1.昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，昆明 650106；

2.口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學華西口腔醫(yī)院，成都 610041

滇重樓總皂苷對涎腺腺樣囊性癌ACC-83細胞增殖抑制及其機制的研究

何秋敏1許彪1王衛(wèi)紅1包崇云2胡少偉1

1.昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，昆明 650106；

2.口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學華西口腔醫(yī)院，成都 610041

目的 探討滇重樓總皂苷對涎腺腺樣囊性癌ACC-83細胞的增殖抑制作用及其相關機制，為滇重樓治療涎腺腺樣囊性癌提供理論依據(jù)。方法 通過體外細胞培養(yǎng)，采用CCK-8法檢測不同藥物質量濃度（5、10、20、40、60、80、100 μg·m L-1）的滇重樓總皂苷對ACC-83細胞的增殖抑制效應，采用流式細胞儀檢測不同藥物質量濃度（25、50、100 μg·m L-1）的滇重樓總皂苷對ACC-83細胞的凋亡率，Western blot及逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測巨噬細胞游走抑制因子（MIF）和CD74的表達。結果 滇重樓總皂苷可促進ACC-83細胞凋亡，并呈劑量-效應關系。ACC-83細胞中存在MIF和CD74的表達，滇重樓總皂苷可抑制MIF和CD74的表達。結論 滇重樓總皂苷對ACC-83細胞的生長有明顯抑制作用，可以抑制MIF及CD74的表達，誘導細胞凋亡，為其臨床應用提供了依據(jù)。

滇重樓總皂苷； 涎腺腺樣囊性癌； 巨噬細胞游走抑制因子

涎腺腺樣囊性癌是涎腺腫瘤中較為常見的惡性腫瘤，具有侵襲性強、遠處轉移率高、嗜神經等特性，臨床療效不佳。研究[1]發(fā)現(xiàn)，術后輔助化療可以有效提高腫瘤的局部控制率，因此尋找低毒高效的抗癌藥物具有重要意義。近年來，重樓皂苷因具有抗腫瘤和抗菌消炎等作用而備受關注[2]。大量研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，滇重樓總皂苷對乳腺癌、肺癌、結腸癌等均有明顯抑制作用且有增效減毒的作用，但是重樓皂苷對ACC的研究還較為少見。本研究以涎腺腺樣囊性癌細胞株ACC-83為研究對象，探討滇重樓總皂苷對ACC-83細胞的增殖抑制作用及相關機制，為臨床應用重樓治療涎腺腺樣囊性癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

ACC-83細胞株由北京大學口腔醫(yī)院分子生物實驗室李盛林課題組饋贈；重樓皂苷由中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室提供。RPM I-1640購自美國Thermo公司，胎牛血清購自美國Sciencecell公司，Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，Anti-巨噬細胞游走抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、Anti-CD74、兔抗人β-actin抗體購自美國Abcam公司，Eastep總RNA提取試劑盒購自上海普洛麥格生物產品有限公司，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自美國Promega公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的ACC-83細胞，接種于96孔板中培養(yǎng)，設置5個平行復孔，培養(yǎng)24 h后，將質量濃度梯度分別為5、10、20、40、60、80、100 μg·m L-1的藥物按照實驗設計給各實驗組加藥，分別設置陰性對照組（僅為完全培養(yǎng)基和ACC-83細胞）、調零組（僅為完全培養(yǎng)基），24 h后終止藥物作用，加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后上酶標儀檢測，波長450 nm下測定并記錄光密度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=[（陰性對照組OD值-實驗組OD值）/（陰性對照組OD值-調零組OD值）]×100%。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的ACC-83細胞，接種于6孔板中培養(yǎng)，參考IC50值設置藥物質量濃度梯度為低、中、高（分別為25、50、100 μg·m L-1）3組，設置陰性對照組（僅完全培養(yǎng)基和ACC-83細胞），24 h后終止藥物作用，收集細胞，離心3~5 min，去上清，加入約1 mL預冷的PBS，重懸細胞后離心沉淀，細胞共洗滌2次，去上清，250 μL Binding Buffer懸浮細胞，調節(jié)細胞密度為每毫升1×106個，取100 μL細胞懸液于5 m L流式管中，加入5 μL異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI，質量濃度為20 μg·m L-1）溶液，室溫避光孵育15 m in；上流式細胞儀分析檢測細胞凋亡率。

1.2.3 Western blot檢測MIF、CD74蛋白的表達 組織裂解液提取各實驗組藥物質量濃度梯度為低、中、高（分別為25、50、100 μg·m L-1）3組以及陰性對照組細胞中的總蛋白，運用超微量紫外分光光度計測定各組蛋白濃度，計算上樣量。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylam ide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠，上樣、電泳、切膠及轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，漂洗3次，按1∶1 000和1∶500的比例分別配置MIF和CD-74的一抗， 4 °C孵育并過夜；漂洗3次，按1∶6 000的比例配置二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次。以β-actin為內參。將A、B兩種發(fā)光底物試劑按照1∶1配置，凝膠成像儀顯影；Image J圖像分析系統(tǒng)分析目標條帶的灰度值。

1.2.4 逆轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RTPCR）檢測MIF、CD74 mRNA的表達 參照RNA提取試劑盒的說明書提取各實驗組藥物質量濃度梯度為低、中、高（分別為25、50、100 μg·m L-1）3組以及陰性對照組細胞中的總RNA，紫外分光光度計測定RNA溶液的濃度和純度，配置RT-M ix，反應體系為10 μL，設置逆轉錄程序，反應條件為：95 ℃30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s。MIF上游引物：5’- GTGGTGTCCGAGAAGTCAGG-3’，下游引物：5’- TTGCTGTAGGAGCGGTTCTG-3’；CD74上游引物：5’-GGCTACTGCTGGTGTGTCTT-3’，下游引物：5’-TCCAAGGGTGACGAAAGAGC-3’；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物：5’- ACCACAGTCCA- TGCCATCAC-3’，下游引物：5’- TCCACCACCCTG- TTGCTGTA-3’。程序完成后，得到cDNA。根據(jù)樣品和目的基因的數(shù)目，編排上樣表中的順序，配置PCR反應體系，所用為10 μm體系，PCR反應體系為：95 °C 5 m in；95 °C 30 s，60 °C 45 s，72 °C 30 s，共25個循環(huán)。采用RT-PCR儀進行檢測，數(shù)據(jù)根據(jù)表達量=2-ΔΔCt分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，方差齊者采用One-way ANOVA分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布或方差不齊者采用Kruskal-Wallis檢驗。檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率

CCK-8法檢測結果顯示，不同藥物質量濃度的滇重樓總皂苷對ACC-83細胞均有不同程度的生長抑制作用，并呈劑量-效應關系（具體數(shù)值見表1）。各組抑制率組間比較的差異有統(tǒng)計學意義（F=258.395，P<0.05），進一步行兩兩比較，各組的差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），可見在一定質量濃度范圍內細胞抑制率呈劑量-效應關系。經統(tǒng)計軟件計算，其IC50值為37.956 μg·m L-1。

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果見圖1，可見各實驗組細胞均發(fā)生不同程度的凋亡。藥物低、中、高質量濃度組的凋亡率分別為3.29%±1.18%、60.23%±4.26%和81.51%± 5.11%，陰性對照組為2.60%±0.57%。經統(tǒng)計學檢驗，陰性對照組與低質量濃度組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而與中、高質量濃度組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示中高質量濃度組具有明顯的促凋亡作用。

表 1 CCK-8檢測各組的細胞增殖抑制率Tab 1 CCK-8 detection of cell proliferation inhibition rate n=5

圖 1 流式細胞儀檢測各實驗組ACC-83細胞的凋亡Fig 1 The apoptosis of ACC-83 cell in each experimental group was detected by flow cytometry

2.3 Western blot檢測MIF、CD74蛋白的表達

MIF和CD74蛋白表達的Western blot結果見圖2。藥物低、中、高質量濃度組MIF蛋白灰度值分別為39 530.17±415.93、26 512.56±5 617.44和20 706.47± 1 358.78，陰性對照組的灰度值為39 065.78±2 747.97（圖3A）。經Kruskal-Wallis檢驗，與陰性對照組相比，高質量濃度組的MIF灰度值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.025），其余兩組與陰性對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各實驗組CD74蛋白的灰度值分別為34 078.22±943.24、30 021.12±754.27和11 154.92±385.02，陰性對照組為34 912.08±1 367.42（圖3B）。經統(tǒng)計學檢驗，陰性對照組與低質量濃度組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與其余兩組的差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。該結果提示，ACC-83細胞中有MIF、CD74蛋白的表達，中高質量濃度的滇重樓總皂苷可明顯抑制MIF、CD74蛋白的表達。

圖 2 Western blot檢測各組MIF和CD74蛋白表達Fig 2 The expression of MIF and CD74 protein in each group de- tected by Western blot

2.4 RT-PCR檢測MIF、CD74 mRNA的表達

藥物低、中、高質量濃度組MIF mRNA相對表達量分別為0.95±0.12、0.86±0.14和0.45±0.09（圖3C），與陰性對照組（設為1）相比，高質量濃度組中MIF mRNA相對表達量明顯降低（P=0.001）。各實驗組CD74 mRNA相對表達量分別為0.90±0.107、0.86±0.068和0.56±0.008（圖3D），與陰性對照組相比，高質量濃度組表達量明顯減少（P<0.05），其余各組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。該結果提示高質量濃度的滇重樓總皂苷可明顯抑制MIF和CD74 mRNA的表達。

圖 3 MIF和CD74蛋白和mRNA的相對表達量Fig 3 The relative expression of MIF protein, CD74 protein, MIF mRNA and CD74 mRNA

3 討論

近年來，隨著中藥重樓對腫瘤的發(fā)病機制及治療方法研究的深入，以中藥重樓為主或為輔的抗癌藥物已經得以應用。目前以重樓為主的抗癌藥物肝復樂已應用于臨床，作為原發(fā)性肝癌的輔助治療手段。重樓皂苷的抗腫瘤機制主要有誘導腫瘤細胞凋亡，阻遏癌細胞的發(fā)生和轉移，調節(jié)機體免疫，抑制腫瘤血管生成等，但其分子機制尚不明確。顏璐璐等[6]研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷有廣泛的抗腫瘤活性，對10多種腫瘤細胞株均有抑制作用。目前有關重樓皂苷對腺樣囊性癌的研究還較少。本研究表明，重樓皂苷可誘導ACC-83細胞發(fā)生凋亡，高質量濃度組的細胞凋亡率達81.51%±5.11%，且無明顯的細胞毒性作用；中低質量濃度組的促凋亡作用較弱，可能是因為藥物為總提取混合物，藥物有效活性成分及純度還有待進一步篩選。總體來看，滇重樓總皂苷對ACC-83細胞增殖具有有效的抑制作用，這為后續(xù)重樓活性成分及藥效學的綜合研究奠定了基礎。

MIF是由T細胞產生的多功能致炎細胞因子，可抑制單核/巨噬細胞移動，其來源廣泛，除正常組織及免疫細胞中有表達外，本實驗發(fā)現(xiàn)MIF在ACC-83細胞中也有高表達。異常表達的MIF所涉及的多種細胞信號通路通過多種方式參與免疫、炎癥、腫瘤等多種病理過程，已經成為炎癥和腫瘤等疾病的研究靶標。長期慢性炎癥可導致MIF的異常表達，有助于某些特定腫瘤的生長和侵襲，其主要機制包括以下兩點。1）下調p53，上調環(huán)氧化酶2和前列腺素E2，誘導血管生成，促進腫瘤的增殖及侵襲[7-8]。2）異常表達的MIF可激活促分裂原活化蛋白激酶（m itogen activated protein kinase，MAPK）家族成員和MIF特異性膜受體CD74發(fā)生磷酸化[9-10]，募集CD44形成CD74-CD44復合體，促進下游細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷脂酰肌醇-3激酶/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/AKT，PI3K/Akt）通路持續(xù)活化，促進腫瘤細胞增殖[11-12]。MIF通過多條經典信號通路的協(xié)調作用誘導炎癥因子、癌基因及抑癌基因的惡性轉化，間接調節(jié)機體免疫反應，促進細胞增殖和遷移，而MIF作為共同樞紐，成為抗炎抗腫瘤治療的最佳靶點[13]。

Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷可誘導肝癌HepG-2細胞通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導的線粒體功能障礙及MAPK通路發(fā)生細胞凋亡。He等[15]研究證實，重樓可下調人肺腺癌A549中基質金屬蛋白酶（matrix metaloproteinase，MMP）-2、MMP-9，抑制其黏附、遷徙及轉移。本實驗研究結果發(fā)現(xiàn)，MIF、CD74在ACC-83細胞中高表達，藥物作用于ACC-83細胞后，MIF、CD74蛋白和mRNA的表達量隨著藥物質量濃度的增加而降低，高質量濃度組MIF與陰性對照組相比有明顯差異，且與CD74的表達量呈正相關。Meyer-Siegler等[16]通過阻滯CD74來阻斷MIF的信號傳導通路，結果發(fā)現(xiàn)可抑制前列腺癌的增殖轉移和擴散。由此推測，重樓誘導的ACC-83細胞凋亡與MIF和CD74介導的信號通路相關，這為MIF-CD74作為治療靶點提供了理論依據(jù)[17]。

本研究結果表明，滇重樓總皂苷對涎腺腺樣囊性癌ACC-83細胞生長具有明顯的抑制作用，可以有效降低MIF及CD74的表達，促進ACC-83細胞凋亡，為滇重樓單體及MIF抑制劑的研究提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯 吳愛華）

Inhibitory effect and underlying mechanism of total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis on the proliferation of salivary adenoid cystic carcinoma ACC-83 cells

He Qiumin1, Xu Biao1, Wang Weihong1, Bao Chongyun2, Hu Shao-

wei1. (1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650106, China; 2. State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Supported by: State Key Laboratory of Oral Diseases Research Project (SKLOD2015OF10); The Research Project of Research Institute of Yunnan Medical and Health Units (2016NS115). Correspondence: Xu Biao, E-mail: xubiao1962@163.com.

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect and underlying mechanism of total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis on the proliferation of salivary adenoid cystic carcinoma ACC-83 cells.MethodsIn vitro cell culture was performed. The proliferation of ACC-83 cells treated with different concentrations (5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg·mL–1) of total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis was observed using CCK-8 assay. Meanwhile, the apoptosis of ACC-83 cells treated with different concentrations (25, 50, 100 μg·m L–1) of the total saponins was observed using flow cytometry. The expression levels of macrophage m igration inhibitory factor (MIF) and CD74 were measured using Western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction.ResultsThe total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis induced apoptosis and expressed dose-effect relationship. ACC-83 cells expressed MIF and CD74, and the total saponins suppressed MIF and CD74 expression in ACC-83 cells.ConclusionThe total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis can significantly inhibit the proliferation, suppress MIF and CD74 expression, and promote apoptosis in ACC-83 cells. This study provides a theoretical basis for the treatment of salivary adenoid cystic carcinoma using Paris polyphylla var. yunnanensis.

total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis; salivary adenoid cystic carcinoma; macrophage migration inhibitory factor

R 730.52

A

10.7518/hxkq.2017.03.016

2017-02-18；

2017-04-12

口腔疾病研究國家重點實驗室開放課題（SKLOD2015OF10）；云南省醫(yī)療衛(wèi)生單位內設研究機構科研項目（2016NS115）

何秋敏，碩士，E-mail：1165679243@qq.com

許彪，教授，博士，E-mail：xubiao1962@163.com