葉繪晟，龔志強(qiáng)，梁 芳，謝麗莎

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，中國(guó) 南寧 530222)

壯藥香茅草HPLC指紋圖譜研究

葉繪晟，龔志強(qiáng)，梁 芳，謝麗莎

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，中國(guó) 南寧 530222)

采用Xtimate C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱，乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) (2004 A 版)計(jì)算相似度，建立香茅草指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了13個(gè)共有峰，用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行模式辨識(shí)，12批樣品指紋圖譜與建立的對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均在 0.9以上.因此，指紋圖譜是一種有效的評(píng)價(jià)方法，可為香茅草的質(zhì)量控制提供依據(jù).

香茅草；HPLC；指紋圖譜；模式識(shí)別

香茅草為壯族、瑤族等少數(shù)民族地區(qū)習(xí)用藥材，壯藥名為棵查哈,性溫，味辛、甘，具有散寒解表、祛風(fēng)通絡(luò)、溫中止痛之功效，用于外感風(fēng)寒、風(fēng)寒濕痹、脘腹冷痛、跌打損傷、寒濕泄瀉[1].香茅草原產(chǎn)東南亞等周邊地區(qū)[2-3]，我國(guó)廣西、貴州、云南、廣東、臺(tái)灣等少數(shù)民族居住地均有生長(zhǎng)，其中臺(tái)灣香茅草產(chǎn)業(yè)發(fā)展得較早[4].香茅草具有抗菌、抗氧化、止痛、降壓、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤抑制作用[5-8].香茅草揮發(fā)油主要化學(xué)成分為橙花醛、檸檬醛和月桂烯，目前研究香茅草的藥理作用、化學(xué)成分和提取方法文獻(xiàn)較多[9-11]，但指紋圖譜方面未見(jiàn)報(bào)道.本文采用HPLC進(jìn)行香茅草的指紋圖譜研究，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制香茅草藥材的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 儀器和試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀和DAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，XS105DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，AFZ-1001-U艾科浦超純水系統(tǒng)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)，LG16-W臺(tái)式高速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司).乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純.檸檬醛對(duì)照品由Heidrich博士提供，含量為99.0%(批號(hào)：90921).香茅草藥材購(gòu)自廣西各地(表1)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院生藥教研室苑敏鑒定為禾本科植物香茅Cymbopogoncitratus(DC.)Stapf全草.

表1 香茅草藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸洗脫系統(tǒng)，梯度洗脫程序見(jiàn)表2，流速：0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，理論塔板數(shù)按橙花醛峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000.

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取檸檬醛對(duì)照品約5 mg，精密稱(chēng)量，置于25 mL容量瓶中，用適量的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得.

2.2.2 供試品溶液的制備 取香茅草藥材粉末約2 g，精密稱(chēng)量，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，靜置30 min，超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液60 ℃水浴蒸干，用適量的甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，進(jìn)離心機(jī)離心(10 000 r/min)10 min，取上清液，再用0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾,即得.

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批香茅草藥材粉末，按2.2.2項(xiàng)下制備方法制成供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖.結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.71%，相對(duì)峰面積RSD為0.40%～2.99%，符合指紋圖譜分析要求.

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液.按2.1項(xiàng)下的色譜條件，分別在0,4,8,12,16,20,24 h進(jìn)樣.結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.27%，相對(duì)峰面積RSD為1.87%～2.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定.

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定.結(jié)果6份香茅草樣品中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.05%～0.84%，相對(duì)峰面積RSD為1.56%～2.82%, 符合指紋圖譜分析要求.

2.4 指紋圖譜的建立及共有峰的確定

取12批香茅草藥材粉末，按2.2.2項(xiàng)制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣分析，得到12批香茅草藥材 HPLC色譜疊加圖，見(jiàn)圖1.采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》對(duì)12批香茅草藥材指紋圖譜的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，共標(biāo)定出13個(gè)共有指紋峰，見(jiàn)表3，共有指紋峰的峰面積占總峰面積的90%以上.相似度軟件設(shè)置，選擇S1藥材的圖譜為參照?qǐng)D譜，以平均數(shù)法作為生成對(duì)照指紋圖譜的方法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.4 min，軟件自動(dòng)匹配圖譜，系統(tǒng)依據(jù)香茅草藥材的共有模式生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖2.

圖1 12批香茅草藥材HPLC色譜疊加圖Fig.1 HPLC fingerprint of reference 12 batches of Cymbopogon citratus

圖2 香茅草對(duì)照指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of Cymbopogon citratus

表3 共有峰分析結(jié)果

2.5 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》指紋圖譜相似度軟件計(jì)算香茅草藥材指紋圖譜相似度.將12批次香茅草藥材樣品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入，以平均數(shù)法作為生成對(duì)照指紋圖譜的方法，時(shí)間窗為0.4 min，選擇對(duì)照指紋圖譜峰的10號(hào)峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，系統(tǒng)自動(dòng)匹配，計(jì)算香茅草藥材高效液相指紋圖譜相似度，結(jié)果顯示，S1～S12的相似度分別為0.936，0.925，0.990，0.982，0.969，0.967，0.943，0.964，0.973，0.956，0.905，0.983，均大于0.9，表明相似度良好.

3 小結(jié)與討論

(1)通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得在210,226和256 nm波長(zhǎng)處的高效液相色圖譜,并用二極管陣列檢測(cè)器獲得三維全波長(zhǎng)色圖譜進(jìn)行分析.實(shí)驗(yàn)表明香茅草樣品在210 nm 波長(zhǎng)下色譜峰信息一般，峰型不高，且210 nm波長(zhǎng)為近紫外吸收；256 nm波長(zhǎng)下的色譜峰信息信號(hào)較少，且峰高不高；226 nm波長(zhǎng)下的指紋圖譜基線基本上保持平穩(wěn)，而且色譜峰的信號(hào)較多.為了保證樣品在色譜圖中各化學(xué)信息完整可靠，本實(shí)驗(yàn)高效液相的檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為226 nm.

(2)通過(guò)實(shí)驗(yàn)分別將甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、乙腈-0.1%冰醋酸和乙腈-0.1%磷酸4個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)香茅草藥材高效液相色譜圖進(jìn)行考察.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以乙腈-0.1%磷酸流動(dòng)相系統(tǒng)的色譜圖各峰形好，出峰時(shí)間適中，各峰之間分離度也達(dá)到要求.空白試驗(yàn)表明所選用流動(dòng)相對(duì)樣品分析無(wú)雜質(zhì)干擾.實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了延長(zhǎng)沖洗試驗(yàn)并記錄了150 min色譜圖，發(fā)現(xiàn)70 min后無(wú)色譜峰出現(xiàn)，故確定采集時(shí)間為70 min.

(3)本次實(shí)驗(yàn)分別比較了甲醇、乙醇、水、石油醚和乙酸乙酯5種提取溶劑，考察了回流提取、超聲提取和冷浸提取3種樣品提取方法.超聲輔助提取與傳統(tǒng)醇提法相比，可以縮短提取時(shí)間，節(jié)省溶劑，提高有效成分的提取效率，簡(jiǎn)化提取操作步驟[12]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲醇超聲提取所得到的色譜圖中的色譜峰數(shù)多，且分離效果好，故選定甲醇超聲提取.同時(shí)分別比較了超聲提取時(shí)間為15,30,45 min情況下所得的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min時(shí)可提取充分，實(shí)驗(yàn)時(shí)間適宜，綜合考慮，故確定超聲提取時(shí)間為30 min.

中藥的質(zhì)量不僅與中藥種植有關(guān)，更關(guān)系到中藥飲片的加工與貯藏[13]，以某單一的有效化學(xué)成分來(lái)控制中藥質(zhì)量已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn)代中藥的發(fā)展要求，目前指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)研究已成為現(xiàn)代中藥研究常用的一種方法[14]，可以在不清楚全部化學(xué)成分的情況下控制中藥藥材中的內(nèi)在質(zhì)量.此次香茅草藥材指紋圖譜測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速而且準(zhǔn)確、可靠，可為該藥材質(zhì)量控制研究及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

[1] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):2011版：第二卷[M].南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社,2011.

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(編輯 WJ)

HPLC Fingerprints of Zhuang MedicineCymbopogonCitratus

YEHui-sheng,GONGZhi-qiang*,LIANGFang,XIELi-sha
(Faculty of Chinese Medical Science, Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530222, China)

The Xtimate C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) chromatography column was used with acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution in the gradient elution mode. The flow rate was 0.8 mL·min-1and the detection wavelength was 226 nm. The similarity assay for the fingerprints ofCymbopogoncitratuswas carried out to evaluate their quality with the Chinese material medica fingerprint similarity evaluation system (2004 A edition). The common mode of HPLC fingerprints forCymbopogoncitratuswas set up. There were 13 common peaks in the fingerprints, and the similarity degrees of 12 batches of samples were above 0.9. Hence, the established method is effecient for the quality control of the Zhuang medicineCymbopogoncitratus.

Cymbopogoncitratus; HPLC; chromatographic fingerprint; pattern recognition

2016-08-31

廣西教育廳科研課題一般資助項(xiàng)目(YB2014616;2013LX064)

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.03.009

R285.5

A

1000-2537(2017)03-0049-04

*通訊作者,E-mail：gong150645259@126.com