徐高麗柳毅吳立立史秋濤霍光谷志遠(yuǎn)

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.浙江醫(yī)院口腔科，杭州 310053；3.荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)口腔種植和修復(fù)中心，阿姆斯特丹 1011-1109

柚皮苷協(xié)同骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖和分化的研究

徐高麗1,2柳毅1,3吳立立1史秋濤1霍光1谷志遠(yuǎn)1

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.浙江醫(yī)院口腔科，杭州 310053；3.荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)口腔種植和修復(fù)中心，阿姆斯特丹 1011-1109

目的 研究柚皮苷（NAR）聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2對(duì)體外培養(yǎng)的成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1增殖、堿性磷酸酶（ALP）活性及成骨相關(guān)基因ALP、骨鈣素（OCN）、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx2）、Ⅰ型膠原（ColⅠ）表達(dá)的影響。方法 以成骨細(xì)胞株MC3T3-E1為體外藥效的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過A lamar blue法檢測(cè)第1、4和7天3種不同濃度NAR（10、100和1 000 μmol·L-1）單獨(dú)作用以及分別與50 ng·m L-1BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響。同時(shí)在第4天和7天測(cè)定成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ的表達(dá)。結(jié)果 單純NAR刺激及聯(lián)合BMP-2刺激能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，在NAR濃度為100 μmol·L-1時(shí)達(dá)到高峰（P<0.05），且該濃度NAR與BMP-2聯(lián)合作用時(shí)增殖效果大于兩者單獨(dú)作用（P<0.05）。單純NAR刺激及聯(lián)合BMP-2刺激4 d和7 d時(shí)均能促進(jìn)細(xì)胞ALP活性，100 μmol·L-1NAR與BMP-2聯(lián)合作用時(shí)ALP活性最強(qiáng)（P<0.05）。100~1 000 μmol·L-1的NAR單獨(dú)及聯(lián)合作用在不同程度上能促進(jìn)ALP、OCN、Runx2、ColⅠ成骨相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)論 NAR能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞株MC3T3-E1增殖、分化，且適宜濃度的NAR和BMP-2有協(xié)同和促進(jìn)作用。

成骨細(xì)胞； 柚皮苷； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2； 增殖； 分化

足量骨組織是獲得頜面部美學(xué)和肌肉骨骼功能的前提條件，腭裂及牙槽嵴裂等是口腔頜面高發(fā)疾病，現(xiàn)今臨床上的修復(fù)方式主要是自體骨移植，但其有一定的局限性，往往會(huì)引起植骨供區(qū)并發(fā)癥[1]。修復(fù)骨缺損在口腔種植、頜面外科等領(lǐng)域仍然是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，且隨著口腔種植學(xué)的快速發(fā)展，牙槽骨再生和改建已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。生長(zhǎng)因子是促進(jìn)組織再生的條件之一，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一種多功能生長(zhǎng)因子，BMP-2是誘導(dǎo)成骨細(xì)胞成骨最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一[2]，參與骨形成和重建[3]，主要通過調(diào)控成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（osteocalin，OCN）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原酶（collagen Ⅰ，ColⅠ）等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，參與成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收[4-6]。且大量研究[7]表明，用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP）-2進(jìn)行骨缺損移植與自體骨無明顯差異。然而BMP-2的臨床有效使用劑量非常高[8-9]，這不僅加大了患者的治療成本，同時(shí)也帶來高劑量副作用的可能性，因此其臨床應(yīng)用也較為局限。中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的精髓，且在治療骨缺損方面具有悠久的歷史考證。柚皮苷（naringin，NAR）是骨碎補(bǔ)中含量最為豐富的黃酮類物質(zhì)，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、治療骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折愈合等功效[10]。目前研究顯示NAR對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用[11]，也可通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）、蘇氨酸激酶（threonine kinases，Akt）、c-Fos/c-Jun和激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）旁路誘導(dǎo)BMP-2的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟[12]。且其來源廣泛，藥效作用和化學(xué)結(jié)構(gòu)基本明確，符合現(xiàn)代中藥的發(fā)展趨勢(shì)，有較好的臨床運(yùn)用前景。

本實(shí)驗(yàn)采用成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同濃度NAR及與BMP-2聯(lián)合作用時(shí)對(duì)成骨細(xì)胞增殖、ALP活性以及成骨相關(guān)基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ表達(dá)的影響，為NAR和BMP-2在臨床牙槽骨缺損的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1（上海中科院細(xì)胞庫(kù)）；中藥NAR單體（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)基α-MEM和胎牛血清（GibcoTMInvitrogen公司，美國(guó)）；rhBMPs（R&D Systems Inc，美國(guó)）；細(xì)胞裂解液（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)）；ALP檢測(cè)試劑盒（W ako Pure Chem icals公司，日本）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；總RNA抽提試劑盒（Giagen GmbH公司，德國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組 實(shí)驗(yàn)共分8組：1）對(duì)照組（A組）；2）50 ng·m L-1BMP-2（B組）；3）10 μmol·L-1NAR（C組）；4）10 μmol·L-1NAR+50 ng·m L-1BMP-2（D組）；5）100 μmol·L-1NAR（E組）；6）100 μmol·L-1NAR+50 ng·m L-1BMP-2（F組）；7）1 000 μmol·L-1NAR（G組）；8）1 000 μmol·L-1NAR+50 ng·m L-1BMP-2（H組），每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的α-MEM培養(yǎng)基中，每3 d更換培養(yǎng)基。處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種24 h后予以1%FBS-α-MEM饑餓培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞狀態(tài)基本一致，然后分別在各培養(yǎng)孔中加入不同濃度的NAR單體和rhBMPs進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，每3 d更新培養(yǎng)基以及細(xì)胞因子，用于細(xì)胞增殖、ALP活性及成骨相關(guān)基因檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用Alamar blue方法檢測(cè)不同濃度NAR單體和rhBMP-2對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種于24孔板，收取各組經(jīng)刺激培養(yǎng)1、4和7 d后的細(xì)胞裂解液，根據(jù)Quant-iTTMPicoGreen dsDNA Reagent and kits試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，Ex480 nm/Em520 nm讀取熒光密度，測(cè)得各組細(xì)胞DNA含量，用來反映細(xì)胞增殖數(shù)量。

1.2.4 ALP活性檢測(cè) 細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板，收取各組經(jīng)刺激培養(yǎng)4 d和7 d后的細(xì)胞裂解液，采用LabAssayTMALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的ALP活性，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度。各組細(xì)胞裂解液的ALP活性值均用相應(yīng)的細(xì)胞總蛋白濃度予以校準(zhǔn)，求得各組相對(duì)ALP活性值。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá) 細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板，各組經(jīng)刺激培養(yǎng)4 d和7 d后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，采用RNeasy M ini Kit和RNase-Free DNase Set試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，檢測(cè)基因濃度及完整性，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成相應(yīng)cDNA，以β-actin為管家基因。配制real-time PCR 20 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)（反應(yīng)參數(shù)均根據(jù)試劑盒使用說明），反應(yīng)完成后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析?；虮磉_(dá)量以檢測(cè)基因的初始模板量表示（2-ΔΔCt）。全部引物序列由上海皓嘉科技發(fā)展有限公司合成，引物序列見表1。

表 1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，行單因素方差分析，以LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖效應(yīng)

A lamar blue法結(jié)果表明：?jiǎn)渭僋AR刺激1 d和4 d時(shí)均能促進(jìn)細(xì)胞增殖（P<0.05），表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，NAR濃度為100 μmol·L-1時(shí)達(dá)到高峰。然而在培養(yǎng)7 d后，10~100 μmol·L-1的NAR均能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖（P<0.05），而1 000 μmol·L-1的NAR對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。不同濃度NAR與BMP-2聯(lián)合作用時(shí)較NAR單獨(dú)作用更能促進(jìn)細(xì)胞增殖，100 μmol·L-1的NAR與BMP-2聯(lián)合作用時(shí)增殖效果最明顯（P<0.05）（圖1）。

2.2 細(xì)胞ALP活性檢測(cè)結(jié)果

ALP活性是評(píng)價(jià)細(xì)胞成骨分化的早期指標(biāo)。ALP活性檢測(cè)中，NAR單獨(dú)及聯(lián)合BMP-2作用時(shí)，ALP活性的表達(dá)隨著NAR濃度呈先上升后下降趨勢(shì)，在NAR濃度為100 μmol·L-1時(shí)達(dá)到了峰值(P<0.05)。100 μmol·L-1的NAR與BMP-2聯(lián)合作用時(shí)ALP活性上調(diào)最明顯，顯著高于其他組（圖2）。

圖 1 NAR單獨(dú)及聯(lián)合BMP-2刺激成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1后細(xì)胞DNA含量Fig 1 DNA content of pre-osteoblasts (MC3T3-E1 cells) after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

圖 2 NAR單獨(dú)及聯(lián)合BMP-2刺激成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1后細(xì)胞ALP活性情況Fig 2 The ALP activity of pre-osteoblasts (MC3T3-E1 cells) after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

2.3 成骨相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果

根據(jù)上述ALP活性檢測(cè)結(jié)果，NAR單體在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴效應(yīng)曲線，故后期用于基因表達(dá)水平比較研究的NAR濃度范圍為10~1 000 μmol·L-1。

從熒光定量PCR顯示的結(jié)果可見：NAR在100~ 1 000 μmol·L-1時(shí)能促進(jìn)Runx2表達(dá)，100 μmol·L-1濃度的NAR與BMP-2有協(xié)同促進(jìn)作用，尤其是4 d時(shí)聯(lián)合使用的效果遠(yuǎn)大于兩者單獨(dú)使用（P<0.05）。在10~ 1 000 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，NAR上調(diào)細(xì)胞ALP基因表達(dá)的濃度效應(yīng)關(guān)系呈現(xiàn)直線型，4 d時(shí)1 000 μmol·L-1對(duì)ALP基因的表達(dá)效果最明顯（P<0.05）。單純NAR刺激及NAR聯(lián)合BMP-2刺激4 d和7 d時(shí)均能促進(jìn)細(xì)胞ColⅠ mRNA的表達(dá)。4 d時(shí)10 μmol·L-1的NAR聯(lián)合BMP-2能明顯促進(jìn)ColⅠ mRNA的表達(dá)（P<0.05），7 d時(shí)100 μmol·L-1的NAR單獨(dú)使用及與BMP-2聯(lián)合均有顯著促進(jìn)作用（P<0.05）。單純NAR刺激及NAR聯(lián)合BMP-2刺激4 d和7 d均能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞OCN mRNA的表達(dá)，呈濃度依賴型。隨著濃度的增大，優(yōu)勢(shì)更明顯，尤其在第7天時(shí)，100~1 000 μmol·L-1的NAR單獨(dú)刺激與聯(lián)合BMP-2均有顯著作用（P<0.05）（圖3）。

圖 3 NAR單獨(dú)及聯(lián)合BMP-2刺激成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1后成骨相關(guān)基因表達(dá)情況Fig 3 The relative expression of osteogenic genes after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

3 討論

隨著口腔種植修復(fù)技術(shù)的快速發(fā)展，種植也成為了更多臨床醫(yī)生及患者修復(fù)牙列缺損及缺失的選擇，然而骨缺損、骨質(zhì)疏松等嚴(yán)重影響種植體的骨結(jié)合及初期穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致修復(fù)失敗。臨床上采用了不同的骨增量方法和植骨材料，促進(jìn)種植體周圍缺損區(qū)的骨形成。骨碎補(bǔ)是治療骨相關(guān)性疾病常用的中藥，NAR是其主要活性成分，普遍存在于柑橘類水果和許多中藥中。Wong等[13]通過向兔顱骨缺損區(qū)域移植不同材料，發(fā)現(xiàn)NAR聯(lián)合膠原基質(zhì)能有效地促進(jìn)新骨組織生成，且成骨作用優(yōu)于自體骨移植，從而說明NAR可被作為骨移植材料使用。NAR可以明顯地提高骨鈣素、骨橋蛋白和BMP-2的分泌量，促進(jìn)與成骨相關(guān)因子：堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast grow th factor，bFGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like grow th factor-1，IGF-1）、Runx2、成骨細(xì)胞特異基因（Osterix）和雌激素受體（estrogen receptor，ER）α及ERβ mRNA的表達(dá)，同時(shí)也可以增強(qiáng)ERα、ERβ和ColⅠ的分泌，通過雌激素信號(hào)通路來發(fā)揮其成骨作用[14]。另一方面NAR可以通過抑制核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL）誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulatedkinas，ERK）的活性來阻止破骨細(xì)胞的形成以減少骨吸收的發(fā)生[15]。NAR可以通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞之間的平衡來調(diào)節(jié)骨代謝，促進(jìn)骨形成，從而修復(fù)骨缺損。

BMP-2通路是最主要的成骨信號(hào)通路之一，可通過上調(diào)Msx2基因刺激Wnt信號(hào)通路促進(jìn)骨祖細(xì)胞成骨性分化，還可激活誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smads調(diào)控基因和Osterix基因，并調(diào)節(jié)ALP、ColⅠ、OCN、骨橋蛋白（osteoprontin，OPN）等多種細(xì)胞因子的表達(dá)促進(jìn)成骨[16]。然而BMP-2的臨床有效使用劑量非常高，達(dá)到毫克級(jí)別[8]，這對(duì)患者來說是個(gè)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且大劑量使用BMP會(huì)有一定的不良反應(yīng)，如刺激破骨細(xì)胞活性、異位骨生成。因此其臨床應(yīng)用較為局限。

MC3T3-E1細(xì)胞株具有體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的各種生物學(xué)特性，是良好的體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞株，已經(jīng)成為了研究藥物對(duì)成骨細(xì)胞影響的有價(jià)值的體外細(xì)胞模型[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第1天和第4天時(shí)，10~1 000 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，NAR單獨(dú)作用和NAR與BMP-2聯(lián)合作用均能夠顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，且在100 μmol·L-1時(shí)達(dá)到峰值，可見NAR對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用有一定的濃度依賴性。然而在第7天時(shí)，1 000 μmol·L-1的NAR對(duì)細(xì)胞的增殖有抑制作用，可能提示在第7天時(shí)高濃度的NAR以促進(jìn)細(xì)胞分化為主。

ALP的活性是衡量成骨細(xì)胞早期分化的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中在第4、7天中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)ALP活性增強(qiáng)，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。ALP、OCN、Runx2、COlⅠ均是成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)。Runx2是骨形成最早的標(biāo)志基因，是成骨細(xì)胞開始分化的標(biāo)志，能夠激活骨鈣蛋白、骨橋素、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和COlⅠ基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[18]。ColⅠ則由成熟成骨細(xì)胞分泌[19]。實(shí)驗(yàn)中Runx2與COlⅠ表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)提示Runx2與COlⅠ為2個(gè)相關(guān)聯(lián)指標(biāo)，存在級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這也跟文獻(xiàn)研究[20]一致。ALP是成骨細(xì)胞早期分化標(biāo)志。OCN是由分化期成骨細(xì)胞分泌的蛋白，可反映成骨細(xì)胞的活躍程度[21]，是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志[22]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)總體上而言隨著藥物濃度升高，刺激細(xì)胞分化的能力也相應(yīng)增加。然而NAR和BMP-2在促進(jìn)ALP、Runx2、ColⅠ、OCN均表現(xiàn)出不同作用，提示適宜濃度的NAR單獨(dú)及聯(lián)合BMP-2能夠從早期到晚期提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞分化。并且在實(shí)驗(yàn)中，100 μmol·L-1的NAR聯(lián)合BMP-2聯(lián)合刺激成骨細(xì)胞，增殖活性，ALP活性以及分化能力明顯高于單純100 μmol·L-1的NAR刺激和單純的BMP-2刺激，提示該濃度的NAR與BMP-2對(duì)成骨細(xì)胞具有協(xié)同作用，可能兩者共同促進(jìn)激活某一信號(hào)通路有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)初步研究了NAR與BMP-2的聯(lián)合誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)適宜濃度的NAR與BMP-2具有協(xié)同作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟。中藥NAR來源廣泛，不良反應(yīng)小，而BMP-2被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨因子之一。兩者的聯(lián)合誘導(dǎo)作用，不但能有效促進(jìn)骨形成，而且也大大降低了臨床治療骨缺損的成本，縮短了治療的時(shí)間，擴(kuò)大治療骨缺損的適應(yīng)證，為臨床治療骨缺損提供新的思路和研究方向。

[1] Rawashdeh MA, Telfah H. Secondary alveolar bone grafting: the dilemma of donor site selection and morbidity[J]. Br J Oral Maxillofac Surg, 2008, 46(8):665-670.

[2] Liu Y, Wu G, de Groot K. Biomimetic coatings for bone tissue engineering of critical-sized defects[J]. J R Soc Interface, 2010, 7(Suppl 5):S631-S647.

[3] Park KH, Kang JW, Lee EM, et al. Melatonin promotes osteoblastic differentiation through the BMP/ERK/Wnt signaling pathways[J]. J Pineal Res, 2011, 51(2):187-194.

[4] Phimphilai M, Zhao Z, Boules H, et al. BMP signaling is required for RUNX2-dependent induction of the osteoblast phenotype[J]. J Bone M iner Res, 2006, 21(4):637-646.

[5] Yoon HJ, Seo CR, Kim M, et al. Dichloromethane extracts of Sophora japonica L. stimulate osteoblast differentiation in mesenchymal stem cells[J]. Nutr Res, 2013, 33(12):1053-1062.

[6] Zhang R, Oyajobi BO, Harris SE, et al. Wnt/β-catenin signaling activates bone morphogenetic protein 2 expression in osteoblasts[J]. Bone, 2013, 52(1):145-156.

[7] Fiorellini JP, Howell TH, Cochran D, et al. Randomized study evaluating recombinant human bone morphogenetic protein-2 for extraction socket augmentation[J]. J Periodontol, 2005, 76(4):605-613.

[8] M cKay WF, Peckham SM, Badura JM. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE? Bone Graft)[J]. Int Orthop, 2007, 31 (6):729-734.

[9] Groeneveld EH, Burger EH. Bone morphogenetic proteins in human bone regeneration[J]. Eur J Endocrinol, 2000, 142 (1):9-21.

[10] Pang WY, Wang XL, Mok SK, et al. Naringin improves bone properties in ovariectom ized m ice and exerts oestrogen-likeactivities in rat osteoblast-like (UMR-106) cells[J]. Br J Pharmacol, 2010, 159(8):1693-1703.

[11] Xu Z, Li N, Wooley PH, et al. Naringin promotes osteoblast differentiation and effectively reverses ovariectomy-associated osteoporosis[J]. J Orthop Sci, 2013, 18(3):478-485.

[12] Zhou X, Zhang P, Zhang C, et al. Promotion of bone formation by naringin in a titanium particle-induced diabetic murine calvarial osteolysis model[J]. J Orthop Res, 2010, 28(4):451-456.

[13] Wong RW, Rabie AB. Effect of naringin collagen graft on bone formation[J]. Biomaterials, 2006, 27(9):1824-1831.

[14] 翟遠(yuǎn)坤, 牛銀波, 潘亞磊, 等. 柚皮苷對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖和分化成熟的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(1):105-111. Zhai YK, Niu YB, Pan YL, et al. Effects of naringin on proliferation, differentiation and maturation of rat calvarial osteoblasts in vitro[J]. China J Chin Materia Medica, 2013, 38(1):105-111.

[15] Ang ES, Yang X, Chen H, et al. Naringin abrogates osteoclastogenesis and bone resorption via the inhibition of RANKL-induced NF-κB and ERK activation[J]. FEBS Lett, 2011, 585(17):2755-2762.

[16] Sun P, Wang J, Zheng Y, et al. BMP2/7 heterodimer is a stronger inducer of bone regeneration in peri-implant bone defects model than BMP2 or BMP7 homodimer[J]. Dent Mater J, 2012, 31(2):239-248.

[17] Owen TA, Aronow M, Shalhoub V, et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix[J]. J Cell Physiol, 1990, 143(3):420-430. [18] Pan K, Yan S, Ge S, et al. Effects of core binding factor alpha1 or bone morphogenic protein-2 overexpression on osteoblast/cementoblast-related gene expressions in NIH3T3 mouse cells and dental follicle cells[J]. Cell Prolif, 2009, 42(3):364-372.

[19] Hosoi T. Bone and bone related biochem ical exam inations. Bone and collagen related metabolites. Structure and metabolisms of collagen[J]. Clin Calcium, 2006, 16(6):971-976.

[20] Zhang X, Aubin JE, Inman RD. Molecular and cellular biology of new bone formation: insights into the ankylosis of ankylosing spondylitis[J]. Curr Opin Rheumatol, 2003, 15 (4):387-393.

[21] Lin L, Chen L, Wang H, et al. Adenovirus-mediated transfer of siRNA against Runx2/Cbfa1 inhibits the formation of heterotopic ossification in animal model[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 349(2):564-572.

[22] Ducy P, Desbois C, Boyce B, et al. Increased bone formation in osteocalcin-deficient m ice[J]. Nature, 1996, 382 (6590):448-452.

（本文編輯 杜冰）

ObjectiveThis study evaluates the biological effects of naringin (NAR) joint bone morphogenetic protein (BMP)-2 on the proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, and expression of osteoblastogenic genes, such as Runtrelated transcription factor 2 (Runx2), collagen Ⅰ (ColⅠ), ALP, and osteocalcin (OCN) of pre-osteoblasts.MethodsThree different NAR concentrations (10, 100, and 1 000 μmol·L-1) were applied, alone or combined with BMP-2(50 ng·m L-1), to restore the osteoblastogenesis of pre-osteoblasts (MC3T3-E1 cell line). Cell numbers (proliferation) were evaluated at first, fourth, and seventh days by Alamar blue assay. ALP activity and the expression of osteoblastogenic genes, such as Runx2, ColⅠ, ALP, and OCN were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) at fourth and seventh day.ResultsStimulation by NAR alone and in combination with BMP-2 for 1 day and 4 days could promote cell proliferation, which peaked at a concentration of 100 μmol·L-1NAR combined with BMP-2 could promote cell proliferation significantly (P<0.05). Stimulation by NAR alone and in combination with BMP-2 for 4 and 7 days could promote ALP activity and bone-related gene(ALP, OCN, Runx2, ColⅠ) expression. ALP expression was significantly promoted after stimulation of 100 μmol·L-1NAR and BMP-2 (P<0.05).ConclusionNAR exhibits prom ising potential for improving MC3T3-E1proliferation and differentiation, and appropriate concentrations of NAR and BMP-2 show synergistic effect.

osteoblast; naringin; bone morphogenetic protein-2; proliferation; differentiation

Q 26

A

10.7518/hxkq.2017.03.009

2016-03-04；

2017-03-10

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014ZB028）

徐高麗，碩士，E-mail：852819264@qq.com

霍光，講師，碩士，E-mail：495974415@qq.com

Effect of naringin combined with bone morphogenetic protein-2 on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1cells G

aoli1,2, Liu Yi1,3, Wu Lili1, Shi Qiutao1, Huo Guang1, Gu Zhiyuan1. (1. School of Stomatology, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2. Dept. of Stomatology, Zhejiang Hospital, Hangzhou 310053, China; 3. Dept. of Dental Implant and Prosthetics, University of Amsterdam, Amsterdam 1011-1109, Holland) Supported by: Zhejiang Medical Science and Technology Plan Project (2014ZB028) . Correspondence: Huo Guang, E-mail: 495974415@qq.com.