石安迪曾林劉靜

1.暨南大學口腔醫(yī)學院；2.口腔修復學教研室，廣州 510632

偏側(cè)咀嚼致大鼠咬肌肌纖維代謝特征改變及其腺苷酸活化蛋白激酶調(diào)節(jié)機制

石安迪1曾林1劉靜2

1.暨南大學口腔醫(yī)學院；2.口腔修復學教研室，廣州 510632

目的 探討偏側(cè)咀嚼對大鼠咬肌肌纖維代謝特征的影響及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）對肌纖維代謝特征變化的調(diào)控作用。方法 拔除大鼠右上頜磨牙建立偏側(cè)咀嚼大鼠模型，實驗組分為2、4、6、8周組，設同期對照組。應用輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶（NADH-TRase）染色法檢測咬肌肌纖維有氧代謝類型以及各型肌纖維的分布密度和構成比；用Western blot技術檢測p-AMPK（Thr172）/AMPKα1表達水平。結果 與同期對照組比較，建模2周實驗組拔牙側(cè)深染型肌纖維比例增多，非拔牙側(cè)中染型纖維比例增加，淺染型肌纖維比例減少（P<0.05）；建模4、6、8周組雙側(cè)深染型肌纖維比例持續(xù)增加，拔牙側(cè)顯著高于非拔牙側(cè)；第6、8周組雙側(cè)中染型肌纖維比例下降（P<0.05）；拔牙側(cè)淺染肌纖維比例在8周組減少，非拔牙側(cè)無明顯改變（P>0.05）。p-AMPK（Thr172）/AMPKα1表達水平在2、4周拔牙側(cè)較對照組和非拔牙側(cè)增高（P<0.05），在非拔牙側(cè)各周組無顯著改變（P>0.05）。結論 偏側(cè)咀嚼可促進雙側(cè)咬肌肌纖維有氧代謝能力且伴隨表型特征的改變，在非工作側(cè)更明顯；肌纖維有氧代謝能力增強與AMPK通路的激活有關。

輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶； 腺苷酸活化蛋白激酶； 氧化代謝； 偏側(cè)咀嚼

偏側(cè)咀嚼是顳下頜關節(jié)紊亂?。╰emporomandibular disorder，TMD）的致病因素之一[1]，也是臨床上常見的咬合紊亂[2]。有研究[3-4]已指出偏側(cè)咀嚼可以導致雙側(cè)咀嚼肌結構和肌電發(fā)生改變。而此不良咀嚼習慣是否會通過激活細胞通路導致咀嚼肌肌纖維耐疲勞性改變尚不明確。輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶（nicotine adenine dinucleotide tetrazolium reductase，NADH-TRase）是線粒體呼吸鏈中的遞氫體之一，是肌纖維有氧代謝能力和肌抗疲勞性的重要指標。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是細胞內(nèi)重要能量感受器，調(diào)控肌纖維能量代謝和肌纖維表型。

本實驗通過建立偏側(cè)咀嚼大鼠模型，了解偏側(cè)咀嚼對雙側(cè)咬肌肌纖維耐疲勞性的影響和AMPK信號通路在咬肌肌纖維改建中的作用，探討偏側(cè)咀嚼導致的咀嚼肌功能紊亂致病機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物選擇和分組

選取由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供的8周齡SD雄性大鼠40只，體重200~250 g，許可證號：SCXK（粵）2011-0015。所有大鼠口內(nèi)檢查上下牙列完整，咬合關系基本正常。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型 將40只SD雄性大鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組，分別于建模2、4、6和8周后進行樣品采集，每組又分為實驗組和對照組，各5只。實驗組大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉（0.004 m L·g-1）腹腔注射麻醉后，呈仰臥位固定于手術板上，以探針分離右上頜磨牙牙齦，止血鉗拔除右側(cè)上頜所有磨牙。對照組大鼠不拔牙，其余操作同實驗組。

1.2.2 樣本制取 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于工作臺，心尖灌注生理鹽水完全置換血液，雙側(cè)咬肌部位備皮，分離、暴露并取出咬肌組織，取雙側(cè)咬肌前部約0.5 cm×0.5 cm×1 cm大小的組織塊依次放入4 ℃預冷的20%蔗糖PB緩沖液和30%蔗糖PB緩沖液中至組織沉底以梯度脫水。另取40 mg放入裂解液中（含苯甲基磺酰氟和蛋白磷酸酶抑制劑）在勻漿器中勻漿3 min，后靜置冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心10 m in，吸取上清液。

1.2.3 咬肌切片和染色 取組織塊稍修整，使肌纖維方向垂直于底座，OCT包埋劑包埋，于-22 ℃恒冷箱切片機中進行冰凍切片，片厚16 μm，室溫晾干，進行NADH-TRase染色。在Leica正立電動顯微鏡下觀察肌纖維的染色情況。在200倍光鏡下觀察，每張組織切片隨機選10個視野，采用Image-ProPlus 6.0全自動圖像分析系統(tǒng)對各型肌纖維進行計數(shù)，并計算各種類型纖維占肌纖維總數(shù)的百分率。

1.2.4 Western blot檢測 上清液進行考馬斯亮藍液蛋白濃度定量后加入6×十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液，沸水加熱5 m in。上樣，SDS-PAGE電泳，至溴酚藍到達分離膠底部停止電泳。切取相應部位的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，由下至上按海綿墊、3層濾紙、凝膠、NC膜、3層濾紙、海綿墊放好（NC膜提前5 m in完全浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中）。夾緊轉(zhuǎn)膜的夾子，按正負極放入轉(zhuǎn)膜盒中，并置入冰盒，調(diào)節(jié)電流350 mA轉(zhuǎn)膜60 min后停止。NC膜在TBST中清洗3遍后置入5%BSA封閉液中室溫下封閉60 m in，用TBST洗3次（每次5 m in），加入抗AMPKα1（武漢博士德生物工程有限公司）、抗p-AMPK（Thr172）單克隆抗體（1︰500稀釋），4 ℃孵育過夜，棄一抗，在搖床上用TBST洗3次（每次10 m in），加入羊抗兔、羊抗小鼠（杭州聯(lián)科生物技術有限公司）二抗工作液（1︰5 000稀釋），室溫下?lián)u床孵育60 m in，用TBST洗4次（每次8 m in）。加入超敏化學發(fā)光液（enhanced chem ilum inescence，ECL）顯影，記錄結果。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，各實驗組和同期對照組均數(shù)用t檢驗，各周實驗組組間用SNK檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 咬肌肌纖維NADH-TRase染色結果

NADH-TRase染色后肌纖維呈藍色或紫藍色，根據(jù)著色程度可以分為深染、中染及淺染肌纖維。正常大鼠咬肌淺部及中部主要分布有淺染和中染肌纖維，分別約占33%、46%。深部散在分布深染肌纖維，約占21%。各組大鼠咬肌各型肌纖維NADHTRase染色結果見表1和圖1。

表 1 各組大鼠咬肌各型肌纖維NADH-TRase染色的構成比Tab 1 Masseter muscle fiber composition in the rats revealed by NADH-TRase staining in each group %,?±s

圖 1 偏側(cè)咀嚼大鼠咬肌肌纖維型 NADH-TRase染色 × 200Fig 1 Masseter muscle fiber type of unilateral chew ing rats NADH-TRase staining × 200

各周實驗組拔牙側(cè)深染肌纖維含量較對照組和實驗組非拔牙側(cè)高（P<0.05），并有逐漸上升趨勢。在建模4、8周，實驗組非拔牙側(cè)深染肌纖維含量較對照組均有所增高（P<0.05）。2周時實驗組非拔牙側(cè)中染肌纖維比例較對照組增高，其余各周實驗組大鼠雙側(cè)咬肌均較對照組減少（P<0.05）。各周實驗組拔牙側(cè)淺染肌纖維比例逐漸下降，于8周組達最低。在非拔牙側(cè)，建模后的淺染肌纖維含量先下降后回升，建模6、8周淺染肌纖維含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 咬肌p-AMPK（Thr172）/AMPKα1蛋白表達水平的變化

根據(jù)灰度值分析，實驗組拔牙側(cè)咬肌p-AMPK（Thr172）/AMPKα1的表達在建模初期2、4周的表達與對照組相比顯著增高（P<0.05），而建模后期6、8周組則逐漸減少，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。而實驗組非拔牙側(cè)p-AMPK（Thr172）/ AMPKα1的表達則在4、6、8周高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖2、表2）。

圖 2 Western blot檢測AMPKα1、p-AMPK（Thr172）蛋白表達情況Fig 2 Protein expression of AMPKα1 and p-AMPK(Thr172) by Western blot

表 2 各周偏側(cè)咀嚼大鼠咬肌p-AM PK（Thr172）/AMPKα1的相對表達量Tab 2 Relative expression of p-AMPK(Thr172)/AM PKα1 in m asseter m uscle fiber of unilateral chew ing rats in each group

3 討論

3.1 偏側(cè)咀嚼導致有氧代謝能力的變化

研究發(fā)現(xiàn)長期偏側(cè)咀嚼可以導致工作側(cè)咀嚼肌疼痛[5]、頭痛[6]，肌電檢測雙側(cè)咬肌肌電圖表現(xiàn)不一致[7]。在青少年時期偏側(cè)咀嚼還可影響面部發(fā)育，導致臉部發(fā)育不對稱[8]。另外工作側(cè)的髁突受到的壓力更大，偏側(cè)咀嚼的工作側(cè)關節(jié)負擔大[9]?？陬M系統(tǒng)正常功能的行使有賴于肌肉、關節(jié)、咬合的協(xié)調(diào)，而肌肉作為動力來源，在出現(xiàn)咬合干擾后理論上應較髁突、關節(jié)盤先出現(xiàn)改建。

咀嚼肌機械收縮能力又受到肌纖維代謝方式的影響，有氧代謝能力越強肌纖維的抗疲勞性越好。NADH-TRase作為線粒體呼吸鏈中的脫氫酶，對細胞有氧代謝能力起重要指示作用[10]。肌纖維染色越深，有氧代謝能力和耐力越強，抗疲勞性越好。本實驗結果發(fā)現(xiàn)建模2周組，非拔牙側(cè)中染肌纖維和拔牙側(cè)深染肌纖維出現(xiàn)明顯增加，說明咬合干擾對肌纖維有氧代謝能力的調(diào)整在早期即可出現(xiàn)。為了適應增加的咬合負擔，功能側(cè)咬肌通過增加混合供能的肌纖維，既增加了肌收縮力又增強了耐力。隨著建模時間的延長，第4、6、8周雙側(cè)深染肌纖維逐漸增高，并且拔牙側(cè)顯著高于非拔牙側(cè)，說明長期偏側(cè)咀嚼導致雙側(cè)咬肌氧化代謝能力增加，肌抗疲勞性增加。Douglas等[11]指出咬合干擾是一種運動單位病理性改變。當只有一側(cè)磨牙進行咀嚼，為適應增加的咀嚼負擔，咀嚼肌通過上調(diào)雙側(cè)咬肌有氧代謝為主的肌纖維，增加抗疲勞性，進而增加咀嚼循環(huán)進食，這與Honma等[12]的研究結果相符。但是非拔牙側(cè)的增加幅度小于拔牙側(cè)。胡敏等[13]研究也發(fā)現(xiàn)一側(cè)后牙缺失的小型豬雙側(cè)咬?、裥图±w維增多，其中以拔牙側(cè)增加更明顯，與本實驗研究結果一致。

本研究在建模8周，拔牙側(cè)淺染肌纖維開始出現(xiàn)減少，說明在拔牙側(cè)由于 干擾持續(xù)存在，糖酵解供能為主的肌纖維也將向有氧代謝供能類型肌纖維轉(zhuǎn)化，Scribbans等[14]研究也指出長期耐力運動可導致各型肌纖維有氧代謝能力增高。而非拔牙側(cè)淺染肌纖維逐漸恢復，這與口腔內(nèi)的感受器反饋調(diào)節(jié)有關。在建模開始時為了適應新的咬合關系，咬肌通過增加中染肌纖維比例，以更高效率粉碎食物，但是由于功能側(cè)有咬合接觸，通過牙周膜、肌梭感受器的調(diào)節(jié)，肌纖維代謝能力和肌力恢復正常咬合狀態(tài)，因而各型肌纖維有逐漸恢復原比例的趨勢。

3.2 AMPK磷酸化與肌纖維表型關系

肌纖維的表型和代謝能力受到細胞因子的調(diào)控。AMPK是近年來備受關注的細胞內(nèi)敏感能量感受器。當胞內(nèi)能量大量消耗導致一磷酸腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）︰三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）︰ATP的比例增高和胞內(nèi)Ca2+增高時可刺激AMPK磷酸化，并通過激活下游調(diào)控因子氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（peroxisome proliferater activated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α），促進線粒體生成、慢肌的轉(zhuǎn)錄[15]。同時還有促進胞內(nèi)葡萄糖攝取、抑制蛋白合成，調(diào)控離子通道的作用[15-16]。

王曉慧等[17]研究發(fā)現(xiàn)拔牙側(cè)AM PK下游分子PGC-1α的mRNA表達量在偏側(cè)咀嚼建模2、4、8周組明顯高于非拔牙側(cè)及對照組。本研究顯示拔牙側(cè)AMPK磷酸化程度在2、4周組分別是正常對照組的1.5、1.3倍，與先前研究結果相符，提示非工作側(cè)由于拔牙后喪失咬合接觸，在新的咀嚼模式下，下頜活動度在咬合干擾初期增大，導致肌纖維內(nèi)能量大量消耗，當引起AMP︰ATP比例下降后激活更多的AMPKα1磷酸化，進而促進慢肌的轉(zhuǎn)化、線粒體的合成，因而AMPK磷酸化程度在拔牙側(cè)與深染肌纖維的增加有一致性。但也有不一致的地方，拔牙側(cè)深染肌纖維逐漸增加而AMPK磷酸化程度在6、8周組咬肌并沒明顯增加，這可能是由于建模早期肌纖維內(nèi)線粒體增加，有氧代謝能力改善，在建模后期胞內(nèi)能量補充及時，所以未導致AMP︰ATP的改變。另外和其他通路的調(diào)節(jié)也有關。王子嫻等[18]研究也發(fā)現(xiàn)偏側(cè)咀嚼大鼠咬肌CaN在咬肌肌纖維內(nèi)的變化和Ⅰ型肌纖維的增加有關。在非拔牙側(cè)AMPK磷酸化在各周均無明顯增高，分析其原因可能有兩點：1）由于非拔牙側(cè)保持原有咬合接觸，咀嚼肌運動幅度并未明顯增加，肌纖維內(nèi)能量消耗并沒有明顯增多，AMP︰ATP比例未改變；2）本實驗樣本量不足，未得出統(tǒng)計學意義。因而非拔牙側(cè)深染型肌纖維比例雖較對照組增大，但增加幅度較拔牙側(cè)小。

綜上所述，本研究通過建立大鼠模型證明偏側(cè)咀嚼對雙側(cè)咬肌有氧代謝和抗疲勞性產(chǎn)生影響，導致雙側(cè)咬肌有氧代謝能力逐漸增強，并且雙側(cè)改變不一致，呈現(xiàn)時間依賴性，這種改變可能與AMPK磷酸化程度激活有關。

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（本文編輯 杜冰）

Alteration of metabolic characteristics on the masseter muscle fiber of unilateral chew ing rats and its adenosine mono-

phosphate activated protein kinase regulatory mechanism

Shi Andi1, Zeng Lin1, Liu Jing2. (1. College of Stomatology,

Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Dept. of Prosthodontics, College of Stomatology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Supported by: Talent Fund of Jinan University(51025036). Correspondence: Liu Jing, E-mail: lxxjing98@sina.com.

ObjectiveThis study aims to determ ine the influence of unilateral chew ing on metabolic characteristics of masseter muscle fibers in rats and the regulatory effect of an adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) signal pathway on metabolism.MethodsRats were subm itted to exodontia of all the right maxillary molars and divided into 2, 4, 6, and 8 weeks groups, and corresponding control groups were set as well. Sections were stained by nicotine adenine dinucleotide tetrazolim reductase(NADH-TRase) to demonstrate the types, proportion, and density of masseter muscle fibers. AMPKα1 and p-AMPK(Thr172) levels in bilateral masseter muscles were detected by Western blot.ResultsIn the 2-week group, the percentage of dark fibers augmented in the ipsilateral side, whereas the percentage of intermediary fibers in the contralateral side was increased accompanied by a decrease of light fibers, compared with the control group (P<0.05). The percentage of dark fibers was increased in the bilateral sides, whereas the percentage of dark fiber in the ipsilateral sides surpassed that of the contralateral sides in the 4, 6, and 8-week groups. The percentage of intermediary fibers was decreased in the bilateral sides in the 6 and 8-week groups (P<0.05). The percentage of light fibers was reduced in the ipsilateral sides in the 8-week group, whereas no alteration was observed in contralateral sides (P>0.05). In the ipsilateral sides, p-AMPK (Thr172)/AMPKα1 levels were increased in the 2 and 4-week groups (P<0.05), whereas no change was observed in the contralateral sides in either group (P>0.05).ConclusionUnilateral chew ing increases the oxidative metabolic ability in bilateral masseter muscle fibers especially in the non-working side accompanied with change of muscle fiber types. Theimprovement of aerobic metabolism ability is related to the AMPK signal pathway.

nicotine adenine dinucleotide tetrazolium reductase; adenosine monophosphate activated protein kinase; oxidative metabolism; unilateral chew ing

Q 257

A

10.7518/hxkq.2017.03.006

2016-06-22；

2017-03-10

暨南大學優(yōu)秀人才基金（51025036）

石安迪，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：505256764@qq.com

劉靜，教授，碩士，E-mail：lxxjing98@sina.com