郭 園,曾星星,劉雪梅,沈 遙,陳 波

(湖南師范大學(xué)植化單體開發(fā)與利用湖南省重點實驗室，中國 長沙 410081)

基于一步法萃取嬰幼兒奶粉中游離態(tài)葉黃素和β-胡蘿卜素研究

郭 園?,曾星星?,劉雪梅,沈 遙,陳 波

(湖南師范大學(xué)植化單體開發(fā)與利用湖南省重點實驗室，中國 長沙 410081)

為建立簡單、快速、準確的樣品前處理方法以提高嬰幼兒奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素的提取效率，通過顯微鏡觀察奶粉樣品中葉黃素包埋劑的溶解特性，采用有機溶劑一步萃取的方式替代傳統(tǒng)耗時的皂化法.樣品加水破除包埋劑，后續(xù)經(jīng)乙醇溶解剩余被脂類成分包裹的包埋劑并沉淀蛋白，再用甲基叔丁基醚在單相中一步萃取葉黃素和β-胡蘿卜素，方法無需濃縮，適用于高效液相色譜直接分析.結(jié)果表明，游離態(tài)葉黃素和β-胡蘿卜素的線性相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，加標回收率為91%～94%，且所有RSD<5%.

葉黃素；β-胡蘿卜素；嬰幼兒奶粉；樣品前處理；一步萃取

類胡蘿卜素具有延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗突變、預(yù)防癌癥等多種生理功能[1-2]，其中，天然葉黃素是優(yōu)良的抗氧化劑，具有預(yù)防老年性黃斑區(qū)病變、預(yù)防白內(nèi)障等獨特功能[3].β-胡蘿卜素是維生素A的重要來源，具有抗氧化以及增強免疫力等作用[4-5].葉黃素和β-胡蘿卜素已經(jīng)作為食品添加劑和營養(yǎng)增補劑廣泛用于食品加工.2012年3月頒布的《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》批準了葉黃素(萬壽菊來源)可用于嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品中，其添加量分別為300～2 000 μg/kg，1 620～4 230 μg/kg[6].

葉黃素和β-胡蘿卜素均為含有多個異戊二烯單位的四萜化合物，對光、熱、氧敏感，極易發(fā)生結(jié)構(gòu)異構(gòu)化.因此，葉黃素和β-胡蘿卜素一般以其包埋體的方式添加到實際樣品中[5].葉黃素和β-胡蘿卜素的提取工藝一般為有機溶劑提取法、酶反應(yīng)提取法、超聲波輔助提取法等.有機溶劑提取法通常選用乙醚、石油醚等毒性較大的有機試劑，而且需要反復(fù)萃取多次，試劑消耗量大，萃取時間較長[4].近年來，也有研究應(yīng)用皂化方法對葉黃素和β-胡蘿卜素進行提取并同時測定，樣品需求量少，對葉黃素而言，測定結(jié)果包含酯化的葉黃素和游離態(tài)的葉黃素，準確度高[7-8]，但皂化過程依舊復(fù)雜、耗時，且操作過程因操作人員的技術(shù)水平差異很容易產(chǎn)生誤差.本文從破除包埋劑、一步萃取的角度出發(fā)，采用溶劑直接溶解包埋劑，釋放葉黃素和β-胡蘿卜素，然后用溶劑一步萃取游離態(tài)葉黃素和β-胡蘿卜素的方式，省去了耗時的皂化過程，且樣品無需濃縮，簡化了樣品的前處理過程，大大縮短了樣品前處理時間，方法簡單、快速、準確.為嬰幼兒奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素的提取測定提供新的研究視角.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：島津LC-20A高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器)，UV-1780紫外可見分光光度計(日本島津公司)；澳浦光電UB100i生物顯微鏡；TG 16G臺式離心機(湖南凱達公司)；WH-2微型旋渦混合儀；KQ5200B型超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司)；AL204電子天平(上海梅特勒-托利多公司)等.

試劑：葉黃素和β-胡蘿卜素標準品均為西亞試劑(成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)，葉黃素包埋原料(雅培公司提供).甲醇、甲基叔丁基醚(均為色譜純)；抗壞血酸、無水乙醇、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)、石油醚、乙醚、氫氧化鉀、二氯甲烷、氯仿、乙酸丁酯、正丁醇、丙酮(均為分析純)，水為去離子水.

1.2 色譜分離條件

色譜柱：大連江申P(guān)rontoSIL C30 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫：18 ℃；進樣體積：30 μL；檢測波長451 nm；流動相：A為甲醇，B為甲基叔丁基醚；梯度洗脫程序：0～6 min, 10%～45%B; 6～10 min, 45%～90% B; 10～12 min, 90%～10%B; 12～16 min, 10%B；流速：1.0 mL/min；總運行時間：16 min.

1.3 標準溶液的配制與標定

(1)標準儲備液配制 分別稱取葉黃素、β-胡蘿卜素標準品2 mg(精確到0.001 g)，用無水乙醇(色譜純)溶解，分別定容至50 mL.

(2)標準溶液濃度標定 分別吸取標準儲備液葉黃素500 μL,β-胡蘿卜素5 mL，用無水乙醇(色譜純)定容至10 mL作為校正液.用分光光度計全波長掃描，確定其最大吸收波長；在各自最大吸收波長下分別測定吸光度5次，以公式C=A×10 000/E計算其實際濃度.

(3)標準溶液色譜純度測定 將校正液按1.2條件進行高效液相色譜(HPLC)測定，平行測定3次，通過面積歸一法(葉黃素7～15 min，β-胡蘿卜素12～15 min)，得到標準品中全反式葉黃素和β-胡蘿卜素的色譜純度.標定后的標準溶液的濃度乘以其色譜純度，即得到標準儲備液中全反式葉黃素和β-胡蘿卜素的實際濃度.

1.4 樣品前處理方法

稱取均勻固體樣品2 g(精確到0.001 g)于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加5 mL水渦旋溶解.在樣品溶液中加入5 mL含0.1%BHT乙醇溶液渦旋振蕩3次，1 min/次.再向樣品溶液中加入10 mL含0.1%BHT甲基叔丁基醚溶液，渦旋3次，1 min/次.4 500 r/min下離心3 min使分層.將上層有機相轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶，甲基叔丁基醚定容.用0.45 μm微孔濾膜過濾至2 mL棕色進樣瓶中，待HPLC分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

由于葉黃素、β-胡蘿卜素易受光、熱等因素的影響，性質(zhì)不穩(wěn)定，一般采用微膠囊技術(shù)對其進行包埋處理后再添加到實際樣品中，直接用有機溶劑提取較困難[5,8].葉黃素和β-胡蘿卜素的常用包埋劑有明膠、阿拉伯膠、酪蛋白酸鈉、麥芽糊精、蔗糖、辛烯基琥珀酸淀粉酯等[9-12]，均為水溶性包埋劑，但奶粉基質(zhì)可能存在脂類成分包裹包埋劑的情況，此時水便無法破除被脂類成分包裹的包埋劑.基于一步法萃取的考慮，本實驗考察水及多種極性有機溶劑對包埋劑的溶解情況，對比去除包埋劑后多種溶劑的提取效果.

2.1.1 包埋劑溶解溶劑的選擇和優(yōu)化 實驗以葉黃素的包埋原料為代表模型，分別采用了乙酸丁酯、正丁醇、乙醇、丙酮、水共5種溶劑對原料包埋劑進行溶解破除，在顯微鏡下觀察其溶解情況.通過顯微鏡的觀察，葉黃素包埋原料在顯微鏡下呈現(xiàn)大量包裹有黃色塊狀物質(zhì)的球形氣泡狀和少量零散的黃色塊狀顆粒(圖1a)，加入不同的溶劑后，原料逐漸呈現(xiàn)出不同的情形，如圖1.直接加入正丁醇或乙酸丁酯時，顯微鏡下的氣泡狀顆粒沒有明顯變化(b)；加入乙醇或丙酮時，氣泡狀顆粒隨溶劑游動、聚集且隨溶劑揮發(fā)逐漸破裂，其間的黃色物質(zhì)釋放出來，一段時間后，氣泡狀顆粒明顯減少，黃色塊狀顆粒物明顯增加(c,d)；加入水時，視野中瞬時間就只剩下較分散的黃色塊狀顆粒物(e).顯微鏡的觀察結(jié)果表明，水對于包埋劑的溶解效果最佳，乙醇和丙酮次之，因此選擇水作為葉黃素和β-胡蘿卜素的包埋劑溶解劑.

圖1 不同溶劑對包埋劑的溶解情況的顯微鏡圖Fig.1 Micrographs of embedded lutein in different solvents

2.1.2 萃取溶劑的選擇和優(yōu)化 在類胡蘿卜素中，葉黃素屬胡蘿卜醇類，含有羥基，極性相對較強，而β-胡蘿卜素屬烴類，極性相對較弱，需要選擇極性合適的溶劑同時實現(xiàn)二者的高提取率.基于奶粉基質(zhì)中含有大量的蛋白和其他配方成分，考察了奶粉樣品在水溶液中被分散并破除包埋劑后，直接用有機溶劑渦旋萃取并離心的情況，所用有機溶劑分別為二氯甲烷、乙醇、乙醚、甲基叔丁基醚、正丁醇、丙酮、氯仿、石油醚(圖2).結(jié)果表明，奶粉加水后，直接加二氯甲烷/乙醚/甲基叔丁基醚/正丁醇/氯仿/石油醚形成乳狀懸濁液，且離心后無明顯變化(見圖2 a,b,c,e,g,h)，說明這些溶劑無法實現(xiàn)直接萃?。恢苯蛹右掖蓟虮墒沟鞍鬃冃?，離心后，蛋白層和溶劑層分層明顯(見圖2 d,f)，但由圖3 a,b可知，溶劑層中的葉黃素和β-胡蘿卜素并未完全溶解.在此溶劑層的基礎(chǔ)上，再選擇的合適溶劑便可溶解該相中的葉黃素和β-胡蘿卜素.

雖然乙醇和丙酮均可沉淀蛋白，但由于乙醇極性較大、毒性較低，且乙醇也能溶解部分被脂質(zhì)所包裹的葉黃素包埋劑，使葉黃素完全釋放出來，故在后續(xù)實驗中選用乙醇以沉淀蛋白.

a.二氯甲烷；b.乙醚；c.石油醚；d.乙醇；e.正丁醇；f.丙酮；g.甲基叔丁基醚；h.氯仿圖2 奶粉加水后多種有機溶劑直接萃取并離心現(xiàn)象對比圖Fig.2 Comparison of milk water solution after various organic solvent extraction and centrifugation

以葉黃素包埋原料為例，進一步考察原料依次加入水和乙醇釋放出葉黃素后，常用類胡蘿卜素提取溶劑乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚對其的溶解提取效果.圖3a表明依次加入水和乙醇后葉黃素以塊狀存在，并未完全溶解，在此基礎(chǔ)上進一步加入萃取劑二氯甲烷(圖3c)或者甲基叔丁基醚(圖3d)后對比加入乙醇后(圖3a)的顯微鏡結(jié)果表明，黃色塊狀顆粒逐漸溶解，溶液顏色明顯變黃，說明合適的萃取溶劑可以將葉黃素有效地溶解提取出來.β-胡蘿卜素的極性較葉黃素更弱，乙醇對其溶解和萃取效率將會更低，二氯甲烷毒性較大，不能直接進液相色譜儀分析，甲基叔丁基醚萃取液的液相色譜分析結(jié)果表明其對葉黃素和β-胡蘿卜素的提取效果均較好；另外，加入甲基叔丁基醚離心后，有機相與水相分層，蛋白浮于兩相分層處，便于操作，因此本文實驗最終選擇甲基叔丁基醚作為萃取溶劑.奶粉樣品中葉黃素和β-胡蘿卜素同時提取并分析的色譜圖見圖4.

圖3 多種萃取溶劑對葉黃素的提取顯微鏡圖Fig.3 Micrographs of extraction of lutein by different solvents

圖4 奶粉樣品中葉黃素及β-胡蘿卜素的同時分析色譜圖 Fig.4 Chromatogram of simultaneous determination of lutein and β-carotene in sample

2.2 色譜分離條件優(yōu)化

若要在盡量短的時間內(nèi)對二者同時分析，則必須采用梯度洗脫.對葉黃素進行定量計算時，通常把13-順式和13′-順式的兩個順式葉黃素也共同納入計算[13]，因此梯度條件還須保證三個順反式葉黃素的分離.實驗以10%甲基叔丁基醚為起始比例，后逐步增加甲基叔丁基醚至45%先洗脫出葉黃素，再增加甲基叔丁基醚到90%洗脫出β-胡蘿卜素，較好地實現(xiàn)了對葉黃素三個順反異構(gòu)體及β-胡蘿卜素的分離(見圖4).

2.3 標準曲線

分別準確吸取1.3中已標定的葉黃素和β-胡蘿卜素標準儲備液適量進行稀釋，稀釋后的濃度分別為0.038 44,0.048 05,0.096 11,0.192 2,0.480 5,0.961 1 mg/L和0.027 79,0.055 59,0.139 0,0.277 9,0.555 9,1.390 mg/L，按1.2條件進行測定.標準溶液標定結(jié)果及標準曲線線性見表1.

表1 標準溶液標定及標準曲線線性

2.4 加標回收率

在已知含量的奶粉樣品中分別進行葉黃素和β-胡蘿卜素的高、中、低3個濃度水平的加標，每組做3個平行，每個平行連續(xù)分析3次，平均加標回收率范圍分別為91.80%～93.46%和91.94%～94.22%，全部RSD<5%(見表2).與文獻方法[7]中的加標回收率80%～90%相比，本方法回收率良好.

表2 加標回收率結(jié)果

2.5 精密度與準確度

對比本方法與文獻方法[7]中的皂化方法對市售奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素進行測定，每個樣品做6組平行樣，每組平行樣連續(xù)分析3次，測定結(jié)果見表3，本方法RSD<6%，精密度良好.方法還對不同廠家的不同配方奶粉進行了廣泛的驗證，結(jié)果表明本文提出的方法對于基礎(chǔ)配方奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素的測定有明顯的簡便、快速、準確的優(yōu)勢，但對于某些特殊工藝的配方奶粉(如樣品3)中葉黃素和β-胡蘿卜素的測定結(jié)果則稍稍偏低，這可能是由于在特殊配方的復(fù)雜工藝中少量添加的葉黃素和β-胡蘿卜素以酯化形式存在而造成的.

表3 樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文對嬰幼兒配方奶粉的前處理方法進行研究，省去了耗時的皂化方法，從破除包埋劑、一步萃取的角度出發(fā)，用水溶解包埋劑，釋放出葉黃素和β-胡蘿卜素，乙醇沉淀蛋白，再采取甲基叔丁基醚直接提取的方式，建立了快速、準確測定樣品中游離態(tài)葉黃素和β-胡蘿卜素的方法.本方法與文獻中的皂化方法對市售奶粉的檢測結(jié)果對比表明，該方法盡管在某些生產(chǎn)商的特殊配方奶粉測定中稍顯不足，但是對市場占有率最大的各生產(chǎn)商基礎(chǔ)配方奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素分析時則有明顯的優(yōu)勢：步驟簡單，速度快，結(jié)果準確度高，精密度好.

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(編輯 WJ)

One-Step Extraction of Free Lutein andβ-Carotene from Infant Formula

GUOYuan?,ZENGXing-xing?,LIUXue-mei,SHENYao*,CHENBo
(Key Laboratory of Phytochemical R&D of Hunan Province, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

We report, in this work, the establishment of a simple, rapid and accurate sample pretreatment method to improve the extraction efficiency of lutein andβ-carotene in infant milk powder. To replace the time-consuming saponification method, dynamic dissolution processes of different solvents for embedding materials of lutein and simultaneous extraction of lutein andβ-carotene by organic solvents were inspected using a microscope. Using water to dissolve the embedding material to free lutein andβ-carotene and ethanol to precipitate proteins, we show that the sample can be extracted by methyl tert-butyl ether in monophase. After that, the extraction solution could be analyzed by HPLC without concentration. The calibration curve of free lutein andβ-carotene exhibited good linearity, with bothr2equal to 0.999 9. Recoveries ranged from 91% to 94%, and relative standard deviations (RSDs) are less than 5%.

lutein;β-carotene; infant formula; sample pretreatment; one-step extraction

2016-07-10

國家自然科學(xué)基金項目(21575040)

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.03.010

R155

A

1000-2537(2017)03-0053-05

?這兩位作者對本論文的貢獻值相同

*通訊作者,E-mail：lvy33@163.com,