黃 寰， 陸志鋒， 陳晞明， 張慧敏， 李紀(jì)明

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科, 廣東 廣州 510150 2.上海同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心內(nèi)科, 上海 200000)

miR-145通過下調(diào)LRRFIP1抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移機(jī)制

黃 寰1， 陸志鋒1， 陳晞明1， 張慧敏1， 李紀(jì)明2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科, 廣東 廣州 510150 2.上海同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心內(nèi)科, 上海 200000)

目的：探究miR-145抑制血管平滑肌增殖和遷移的機(jī)制。方法:采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測血管平滑肌細(xì)胞miR-145的表達(dá)。采用mimics-miR-145轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞，然后利用熒光素酶檢測和Western blot檢測miR-145在平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。結(jié)果:體外過表達(dá)miR-145，可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，反之，下調(diào)miR-145促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。LRRFIP1與miR-145表達(dá)負(fù)相關(guān)，下調(diào)LRRFIP1可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移。結(jié)論:miR-145可能通過下調(diào)LRRFIP1抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。

血管平滑肌細(xì)胞; miR-145; RAF作用蛋白; 增 殖; 遷 移

自體靜脈移植、血管腔內(nèi)成形術(shù)是目前治療閉塞性疾病的有效手段，但是血管成形術(shù)后血管早期再狹窄一直是困擾治療效果的一大難題[1～3]。臨床觀察證實(shí)，術(shù)后1年血管的閉塞率達(dá)15%～30%，并且逐年遞增，10年通暢率僅為50%。研究證明，血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)從基質(zhì)遷移至內(nèi)膜下并增殖是導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成和血管再狹窄形成的主要原因。血管損傷或血管吻合術(shù)后，在多種因素的參與下，早期即出現(xiàn)血管內(nèi)血栓形成和中晚期的血管內(nèi)膜增生，這些因素共同導(dǎo)致血管早期的再狹窄。VSMC的增殖和遷移是血管增殖性疾病發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，異常的VSMC增殖、遷移是血管再狹窄、硬化閉塞等心血管疾病的主要特征，這已成為諸多科研工作者的共識[4～6]。LRRFIP1(也稱TRAF作用蛋白，TRIP)是腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，包含一個(gè)RING手指序列和一個(gè)擴(kuò)展的coiled-coil區(qū)域。miRNAs是小的非編碼RNA分子綁定在靶mRNAs的3’非翻譯區(qū)域，導(dǎo)致翻譯抑制和mRNA退化，在各種各樣的生物學(xué)事件比如增殖，進(jìn)展，分化和細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色[7～9]。本研究中，我們的目的是確定miR-145在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)和功能，并探討miR-145參與血管平滑肌細(xì)胞的發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株：293FT細(xì)胞株：慢病毒包裝細(xì)胞株293FT購自上海中科院細(xì)胞庫。人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞株(VSMC)：購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：miR-145類似物，抑制劑和非特異性miRNA負(fù)調(diào)控分子是從銳博生物公司購買的。LRRFIP1的小干擾RNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)的。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞做實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。所有檢測均獨(dú)立進(jìn)行三次。

1.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn)：CCK-8試劑盒測定細(xì)胞增殖特性，嚴(yán)格按照說明指示。細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24、48、72和96h 37℃在箱中5%的CO2。在450nm處的吸光度測定。所有檢測均獨(dú)立進(jìn)行三次。

1.4 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)：細(xì)胞的侵襲能力的測定采用Transwell侵襲小室(Abcam公司，美國)，嚴(yán)格按照說明進(jìn)行。培養(yǎng)48h后，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到上腔無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)。所有檢測均獨(dú)立進(jìn)行三次。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將miRNA和mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.逆轉(zhuǎn)錄是使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行的。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用SYBR Green PCR 試劑盒在ABI7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行的，操作過程按照廠家說明書。miR-145的表達(dá)均一化到U6，LRRFIP1 mRNA均一化到GAPDH。所有的試驗(yàn)都重復(fù)三次。相關(guān)基因的表達(dá)用2-△△Ct的方法計(jì)算。

1.6 熒光素酶試驗(yàn)檢測試驗(yàn)：LRRFIP1的3’非翻譯區(qū)域序列預(yù)測與miR-145有關(guān)，或者是預(yù)測靶點(diǎn)的一個(gè)變異序列整合和插入在pGL3的催化劑載體pGL3-LRRFIP1-wt和pGL3-LRRFIP1-mut.細(xì)胞是在一個(gè)24孔培養(yǎng)皿中培育的，然后分別用miR-145類似物或miRNA控制物，含有螢火蟲熒光素酶的野生型或者突變型pGL3-LRRFIP1質(zhì)粒，含有海腎熒光素酶的pGL3-LRRFIP1載體轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)體2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞并且用雙熒光素酶報(bào)告分析。所有檢測均獨(dú)立進(jìn)行三次。

2 結(jié) 果

2.1 miR-145抑制細(xì)胞增殖和遷移：CCK-8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145 analogue組與Control組比較，24h后，血管平滑肌細(xì)胞增殖能力未見明顯差異性變化(miR-145 analogue組為0.26±0.01，Control組為0.25±0.01，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。48h后血管平滑肌增殖能力有差異性變化(miR-145 analogue組為0.73±0.11，Control組為0.95±0.21，P<0.05)。轉(zhuǎn)染72h后，差異更加明顯(miR-145 analogue組為1.45±0.24，Control組為1.03±0.13，P<0.05)。轉(zhuǎn)染96h后，差異更加明顯(miR-145 analogue組為3.15±0.54，Control組為2.03±0.33，P<0.01)。轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor與Control組比較，24h后，血管平滑肌細(xì)胞增殖能力未見明顯差異性變化(miR-145 inhibitor為0.24±0.01，Control組為0.25±0.01，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。48h后血管平滑肌細(xì)胞增殖能力未見明顯差異性變化(miR-145 inhibitor為0.78±0.01，Control組為0.95±0.21，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。轉(zhuǎn)染72h后，差異明顯(miR-145 inhibitor組為0.75±0.24，Control組為1.03±0.13，P<0.01)。轉(zhuǎn)染96h后，差異更加明顯(miR-145 inhibitor組為0.85±0.24，Control組為2.03±0.33，P<0.01),見圖1。

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Control組相比較，miR-145 analogue組血管平滑肌細(xì)胞遷移穿透小室膜孔的能力明顯下降，miR-145 inhibitor組血管平滑肌細(xì)胞遷移穿透小室膜孔的能力明顯上升。Contorl組遷移數(shù)為(50±12)個(gè)；miR-145 analogue組(35±6個(gè))；miR-145 inhibitor組(300±20個(gè))(P<0.01)。見圖1。

圖1 miR-145抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移

A：在miR-145類似物和抑制劑中miR-145的表達(dá)量；B：miR-145抑制平滑肌細(xì)胞的增殖；C：miR-145抑制平滑肌細(xì)胞的遷移。aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組。

2.2 LRRFIP1是miR-145的一個(gè)直接靶點(diǎn)：LRRFIP1 mRNA的3’非翻譯區(qū)域含有一個(gè)miR-145的靶點(diǎn)。為確定LRRFIP1是miR-145的一個(gè)直接靶點(diǎn)，進(jìn)行了熒光素酶檢測試驗(yàn)。結(jié)果表明miR-145明顯抑制野生型而不是變異型LRRFIP1的3’-UTR的熒光素酶活性(P<0.01)。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示miR-145的過表達(dá)顯著降低血管平滑肌細(xì)胞LRRFIP1的表達(dá)(P<0.01)。見圖2。

圖2 LRRFIP1的直接作用靶點(diǎn)

A：熒光素酶活性檢測；B：LRRFIP1的相對表達(dá)量。bP<0.01 vs 對照組

2.3 LRRFIP1對細(xì)胞增殖和遷移的影響：CCK-8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-LRRFIP1組與si-SMC Control組比較，24h后，血管平滑肌細(xì)胞增殖能力未見明顯差異性變化(si-LRRFIP1組為0.13±0.01，si-SMC Control組為0.14±0.01，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。48h后血管平滑肌增殖能力有差異性變化(si-LRRFIP1組為1.03±0.11，si-SMC Control組為0.35±0.14，P<0.05)。轉(zhuǎn)染72h后，差異更加明顯(si-LRRFIP1組為1.45±0.34，si-SMC Control組為0.48±0.08，P<0.05)。轉(zhuǎn)染96h后，差異更加明顯(si-LRRFIP1組為2.15±0.44，si-SMC Control組為0.72±0.31，P<0.01)。見圖3。

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與si-SMC Control組相比較，si-LRRFIP1組血管平滑肌細(xì)胞遷移穿透小室膜孔的能力明顯下降。si-SMC Control組遷移數(shù)為(150±22個(gè))(P<0.01)。見圖3。

圖3 LRRFIP1對細(xì)胞增殖和遷移的影響情況

A：si-SMC和si-LRRFIP1中miR-145的相對表達(dá)量；B：LRRFIP1對細(xì)胞增殖的影響情況；C：LRRFIP1對細(xì)胞遷移的影響情況。aP<0.05，bP<0.01 vs si-SMC組。

3 討 論

本研究探究miR-145在血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145過表達(dá)明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，相反，miR-145的表達(dá)下調(diào)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。結(jié)果表明miR-145可能在血管平滑肌的增殖和遷移中抑制閉塞性疾病。進(jìn)一步研究了miR-145抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制。

TRIP蛋白的N-端的序列與FLI結(jié)合蛋白FLAP的N-端序列有著高度同源性，能與DLILRR蛋白結(jié)合，因此TRIP也稱LRRFIP1。TRIP位于胞質(zhì)內(nèi)，能與雙鏈RNA結(jié)合，是腫瘤壞死因子受體超家族成員。我們用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)確定了在血管平滑肌細(xì)胞中LRRFIP1是miR-145的一個(gè)直接靶點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)LRRFIP1的mRNA的3'非翻譯區(qū)域包含著一個(gè)miR-145的補(bǔ)充序列。miR-145的過表達(dá)顯著降血管平滑肌細(xì)胞LRRFIP1的表達(dá)。LRRFIP1基因是轉(zhuǎn)錄因子的LRRFIP1家族的一個(gè)成員，在胚胎發(fā)育，細(xì)胞分化和增殖中扮演重要角色[10-13]。此外，大量的研究顯示miRNAs在LRRFIP1的調(diào)節(jié)中扮演著重要角色。然而LRRFIP1在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)機(jī)制仍然不清楚的。敲除LRRFIP1抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[11, 12]。

miRNA是一類18～25nt的調(diào)控性非編碼單鏈小分子RNA，由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的長度為70～80nt的單鏈miRNA前體剪切后生成。它通過與靶mRNA分子作用后發(fā)揮作用，在體內(nèi)代謝過程中起到多種調(diào)控作用[14-17]。研究表明LRRFIP1在血管平滑肌是miR-145的一個(gè)功能性靶基因，并且miR-145的過表達(dá)與LRRFIP1的低表達(dá)相關(guān)，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[18-22]?？傊?，miR-145通過下調(diào)LRRFIP1抑制閉塞性疾病，miR-145可能是閉塞性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

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1006-6233(2017)05-0793-04

2012年國家青年科學(xué)基金項(xiàng)目，(編號：81100166)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.05.026