(guān)鍵物質(zhì)[8，9]，在體內(nèi)主要存在于血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素類物質(zhì)、過氧化物酶等含鐵卟啉的蛋白質(zhì)中。Hemin為heme的氧化形式，具有同樣的催化蛋白質(zhì)氧化的作用[8]。ONOO-既是一種強氧化劑又是一種強硝化劑，性質(zhì)很活潑。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生過量的超氧陰離子O2?-，同時誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達也會增高，過量產(chǎn)生的NO與O2?-快速結(jié)合產(chǎn)生ONOO-[10]。因此，我們在體外構(gòu)建蛋白質(zhì)羰基化模型，研究HSYA對體外ONOO-途徑和heme/NaNO2/H2O2途徑引起腦組織蛋白質(zhì)羰基化的影響。

本研究結(jié)果顯示，腦組織蛋白在ONOO-和heme/NaNO2/H2O2體系中均可被羰基化修飾，該結(jié)果提示，ONOO-和heme/NaNO2/H2O2途徑可能參與了病理情況下腦組織蛋白質(zhì)的羰基化修飾。大量研究表明，腦缺血時ONOO-生成增多，蛋白質(zhì)氧化參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)病過程，而降低ONOO-水平對腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用[11]。另外，相關(guān)研究表明，在腦出血、出血性腦梗死、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化等)的發(fā)病機制中存在蛋白質(zhì)氧化損傷，與局部過量蓄積的heme的神經(jīng)毒性有關(guān)[12～14]。蛋白質(zhì)羰基化修飾改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而結(jié)構(gòu)的變化會影響一些生物學(xué)上的重要功能，如改變酶的催化活性、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答等，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，HSYA對兩種體外蛋白質(zhì)羰基化模型的影響是不同的。HSYA可劑量依賴性地抑制ONOO-誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化的生成，這與其可以很好地清除ONOO-衍生的自由基(如?OH、?NO2)有關(guān)。對于heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)的氧化損傷，HSYA并未顯示出抑制作用，反而在一定程度上表現(xiàn)出輕微促氧化作用。多酚類物質(zhì)在某些情況下也可以表現(xiàn)出促氧化效應(yīng)[3，15]。通常情況下，這些促氧化效應(yīng)涉及多酚類物質(zhì)與過渡金屬離子(如鐵離子、銅離子)的相互作用，多酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)產(chǎn)生O2?-、H2O2以及醌和半醌的混合物，而這些氧化產(chǎn)物具有潛在的細胞毒性[3]。因此，這可能解釋我們觀察到的HSYA對heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化的輕度促氧化作用。在本研究中，HSYA對ONOO-途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化修飾具有抑制作用，且該作用呈劑量依賴性，提示HSYA對ONOO-途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化反應(yīng)具有抑制作用。因此應(yīng)用抗氧化劑通常是抑制自由基和鐵介導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化的策略。HSYA屬于黃酮類物質(zhì)中的查爾酮類，其分子中含多個酚羥基，而后者已被表明具有抑制脂質(zhì)過氧化、清除羥自由基等抗氧化功能[16]。因此我們推測，HSYA抑制ONOO-途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化可能為其酚羥基的作用。與本研究結(jié)果相一致，黃酮類中的其他物質(zhì)(如山奈素、芹黃素、柚皮素、黃芩素、槲皮素等)也被證明可劑量依賴性地抑制ONOO-誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化的生成。同時，在某種程度上，表現(xiàn)出輕微促氧化作用[3]。據(jù)此，我們推測HSYA對蛋白質(zhì)羰基化修飾的抑制作用與其抗氧化作用密不可分，這可能與其本身分子結(jié)構(gòu)和自由基清除能力有關(guān)。

綜上所述，HSYA可劑量依賴性地抑制ONOO-途徑在體外對腦組織蛋白的羰基化修飾；提示HSYA抑制蛋白質(zhì)羰基化反應(yīng)可能是其治療腦血管疾病與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的分子機制之一。

[1]趙瑞杰，孫 莉，劉星苗，等. 羥基紅花黃色素A抑制腦組織蛋白質(zhì)硝基化的體外研究[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013，30(3)：204-207.

[2]Hauck AK，Bernlohr DA. Oxidative stress and lipotoxicity[J]. J Lipid Res，2016，57(11)：1976-1986.

[3]Wang N，Li D，Lu NH，et al. Peroxynitrite and hemoglobin-mediated nitrative/oxidative modification of human plasma protein：effects of some flavonoids[J]. J Asian Nat Prod Res，2010，12(4)：257-264.

[4]祝 明，郭增喜. 紅花藥材中紅花黃色素含量的測定[J]. 中藥材，2000，23(8)：458-459.

[5]Wei X，Liu H，Sun X，et al. Hydroxysafflor yellow A protects rat brains against ischemia-reperfusion injury by antioxidant action[J]. Neurosci Lett，2005，386(1)：58-62.

[6]Sun L，Yang L，Xu YW，et al. Neuroprotection of hydroxysaf?or yellow A in the transient focal ischemia：Inhibition of protein oxidation/nitration，12/15-lipoxygenase and blood-brain barrier disruption[J]. Brain Res，2012，1473：227-235.

[7]Wang T，Duan SJ，Wang SY，et al. Coadministration of hydroxysafflor yellow A with levodopa attenuates the dyskinesia[J]. Physiol Behav，2015，147：193-197.

[8]Bian K，Gao Z，Weisbrodt N，et al. The nature of heme/iron-induced protein tyrosine nitration[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(10)：5712-5717.

[9]Lu N，Zhou G，Pei D，et al. Peroxynitrite and heme protein-mediated nitrative/oxidative modification of human plasma protein：the role of free radical scavenging vs. complex forming[J]. Toxicol In Vitro，2009，23(7)：1227-1233.

[10]Habib S，Ali A. Biochemistry of nitric oxide[J]. Indian J Clin Biochem，2011，26(1)：3-17.

[11]Khan M，Dhammu TS，Matsuda F，et al. Blocking a vicious cycle nNOS/peroxynitrite/AMPK by S-nitrosoglutathione：implication for stroke therapy[J]. BMC Neuroscience，2015，16：42.

[12]Dang TN，Robinson SR，Dringen R，et al. Uptake，metabolism and toxicity of hemin in cultured neurons[J]. Neurochem Int，2011，58(7)：804-811.

[13]Robinson SR，Dang TN，Dringen R，et al. Hemin toxicity：a preventable source of brain damage following hemorrhagic stroke[J]. Redox Rep，2009，14(6)：228-235.

[14]Lee DW，Andersen JK，Kaur D. Iron dysregulation and neurodegeneration：the molecular connection[J]. Mol Interv，2006，6(2)：89-97.

[15]Halliwell B. Are polyphenols antioxidants or pro-oxidants? What do we learn from cell culture and in vivo studies[J]? Arch Biochem Biophys，2008，476(2)：107-112.

[16]Ramagiri S，Taliyan R. Neuroprotective effect of hydroxy safflor yellow A against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats：putative role of mPTP[J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol，2016，27(1)：1-8.

Study on the effects of Hydroxysafflor yellow A to brain protein carbonylation in vitro

ZHAORuijie，WANGKun，LIUYalin，etal.

(DepartmentofNeurology，People’sHospitalofXingtai，Xingtai054000，China)

Objective To study the effects of Hydroxysafflor yellow A(HSYA)on brain protein carbonylation induced by peroxynitrite(ONOO-)and heme/NaNO2/H2O2 system in vitro. Methods To simulate in vivo peroxynitrite(ONOO-)and heme/NaNO2/H2O2system-induced carbonylative pathway，with brain protein for nitrification substrates，divided into blank group，control group and HSYA intervention groups(doses of 0.1 and 1 mM，respectively). 2，4-dinitrophenylhydrazine(DNPH)was used for the quantification of protein carbonylation. Results The treatment of brain tissue with ONOO-or heme/NaNO2/H2O2resulted in the significant formation of carbonyl groups. HSYA，at doses of 0.1 and 1 mM，dose-dependently decreased ONOO-induced protein carbonylation by 26.13% and 46.23% respectively，the difference was statistically significant(F=14.625，P<0.05). However，HSYA was relatively ineffective in protecting brain tissue from heme/NaNO2/H2O2-induced oxidative damage，the difference was not statistically significant(P>0.05). Conclusion HSYA could dose-dependently inhibit brain protein carbonylative modification induced by ONOO-system in vitro，which may be one of the molecular mechanisms to against cerebrovascular and neurodegenerative diseases.

Hydroxysafflor yellow A； Peroxynitrite； Heme； Protein carbonylation

2017-01-20；

2017-03-15 作者單位：(1.河北省邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河北 邢臺 054000；2.河北省邢臺市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北 邢臺 054000；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院天津市神經(jīng)病學(xué)研究所，天津 300052)

趙瑞杰，E_mail：zrjaty@163.com

1003-2754(2017)05-0419-04

Q51

A