陳春山， 郭明磊， 魏凱， 馬龍， 耿琰

(北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京102100)

天蠶素和溶菌酶對(duì)中華鱉腐皮病預(yù)防效果的研究

陳春山， 郭明磊， 魏凱， 馬龍， 耿琰

(北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京102100)

為探討天蠶素和溶菌酶對(duì)中華鱉Trionyxsinensis腐皮病的防治效果。本實(shí)驗(yàn)采用肌肉注射天蠶素(10 mg·kg-1)、溶菌酶(10 mg·kg-1)及天蠶素(6 mg·kg-1)和溶菌酶(5 mg·kg-1)混合物，觀察其對(duì)鰻氣單胞菌Aeromonasencheleia引起的中華鱉腐皮病的預(yù)防效果。以死亡率和相對(duì)保護(hù)率評(píng)價(jià)不同藥物的保護(hù)效果；通過檢測血清凝集效價(jià)、細(xì)胞吞噬功能和血清殺菌活力，比較不同藥物對(duì)中華鱉免疫力和抗病能力的影響；比較慶大霉素和溶菌酶血藥殘留濃度，評(píng)估藥物毒副作用。結(jié)果表明：天蠶素和溶菌酶二聯(lián)法對(duì)中華鱉保護(hù)效果最好、免疫效果最佳，與其他組相比差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；血藥殘留分析表明，溶菌酶在用藥后第6天全部代謝完畢，慶大霉素停藥第12天仍有殘留。天蠶素和溶菌酶二聯(lián)法預(yù)防中華鱉腐皮病效果顯著優(yōu)于抗生素，無藥物殘留和耐藥副作用，并提高免疫力，避免了應(yīng)用抗生素所帶來的危害，值得推廣應(yīng)用。

中華鱉； 天蠶素； 溶菌酶； 腐皮??； 預(yù)防

腐皮病是中華鱉Trionyxsinensis養(yǎng)殖過程中最為常見和難以治療的多發(fā)病，主要癥狀為全身體表皮膚糜爛壞死，以脖頸與四肢最為典型，隨著病情惡化，潰爛面積不斷擴(kuò)大，直至頸部皮膚及腳爪脫落，四肢骨骼外露，最后死亡(薛紅玲，2000；吳惠仙，2004)。此病由多種細(xì)菌侵染引起(張德群，2000)。本實(shí)驗(yàn)從患病中華鱉體內(nèi)檢測出的鰻氣單胞菌Aeromonasencheleia尚未見報(bào)道。目前常用抗生素藥物治療中華鱉腐皮病。隨著抗生素藥物的泛用和濫用，產(chǎn)生了一系列嚴(yán)重后果(汪以真等，2004)，如病原菌耐藥、養(yǎng)殖水質(zhì)惡化和藥物殘留，尤其是甲魚肌肉抗生素殘留對(duì)人體的損害尤為突出，已經(jīng)引起人們廣泛關(guān)注(丁明德，2015)。因此，尋找合適并有效的藥物或方法替代抗生素，是中華鱉健康養(yǎng)殖的迫切需要。

抗菌肽(antimicrobial peptide)是從生物體內(nèi)誘導(dǎo)出的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)。目前世界上已知的抗菌肽共2 000多種(陳琛等，2014；尹昆侖等，2015)?？咕膶?duì)部分真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有很強(qiáng)的殺傷作用，但對(duì)正常的真核細(xì)胞無毒性(David & Ayyalusamy，2008)，可應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域(單紅等，2012；李冠楠等，2014；梁英，2014；嚴(yán)沁等，2015)。天蠶素(cecropin)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物抗菌肽，是生物體抵御外源性微生物入侵而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)(Zasloff，2002)。大量研究表明，天蠶素能抑制多種畜禽病原菌(侯振平等，2011；呂尊周等，2011)。用抗菌肽作為飼料添加劑，能很好地解決飼用抗生素的問題，這也是抗菌肽在畜牧業(yè)上最直接的應(yīng)用。姜蘭等(2002)將基因重組抗菌肽的發(fā)酵產(chǎn)物濃縮干燥，添加到飼料中，對(duì)中華鱉紅脖子病、赤斑病、穿孔病等具有一定的防治效果。

溶菌酶(lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶(徐永平等，2011)。溶菌酶作為一種天然殺菌蛋白，能夠滅殺多種有害病菌(楊向科等，2005；劉瑩等，2006；張琇等，2007；Guzzoetal.，2011；Diasetal.，2015)。王壇等(2016)在吉富羅非魚Oreochromisniloticus的飼料中添加溶菌酶，可以顯著提高羅非魚血清抗菌性能。

本實(shí)驗(yàn)研究了天蠶素、溶菌酶對(duì)中華鱉腐皮病的預(yù)防效果，以期能夠找到一種抗生素替代物。實(shí)驗(yàn)先通過1周的預(yù)防性用藥，再人工感染病原菌，通過檢測致病菌感染后中華鱉的死亡率和相對(duì)保護(hù)率、細(xì)胞吞噬活性、血清凝集效價(jià)、慶大霉素和溶菌酶的血藥殘留濃度等指標(biāo)，論證天蠶素和溶菌酶替代抗生素的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)材料為北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心飼養(yǎng)的健康中華鱉，體質(zhì)量200 g±10 g，分別飼養(yǎng)在6個(gè)室內(nèi)水池(200 cm×500 cm×80 cm)中。控溫裝置控制水溫，馴養(yǎng)時(shí)間為1周，完全適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 細(xì)菌制備 鰻氣單胞菌為本中心從患腐皮病的中華鱉分離獲得。將活化的鰻氣單胞菌接種于LB培養(yǎng)液，37 ℃搖床180 r·min-1培養(yǎng)過夜，現(xiàn)用現(xiàn)制備，保持細(xì)菌活力。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 慶大霉素購自獸藥市場，天蠶素購于美力盾公司，溶菌酶購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，慶大霉素酶聯(lián)免疫試劑盒購自研域(上海)化學(xué)試劑有限公司，溶菌酶單克隆抗體購于SIGMA公司，其他試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 全部實(shí)驗(yàn)時(shí)間為20 d。前7 d為預(yù)防性用藥，第8天人工感染病原菌(一次性注射)，第9～20天觀察并采樣。

選取300只體質(zhì)量為200 g±10 g的健康中華鱉，隨機(jī)分為6組，每組50只。第1組為空白的陰性對(duì)照組，主要用于全部實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制，證實(shí)實(shí)驗(yàn)無外源因素干擾；第2組為病原菌感染的陽性對(duì)照組，用于與各個(gè)治療組做對(duì)照；第3組為慶大霉素組；第4組為天蠶素組；第5組為溶菌酶組；第6組為天蠶素和溶菌酶聯(lián)合組。實(shí)驗(yàn)環(huán)境光照、通風(fēng)良好，水溫31～33 ℃，飼料為甲魚專用餌料，每天15∶00投喂1次。養(yǎng)殖1周后進(jìn)行鰻氣單胞菌感染實(shí)驗(yàn)。

給藥劑量：生理鹽水100 μL，慶大霉素4.0×104U·kg-1，天蠶素10 mg·kg-1，溶菌酶10 mg·kg-1，天蠶素6 mg·kg-1和溶菌酶5 mg·kg-1混合物。

給藥方法：各種藥物均采用后腿肌肉注射，09∶00和17∶00各注射1次，連續(xù)注射7 d停藥。

鰻氣單胞菌感染方法：將鰻氣單胞菌制成濃度108cfu·mL-1的菌懸液備用。實(shí)驗(yàn)第8天，第2～6組實(shí)驗(yàn)中華鱉腹腔注射200 μL的活菌懸液，第1組注射等劑量的生理鹽水，放回實(shí)驗(yàn)室水箱中飼養(yǎng)，直到第20天實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

具體給藥和感染方法見表1。

表1 中華鱉給藥、感染方法

1.2.2 標(biāo)本采集和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 在鰻氣單胞菌感染后第2、4、6、8、10、12天，每天從各組中隨機(jī)取5只活鱉，斷頭取血，處理后保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)第20天，將各組剩余鱉全部斷頭法采血。將每只鱉的血液分為2份，其中1份用EDTA抗凝劑制備抗凝血；另1份于4 ℃、4000 r·min-1離心10 min，制備血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)中途鱉死亡立即斷頭采血，血樣處理后備用。

根據(jù)各實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，在SPSS 17.0中采用χ2檢驗(yàn)和單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。顯著性水平設(shè)為P<0.05。

1.2.3 相對(duì)保護(hù)率統(tǒng)計(jì) 每天統(tǒng)計(jì)每組實(shí)驗(yàn)中華鱉的死亡數(shù)，去除從各組中隨機(jī)宰殺的30只，統(tǒng)計(jì)死亡率的實(shí)驗(yàn)中華鱉基數(shù)為20只。于實(shí)驗(yàn)第20天統(tǒng)計(jì)死亡個(gè)數(shù)，計(jì)算死亡率和相對(duì)保護(hù)率。

相對(duì)保護(hù)率=[1-給藥組死亡率/陽性對(duì)照組死亡率)]×100%。

1.2.4 TTC還原法血細(xì)胞吞噬功能的測定 第6、8、10、12天收獲的實(shí)驗(yàn)中華鱉，每組共20只。

將氯化三苯四氮唑藍(lán)(TTC)用Hank’s液配成0.01%的溶液，取TTC 0.5 mL與抗凝血0.5 mL混勻后28 ℃孵育1 h，常規(guī)涂片，甲醇固定，用Wright’s液染色5 min，油鏡下觀察吞噬細(xì)胞結(jié)果。

吞噬率=(200個(gè)中性粒細(xì)胞中吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/200)×100%。

吞噬指數(shù)=200個(gè)中性粒細(xì)胞中吞噬細(xì)菌的細(xì)胞總數(shù)/200。

1.2.5 血清凝集效價(jià)的測定 第6、8、10、12天收獲的實(shí)驗(yàn)中華鱉，每組共20只。采用玻片凝集法將待測血清按倍比稀釋法進(jìn)行稀釋，取不同稀釋度的血清30 μL置于96孔板中，分別加入30 μL的2%雞血細(xì)胞懸液，混均后室溫下放置30 min，觀察有無發(fā)生凝集反應(yīng)。對(duì)照組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替血清，以發(fā)生凝集的血清最高稀釋度作為血清的凝集效價(jià)。

1.2.7 藥物殘留測定 在感染結(jié)束后的第2、4、6、8、10、12天，選取陽性對(duì)照組、慶大霉素組和溶菌酶組中的中華鱉各5只，斷頭法采血，血液于4 ℃，4000 r·min-1離心10 min，制備血清備用。

用慶大霉素酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒測定慶大霉素的殘留量，按試劑盒說明書操作。

雙抗體夾心法檢測溶菌酶殘留，在酶標(biāo)板中加入血清100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，棄上清，洗滌液洗滌3次，拍干，再加入不同濃度的酶標(biāo)抗體100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，棄上清，洗滌液洗滌3次，拍干，加底物A、B液總量達(dá)100 μL/孔，37 ℃孵育15 min，顯色后加終止液50 μL/孔，酶標(biāo)比色儀450 nm測光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 相對(duì)保護(hù)率

陰性對(duì)照組死亡率0%，而陽性對(duì)照組高達(dá)95%；與陽性對(duì)照組相比，3、4、5組的死亡率顯著降低(χ2檢驗(yàn)，P<0.01)，其中尤以第6組的天蠶素和溶菌酶聯(lián)合組效果顯著(χ2檢驗(yàn)，P<0.01)。天蠶素和溶菌酶單用的4、5組之間相對(duì)保護(hù)率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2檢驗(yàn)，P>0.05)；分別與第3組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2檢驗(yàn)，P<0.05)；而二者聯(lián)用，相對(duì)保護(hù)率明顯上升，第6組分別與第3、4、5組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2檢驗(yàn)，P<0.05)(表2)。

表2 不同藥物對(duì)中華鱉腐皮病死亡率和相對(duì)保護(hù)率的影響(n=20， χ2檢驗(yàn))

注： 表中上標(biāo)字母表示差異顯著性水平， 相同字母表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 相鄰字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 相間字母表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； 下同。

Notes： The superscript letters in the table indicates the significant difference levels: same letter indicates there is no significant difference(P>0.05)， adjacent letters indicate there is a significant difference(P<0.05)； alternate letters indicate there is an extremely significant difference (P<0.01)； the same below.

2.2 白細(xì)胞吞噬功能檢測

白細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬率檢測結(jié)果見表3。陰性對(duì)照組無菌感染。陽性對(duì)照組和給藥組檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，給藥組(3、4、5、6組)的吞噬指數(shù)和吞噬率均顯著高于陽性對(duì)照組(P<0.01)。其中，4、5、6組的白細(xì)胞吞噬能力又優(yōu)于第3組(P<0.01)。天蠶素和溶菌酶單用的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而天蠶素和溶菌酶聯(lián)用與單用的4、5組相比，效果顯著提升(P<0.01)。

表3 不同藥物對(duì)白細(xì)胞吞噬活性的影響(n=20)

2.3 血清凝集效價(jià)檢測

陽性對(duì)照組、慶大霉素組、天蠶素組、溶菌酶組、天蠶素與溶菌酶聯(lián)合組的血清凝集效價(jià)分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶6、1∶8。結(jié)果表明，給藥組的效價(jià)均高于陽性對(duì)照組，其中尤以天蠶素與溶菌酶聯(lián)用的效價(jià)最高，明顯高于慶大霉素組，也高于天蠶素和溶菌酶單用組。

2.4 血清殺菌活力檢測

不同藥物作用下，血清殺菌活力結(jié)果見表4。陰性對(duì)照組無菌感染。給藥各組與陽性對(duì)照組相比，血清殺菌活力均顯著提高。第4、5、6組與第3組相比，殺菌活力明顯較高，其中尤以聯(lián)用組活力最高(第6組與第3組相比，P<0.01)。而第4組與第5組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 不同藥物對(duì)血清殺菌活力的影響(n=20)

2.5 藥物殘留檢測

慶大霉素和溶菌酶藥物殘留測定結(jié)果見表5。結(jié)果表明，慶大霉素自停藥第8天開始，藥物代謝速度明顯下降，至第12天，仍有明顯殘留。而溶菌酶在第6天被全部吸收代謝，無任何殘留。

表5 慶大霉素和溶菌酶藥物殘留

3 討論

有資料證明，中華鱉腐皮病是由溫和氣單胞菌A.sobria、嗜水氣單胞菌A.hydrophila、豚鼠氣單胞菌A.caviae、維隆氣單胞菌A.veronii等多種氣單胞菌感染所致(崔青曼等，1998；薛紅玲，2000；吳惠仙，2004；沈文英等，2010；羅方興等，2013；鄭天倫，張海琪，2015)。本實(shí)驗(yàn)從患病中華鱉體內(nèi)檢測出鰻氣單胞菌，為革蘭氏陰性短桿狀。經(jīng)感染實(shí)驗(yàn)，與常見腐皮病癥狀相同并具有高致死率。中華鱉腐皮病常規(guī)治療藥物是抗生素(崔青曼等，1998；薛紅玲，2000；張德群，2000；張?zhí)┑伲?003)，抗生素的泛用、濫用，已經(jīng)不僅局限在人體醫(yī)療方面，也泛濫于家禽牲畜、水產(chǎn)等行業(yè)。土霉素、青霉素、慶大霉素等低廉的抗生素原料被廣泛摻入家禽牲畜、水產(chǎn)等飼料，而由此造成的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于人類抗生素過度使用所帶來的一系列副反應(yīng)。但現(xiàn)代高密度集約化的養(yǎng)殖模式，病菌感染尤為常見和多發(fā)，從而造成實(shí)際應(yīng)用中抗生素使用的必要性與政府禁用慎用之間的矛盾，因此，尋求新的替代類藥物尤為重要。

天蠶素具有廣譜殺菌效果(汪以真等，2004；李素萍等，2007；徐興軍等，2009；陳雯等，2012)，能夠?qū)Χ喾N水產(chǎn)常見菌株及耐藥菌株產(chǎn)生抗菌活性(姜蘭等，2002；李思明，2006；Chenetal.，2009；Leeetal.，2013)；溶菌酶對(duì)病原菌也具有較強(qiáng)的抑菌活性，而對(duì)諸如芽孢桿菌科Bacillaceae的有益菌則無抑制能力或抑制能力較弱(盧亞萍，潘宏濤，2008；Chenetal.，2014)。本研究表明，慶大霉素、天蠶素、溶菌酶及天蠶素和溶菌酶二聯(lián)法對(duì)鰻氣單胞菌引起的中華鱉腐皮病均具有保護(hù)作用。由死亡率和相對(duì)保護(hù)率結(jié)果分析，與陰性對(duì)照組相比，慶大霉素組的死亡率最高，保護(hù)效果較差，而聯(lián)合組的死亡率最低，表明天蠶素和溶菌酶聯(lián)合使用對(duì)中華鱉的保護(hù)效果最佳。通過檢測中華鱉血細(xì)胞吞噬功能、血清凝集效價(jià)和血清殺菌活力，結(jié)果表明，給藥的4組均比陽性對(duì)照組的免疫力強(qiáng)，表明這幾種藥物均具有保護(hù)作用；天蠶素組和溶菌酶組的免疫力高于慶大霉素組，而效果最明顯的是天蠶素與溶菌酶聯(lián)合組。

在血藥殘留的分析中，慶大霉素在停藥后有一個(gè)明顯的代謝高峰，但越到后期，代謝速度愈發(fā)減緩，而就是這少量的殘留給機(jī)體帶來一系列的問題。殘留的藥物濃度無抑菌保護(hù)作用，而細(xì)菌在這種低劑量藥物刺激下產(chǎn)生變異和耐藥性，使抗生素失效，如此就不得不加大抗生素用量，形成惡性循環(huán)。但溶菌酶的代謝不存在這個(gè)問題，體內(nèi)代謝完全，無任何殘留。天蠶素血藥殘留實(shí)驗(yàn)由于試劑出現(xiàn)問題未能完成，有待進(jìn)一步研究。

目前，天蠶素已在畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖方面被廣泛采用，而溶菌酶的應(yīng)用也逐漸受到重視。本研究將二者聯(lián)用，起到相輔相成、互助互益的功效，這在國內(nèi)尚屬首次。溶菌酶的發(fā)酵產(chǎn)品也已經(jīng)研發(fā)成功，為將來溶菌酶在食品飼料行業(yè)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。因此，本研究無論從新型抗生素替代治療方法還是研究結(jié)果的實(shí)用推廣，都具有重要意義。

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Study on Preventive Effect of Cecropin and Lysozyme on Skin Fester Disease ofTrionyxsinensis

CHEN Chunshan， GUO Minglei， WEI Kai， MA Long， GENG Yan

(Beijing Aquatic Wildlife Rescue and Conservation Center， Beijing 102100， China)

In order to study the preventive effect of peptides and biological antibiotics on the skin fester disease ofTrionyxsinensiscaused byAeromonasencheleia， 3 different groups of cecropin (10 mg·kg-1)， lysozyme (10 mg·kg-1) and mixed drugs (6 mg·kg-1cecropin and 5 mg·kg-1lysozyme， respectively) were used for intramuscular injection. The mortality rate and relative percent survival were then calculated to evaluate the protective effects of different drugs. Agglutination titer of serum， phagocytosis and bactericidal activity of serum were measured to compare the effects of different drugs on immunity and disease resistance ofT.sinensis. The residual concentrations of gentamicin and lysozyme were compared to evaluate drug toxic and side effects. The results showed that mixed drugs could extremely significant (P<0.01) protectT.sinensisand increase their immunity. Analysis of drug residue showed that lysozyme was completely metabolized after6 days， and in contrast， gentamicin still had residue until day 12 after withdrawal. Therefore， the preventive effect of mixed drugs is significantly better than antibiotics in skin fester disease ofT.sinensis. In addition， mixed drugs of lysozyme and cecropin are worthy of spreading to application in virtue of no drug residue and other side effects， especially avoiding the damage caused by abuse of antibiotics.

Trionyxsinensis； cecropin； lysozyme； skin fester disease； prevention

2016-12-24 接受日期：2017-02-22

北京市農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范項(xiàng)目(20110821)

陳春山(1962—)， 男， 高級(jí)工程師， 研究方向：水生野生動(dòng)物保護(hù)技術(shù)， E-mail:chenchunshan8888@126.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160368

Q959.6; S858.9

A

1000-7083(2017)03-0311-06