高 飏， 蔣祖軍

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510010)

羊蹄根對(duì)免疫性血小板減少性紫癜模型小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1及其受體的影響

高 飏， 蔣祖軍

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510010)

目的：通過建立免疫性血小板減少性紫癜模型(ITP)小鼠，觀察羊蹄根提取物對(duì)小鼠外周血轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)以及受體的影響，對(duì)羊蹄根提取物的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行探討。方法：將40只BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組，分別是陽性對(duì)照組、模型組、羊蹄根提取物組、陰性對(duì)照組。除陰性對(duì)照組外，其余各組均采用腹腔注射豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)的免疫造模方法進(jìn)行ITP造模。采用實(shí)時(shí)PCR方法及Western Blot法檢測給藥前與給藥14d后各組小鼠的TGF-β1、受體TGF-βR表達(dá)量的變化。結(jié)果：與陰性對(duì)照組比較，模型組TGF-β1的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；TGF-β1mRNA以及TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，羊蹄根提取物組TGF-β1的表達(dá)量明顯偏低(P<0.05)；TGF-β1mRNA以及TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯偏高(P<0.05)。結(jié)論：羊蹄根提取物對(duì)ITP造模小鼠免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，具體通過影響TGF-β1以及受體實(shí)現(xiàn)。

羊蹄根提取物； 血小板減少性紫癜； 模型小鼠； 轉(zhuǎn)化生長因子-β1； 受 體

免疫性血小板減少性紫癜是自身免疫性疾病，主要是一種由于抗血小板抗體介導(dǎo)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)破壞引發(fā)的出血現(xiàn)象，與機(jī)體自身免疫系統(tǒng)失調(diào)引起血小板數(shù)目減少有關(guān)[1]。ITP的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但目前普遍認(rèn)為與某些影響免疫活性細(xì)胞因子的作用有關(guān)[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1是一種影響細(xì)胞分化、生長、凋亡以及免疫的多功能蛋白，可以通過結(jié)合于細(xì)胞表面或該蛋白的受體發(fā)揮其作用，據(jù)報(bào)道，TGF-β1及其受體的表達(dá)量會(huì)影響ITP的發(fā)病[3,4]。據(jù)報(bào)道，羊蹄根提取物具有治療小鼠血小板減少癥的作用[5]。本研究采用RT-PCR檢測給藥前與給藥14d后各組小鼠的TGF-β1、受體TGF-βR表達(dá)量的變化，Western Blot檢測TGF-β1受體蛋白表達(dá)，探討羊蹄根提取物對(duì)ITP小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/C小鼠40只，體重范圍18～22g，雌雄各半。普通級(jí)豚鼠4只，體重范圍300～350g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK-(魯)20140011。

1.2 主要試劑：完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑(美國Sigma公司產(chǎn)品)；羊蹄根提取物采自于吉林市郊區(qū)，經(jīng)粉碎采用乙醚，提取后使用濃度為0.5g生藥/kg；醋酸潑尼松片(天津太平洋制藥有限公司)。

1.3 豚鼠抗血小板抗血清的制備[6]：采用乙醚麻醉BALB/C小鼠后用EDTA-Na 2進(jìn)行抗凝，于小鼠心臟取血并分離血小板、洗滌，用生理鹽水進(jìn)行稀釋，并與等量完全福氏佐劑混合，注射于豚鼠皮下、足掌及背。采用不完全福氏佐劑于1、2、4周重復(fù)上述操作，第5周開始進(jìn)行豚鼠心臟采血，分離抗血小板抗血清(APS)。

1.4 造模[7]：采用注射APS方法建立小鼠ITP模型，于本個(gè)月內(nèi)隔天腹腔注射1：4稀釋的APS，劑量為100μL/20g。

1.5 試驗(yàn)分組方法：40只BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別陽性對(duì)照組、模型組、羊蹄根提取物組、陰性對(duì)照組。除陰性對(duì)照組外，其余均進(jìn)行ITP造模。其中陰性對(duì)照組與模型組小鼠灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液；陽性對(duì)照組小鼠灌胃給予醋酸潑尼松，劑量為5mg/kg；羊蹄根提取物組小鼠灌胃給予羊蹄根提取物提取物，劑量為0.5g(生藥)/kg。

1.6 TGF-β1及TGF-β受體(TGF-βR)mRNA表達(dá)的RT-PCR法檢測：細(xì)胞中TGF-β1及其受體提取方法依照TRIzol說明書進(jìn)行，采用紫外分光光度儀進(jìn)行純度與濃度的檢測，A 260 nm /A 280 nm> 1.8。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成(見表 1)。cDNA 的合成方法參照M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶的說明書。PCR 反應(yīng)體系 20 μL。

表1 PCR 檢測TGF-β1及其受體的引物

1.7 Western Blot檢測TGF-β1受體蛋白表達(dá)：提取脾組織蛋白后使用酚試劑測定蛋白濃度。將制備的4%濃縮膠以及10%分離膠、marker和待測樣品各50μL上樣。于硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)印，且先后與一抗和二抗孵育、顯色劑顯色后用FlourChem V 2.0凝膠成像軟件分析結(jié)果，分析條帶吸光度相對(duì)值進(jìn)行比較。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，其中計(jì)量數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較可采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用Q檢驗(yàn)，血小板計(jì)數(shù)采用重復(fù)方差檢驗(yàn)。認(rèn)為P<0.05時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ITP模型的評(píng)價(jià)：根據(jù)上述方法進(jìn)行小鼠造模，由圖1可見，造膜前后模型組小鼠血小板數(shù)目持續(xù)減低，與造模前相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.462, P<0.01)，說明造模成功，可用于后續(xù)研究，見表1。

表2 造膜前后模型組小鼠血小板數(shù)目對(duì)比

表3 不同組別間ITP模型小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)及其受體含量變化

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 ITP模型小鼠外周血血小板數(shù)量的變化

2.2 羊蹄根提取物對(duì)ITP模型小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)及其受體含量變化的影響：經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的TGF-β1水平高于陰性對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。采用陽性對(duì)照藥及羊蹄根提取物給藥治療后，陽性對(duì)照組及羊蹄根提取物組小鼠血清TGF-β1水平較模型組相比明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。且羊蹄根提取物組降低TGF-β1作用較陽性對(duì)照組明顯(P<0.01)，說明羊蹄根提取物對(duì)ITP模型小鼠TGF-β1水平作用明顯，可以有效促進(jìn)血小板的生成。具體結(jié)果見表2。Western Blot檢測TGF-β1受體蛋白表達(dá)圖見圖2。

圖2 不同組TGF-β受體的表達(dá)電泳圖

3 討 論

免疫性血小板減少性紫癜是一種無明顯外因?qū)е卵“鍞?shù)目減少以及皮膚黏膜出血的獲得性免疫疾病。數(shù)年來人們對(duì)該病發(fā)病機(jī)制不斷進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITP病因可能是T細(xì)胞亞群功能改變、T細(xì)胞的異常激活、血小板膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)的改變以及的巨核細(xì)胞及血小板成熟障礙等，但具體發(fā)病機(jī)制尚未闡明。

近年來，隨著人們對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β1的不斷研究與認(rèn)識(shí)，認(rèn)為該因子及其受體體內(nèi)表達(dá)量的差異會(huì)對(duì)ITP的發(fā)病有所影響[8,9]。主要表現(xiàn)為對(duì)巨核細(xì)胞及血小板在增殖、分化以及成熟階段的負(fù)性作用影響[10]。本研究中也同樣得到證實(shí)，ITP模型組小鼠體內(nèi)TGF-β1的表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組小鼠，TGF-β1mRNA以及TGF-β1蛋白的表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組小鼠，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明TGF-β1及其受體的表達(dá)量的變化為一種ITP的發(fā)病機(jī)制。模型小鼠的TGF-β1及其受體的表達(dá)量會(huì)受到病情變化影響。

研究表明[11]羊蹄跟中含有的大黃酚能夠?qū)彝靡约靶∈蟮难龝r(shí)間具有縮短作用，且可以增強(qiáng)促進(jìn)骨髓制造血小板，提高體內(nèi)血小板含量。同時(shí)羊蹄根提取物因其清熱解毒的作用，可以有效緩解激素引起的不良反應(yīng),降低毒副作用，提高療效。本研究針對(duì)羊蹄根提取物的抗凝特性，通過在ITP小鼠模型上采用羊蹄根提取物干預(yù)治療，從轉(zhuǎn)化生長因子-β1變化機(jī)制方面對(duì)羊蹄根提取物治療ITP小鼠的療效進(jìn)行探討。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，潑尼松對(duì)TGF-β1及其受體有明確作用，因此研究中采用該藥作為陽性對(duì)照藥[12]。結(jié)果表明，羊蹄根提取物通過影響轉(zhuǎn)化生長因子-β1及其受體的表達(dá)量，對(duì)ITP小鼠免疫功能具有一定恢復(fù)作用，且與陽性藥醋酸潑尼松相比效果更為明顯，因此可以作為ITP治療的新型手段。

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Effects of Rumex Japonicus Houttextract on Transforming Growth Factor-β1and Receptors in Thrombocytopenic Purpura Mice

GAOYang,JIANGZujun

(TheGenenralHospitalofPLAinGuangzhouMilitaryArea,GuangdongGuangzhou, 510010China)

Objective:To observe the effects of Rumex japonicus Houtt extract on transforming growth factor-β1and its receptors in thrombocytopenic purpura mice model. Methods: 40 BALB/C mice were randomly divided into positive control group, model group, rumex japonicus houtt extract group and negative control group. All ITP mouse model were made by injected guinea pig-antimouse platelet serum (GP-APS) except negative control group. The expressions of TGF-β1and their receptors TGF-βR in the peripheral blood of mice were detected by the real-time PCR and Western Blot, and differences of their expression levels were analyzed. Results: The expression of TGF-β1in ITP model group was significantly higher than that in the negative control group (P<0.05), while the TGF-β mRNA and TGF-β protein expression in ITP model group were significantly lower than that in the negative control group (P<0.05). The expression of TGF-β1in rumex japonicus houtt extract group was significantly lower than that in the ITP model group (P<0.05), while the TGF-β mRNA and TGF-β protein expression in rumex japonicus houtt extract group were significantly higher than that in the ITP model group (P<0.05). Conclusion: Rumex japonicus houtt extract can regulate the immune function of ITP by in fluencing the expression of transforming growth factor-β1and its receptors.

Rumex japonicus houtt extract; Immune thrombocytopenic purpura; Model mouse; Transforming growth factor-β1; Receptors

1006-6233(2017)05-0741-04

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目，(編號(hào)：2013B0313441)

蔣祖軍

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.05.011