田雨竹， 張慧， 董路， 張亞

(1. 北京師范大學(xué)第二附屬中學(xué)，北京100088； 2. 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室，北京100875； 3. 北京市西城區(qū)青少年科學(xué)技術(shù)館，北京100037)

北京及周邊地區(qū)猛禽血液寄生蟲的感染率與多樣性

田雨竹1， 張慧1， 董路2， 張亞3*

(1. 北京師范大學(xué)第二附屬中學(xué)，北京100088； 2. 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室，北京100875； 3. 北京市西城區(qū)青少年科學(xué)技術(shù)館，北京100037)

利用分子檢測方法對2014—2015年北京及周邊地區(qū)3目20種126只猛禽血液寄生蟲的感染率和多樣性進(jìn)行調(diào)查。通過對猛禽血液寄生蟲線粒體Cytb基因的測序和系統(tǒng)發(fā)生分析，發(fā)現(xiàn)猛禽血液寄生蟲的感染率較低(7.94%)。通過與MalAvi數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定了7個譜系支，其中3個為新發(fā)現(xiàn)的血液變形蟲屬Haemoproteus譜系支，2個為首次在鸮形目Strigiformes中發(fā)現(xiàn)的譜系支。

猛禽； 血液寄生蟲； 感染率； Cytb基因

鳥類的健康直接影響鳥類的生存，是與鳥類保護(hù)和生物多樣性維持緊密聯(lián)系的重要科學(xué)問題(Bókonyetal.，2012)。對鳥類健康水平的評價，通常包括體征指標(biāo)、生理水平和疾病情況3個層次，其中疾病是導(dǎo)致鳥類健康狀況下降的最主要因素。禽瘧疾是在野生鳥類中廣泛流行的一種全球性傳染病，由血孢子蟲目Haemosporida的瘧原蟲屬Plasmodium、血液變形蟲屬Haemoproteus和住白細(xì)胞原蟲屬Leucocytozoon等血液寄生蟲引發(fā)，通過吸血昆蟲快速傳播，并在各鳥類類群中普遍發(fā)生(Valkiūnas，2004；Hellgrenetal.，2009)。隨著對這類疾病研究的深入，血液寄生蟲對鳥類健康狀況的影響愈加受到研究者的關(guān)注。已有研究表明，血液寄生蟲在很多方面對感染個體的適合度造成明顯影響，包括壽命、配偶選擇、繁殖成功率等，從而對種群存續(xù)構(gòu)成威脅(LaPointeetal.，2012；Asgharetal.，2015)。

猛禽包括鷹形目Accipitriformes、隼形目Falconiformes和鸮形目Strigiformes的鳥類(Hackettetal.，2008)，其物種數(shù)多，分布廣泛，大部分種類遷徙，在生態(tài)系統(tǒng)中起重要作用，是食物鏈頂端的動物(高瑋，2002；K?nig & Weik，2008)。對猛禽血液寄生蟲感染狀況的研究，有利于了解生態(tài)系統(tǒng)的健康水平。在我國，猛禽均為國家級重點保護(hù)野生動物，對其疫源疫病狀況的調(diào)查有利于開展保護(hù)工作。

目前對猛禽血液寄生蟲感染狀況的研究集中在歐洲、北美和非洲(Ortegoetal.，2007；Ishaketal.，2008；Kroneetal.，2008)。在東亞，僅在我國臺灣地區(qū)對3種猛禽的感染狀況進(jìn)行過初步研究(Hsuetal.，2015)，對其他地區(qū)猛禽感染血液寄生蟲的情況尚不了解。為此，本研究對北京及周邊地區(qū)猛禽血液寄生蟲的感染率和多樣性進(jìn)行了調(diào)查。

1 材料和方法

研究樣品由北京猛禽救助中心提供，在接收猛禽后的3 d內(nèi)通過肱靜脈采血，2014年和2015年采集到3目20種126只猛禽的血液樣品。利用TIANamp血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取血液樣品DNA，溶解于TE緩沖液中，-20 ℃保存。

相比于傳統(tǒng)的血涂片檢測，分子檢測具有更高的準(zhǔn)確性和效率(周婕等，2016)。采用Hellgren等(2004)設(shè)計的巢式PCR引物，對鳥類瘧原蟲和血液變形蟲細(xì)胞色素b(Cytb)基因的479 bp片段進(jìn)行擴增，擴增反應(yīng)包括2輪，每輪PCR反應(yīng)體系均為10 μL，其中上下游引物各0.2 μL(10 pM)，DNA模板0.6 μL，ExTaq mix(TaKaRa，日本)5 μL，ddH2O 4 μL。

第一輪擴增引物為HaemNFI(5’-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3’)和HaemNR3(5’-ATAGAAA-GATAAGAAATACCATTC-3’)。反應(yīng)程序為：94 ℃模板變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火35 s，72 ℃延伸75 s(20個循環(huán))；72 ℃延伸7 min。第一輪擴增反應(yīng)的產(chǎn)物取出1 μL作為第二輪擴增的模板，剩余產(chǎn)物4 ℃保存。

第二輪擴增引物為HAEMF(5’-ATGGTGCTTT-CGATATATGCATG-3’)和HAEMR2(5’-GCATTATCTGGATGTGATAATGGT-3’)。反應(yīng)程序為：94 ℃模板變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火35 s，72 ℃延伸75 s(35個循環(huán))；72 ℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳對第二輪擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。電泳檢測為陽性的樣品，以第一輪擴增產(chǎn)物為模板，配制40 μL反應(yīng)體系進(jìn)行第二輪擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送北京六合華大基因科技有限公司使用3730XL(ABI，美國)測序。

用MEGA 6.0對Cytb基因的雙向測序結(jié)果進(jìn)行拼接和對位。利用MalAvi數(shù)據(jù)庫中的BLAST模塊(http://mbio-serv2.mbioekol.lu.se/Malavi/blast.html)搜索與所測得寄生蟲單倍型最相近的譜系支，并初步判定檢測寄生蟲的所屬類群。計算猛禽血液寄生蟲的總感染率和各類群間的感染率。利用SPSS 17.0對各種猛禽的感染率差異進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。

選取MalAvi數(shù)據(jù)庫(Benschetal.，2009)中可感染猛禽的4種血液寄生蟲(GenBank登錄號：AF495571、AF495576、DQ368381、KF192997)，與本研究所測得的單倍型共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)Outlaw和Ricklefs (2011)構(gòu)建的血孢子蟲目系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，選擇猛禽中檢測到的住白細(xì)胞原蟲序列(Valkiunas，2004)作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外群。用BEAST 1.7.5 (Drummond & Rambaut，2007)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用馬爾可夫鏈蒙特卡洛方法(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)獨立運行2次，每次運行1×109代，每10萬代保存一次樹。在Tracer 1.5中檢查2次運行的吻合程度，以避免MCMC起始樹的不同對分析結(jié)果造成的偏向性，各參數(shù)的ESS達(dá)到200以上表明樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可信。運行完成后舍棄前1 000棵樹(burnin=1 000)，利用TreeAnotator 1.7.5計算各樹的似然值，選出最大置信樹，并計算各分支節(jié)點的后驗概率。

2 結(jié)果

2.1 猛禽血液寄生蟲的感染率

2.2 猛禽血液寄生蟲的多樣性

感染猛禽的血液寄生蟲包括瘧原蟲的2個譜系支和血液變形蟲的5個譜系支(表2)，其中血液變形蟲在感染的5種猛禽中均被檢測到，而瘧原蟲僅在2種猛禽中被檢測到(圖1)。經(jīng)與MalAvi數(shù)據(jù)庫比對，本研究新發(fā)現(xiàn)的譜系支有3個(H2、H3和H4)，均為血液變形蟲。另外4個譜系支與MalAvi數(shù)據(jù)庫中已有序列完全相同，但是H1(LK03)和H6(ORW1)為首次在鸮形目鳥類中發(fā)現(xiàn)，H1(LK03)和H5(BUBIBI01)為首次在亞洲的鳥類中被檢測到。

2.3 猛禽血液寄生蟲的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

表1 北京及周邊地區(qū)猛禽血液寄生蟲的感染率

表2 北京及周邊地區(qū)猛禽血液寄生蟲的譜系支與宿主種類

所檢測到的7個寄生蟲譜系支都不能鑒定到具體的形態(tài)學(xué)物種，但是H7(BT7)與彎形瘧原蟲Plasmodiumcircumflexum的親緣關(guān)系很近，可能為同一個物種，而新發(fā)現(xiàn)的3個譜系支(H2、H3和H4)與H5(BUBIBI01)形成一個單系群，與已知可感染猛禽的血液寄生蟲物種親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，可能為不同物種(圖2)。

3 討論

通過對2014—2015年北京及周邊地區(qū)126只猛禽的檢測，首次報道了中國北方地區(qū)多種猛禽血液寄生蟲的感染狀況，發(fā)現(xiàn)其血液寄生蟲的總感染率(7.94%)與臺灣地區(qū)猛禽的感染率(7.24%)相似(Hsuetal.，2015)，但明顯低于歐洲猛禽的感染率(21.8%)(Kroneetal.，2008)。Gutiérrez-López等(2015)發(fā)現(xiàn)，長距離遷徙的猛禽具有較低的血液寄生蟲感染率，因此，東亞猛禽血液寄生蟲較低的感染率，可能與本地區(qū)長距離遷徙的猛禽較多(高瑋，2002)有關(guān)。此外，東亞地區(qū)與歐洲所流行的血液寄生蟲種類不同(Zhangetal.，2014；Huangetal.，2015)，也可能導(dǎo)致其對猛禽的感染力存在差異。相比北京地區(qū)雀形目Passeriformes鳥類24.8%的感染率(Huangetal.，2015)，猛禽的感染率也較低，這可能與猛禽和雀形目鳥類對血液寄生蟲免疫能力存在差異有關(guān)(Martínez-Abraínetal.，2004)。

圖1 2014—2015年北京及周邊地區(qū)猛禽中瘧原蟲屬與血液變形蟲屬的感染率

圖2 基于Cyt b序列構(gòu)建的猛禽血液寄生蟲貝葉斯樹

節(jié)點上的數(shù)字為后驗概率(<0.9的未標(biāo)出)； 單倍型名稱同表2(括號中為MalAvi數(shù)據(jù)庫已收錄的相同譜系支名稱)。

The number on the node were the posterior probability (only showed the posterior probability>0.9)； the haplotype names were corresponding to table 2 (name in bracket was the same with that recorded in MalAvi database).

在北京及周邊地區(qū)，猛禽所感染的血液寄生蟲種類可能與寄生蟲的宿主專一性和猛禽的分布區(qū)有關(guān)。目前普遍認(rèn)為，血液變形蟲屬以專性寄生為主，宿主種類較少；而瘧原蟲屬以泛性寄生為主，宿主種類較多(Valkiūnas，2004)。本研究檢測到的血液變形蟲屬譜系支中，H1(LK03)、H5(BUBIBI01)以及與H2和H3兩個新發(fā)現(xiàn)譜系支高度相似的LK04，已知宿主僅限于歐洲的黃爪隼Falconaumanni、艾氏隼Hieraaetusayresii(Ortegoetal.，2007；Kroneetal.，2008；Gutiérrez-Lópezetal.，2015)和臺灣地區(qū)的紅隼(Hsuetal， 2015)，本研究檢測的隼類也僅感染以上譜系支，證實了這些寄生蟲對于隼形目鳥類具有較強的宿主專一性。但同時也在長耳鸮Asiootus和雀鷹Accipiternisus中各檢測到一例感染個體，從而拓展了對其宿主類群的認(rèn)識。

對于譜系支CELEC01，此前僅在分布于非洲的佛法僧目Coraciiformes和雀形目鳥類中檢測到，本研究在鷹鸮Ninoxscutulata中發(fā)現(xiàn)該譜系支是對其分布區(qū)及宿主類群的新認(rèn)識。結(jié)合鷹鸮屬Ninox主要分布區(qū)位于亞洲南部和非洲(K?nig & Weik，2008)，以及Gutiérrez-López等(2015)發(fā)現(xiàn)猛禽常在越冬地感染血液寄生蟲的特點，推測此鷹鸮個體可能是自我國華北地區(qū)的繁殖地遷徙至東南亞地區(qū)越冬時感染了該寄生蟲。

瘧原蟲屬中檢測到的2個譜系支可感染的宿主物種都多于血液變形蟲屬。ORW1在MalAvi數(shù)據(jù)庫中記錄到的宿主已達(dá)4目16種，而BT7的宿主多達(dá)4目38種，呈明顯泛性寄生特點。但是這2種寄生蟲的主要分布區(qū)不同。ORW1主要見于東洋界和大洋洲鳥類(Ishtiaqetal.，2007；Clarketal.，2015)；而BT7主要見于古北界和新北界鳥類(Kroneetal.，2008；Oakgroveetal.，2014)，也是北京地區(qū)雀形目鳥類中主要流行的血液寄生蟲(Huangetal.，2015)。由此推測，本研究中感染ORW1的鷹鸮同樣有可能是在越冬地染病，而檢測到BT7的雀鷹很可能是在北方的繁殖地或遷徙中停留地受到感染。

大多數(shù)猛禽具有長距離遷徙的特點，如果猛禽在生活史不同階段都可以感染血液寄生蟲，將有可能導(dǎo)致不同地區(qū)的血液寄生蟲借助猛禽的遷徙進(jìn)行長距離擴散，從而導(dǎo)致疾病的傳播。因此，在不同地點和不同時期開展猛禽血液寄生蟲感染狀況的監(jiān)測，一方面有助于對猛禽的健康狀況進(jìn)行更為全面的評估，從而科學(xué)有效地開展猛禽的保護(hù)與救助工作；另一方面，將有助于深入認(rèn)識鳥類遷徙對疾病傳播風(fēng)險的影響，從而為動物疫源疫病的預(yù)警和防控提供科學(xué)支撐。

致謝：感謝北京猛禽救助中心為本研究提供的樣品，以及戴暢、張帥和周蕾在采樣過程中提供的幫助。感謝周婕和劉博野在實驗和數(shù)據(jù)分析中給予的建議。

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Prevalence and Lineage Diversity of Avian Blood Parasites in Raptors in Beijing and Neighboring Region

TIAN Yuzhu1， ZHANG Hui1， DONG Lu2， ZHANG Ya3*

(1. The Second High School Attached to Beijing Normal University， Beijing 100088， China； 2. Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering， College of Life Sciences， Beijing Normal University，Beijing 100875， China； 3. Youth Science and Technology Center of Beijing Xicheng District， Beijing 100037， China)

In 2014 and 2015， the infection rates and lineage diversity of avian blood parasites were surveyed in the raptors in/around Beijing. Based on nest PCR examination， only 7.94% of the raptors (n=126) were infected. A total of7 lineages were identified by DNA sequencing of Cytband phylogenetic analysis. Comparing to MalAvi database， 3Haemoproteuslineages were newly reported and 2 lineages were first discovered in Strigiformes.

raptor； avian blood parasite； prevalence； Cytb

2017-01-03 接受日期：2017-02-22

國家林業(yè)局野生動物疫源疫病監(jiān)測項目

田雨竹(1999—)， 女， E-mail:632206540@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail:kjgzy@qq.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20170003

Q959.7； Q958.9

A

1000-7083(2017)03-0336-05