高紅兵，杜鳳國(guó)，王 歡

(北華大學(xué)林業(yè)與生態(tài)環(huán)境省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013)

抗褐化劑對(duì)天女木蘭芽外植體褐化與酚酸氧化的影響

高紅兵，杜鳳國(guó)，王 歡

(北華大學(xué)林業(yè)與生態(tài)環(huán)境省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013)

[目的]確定引起天女木蘭褐化現(xiàn)象的酚酸種類(lèi)，篩選出最佳抗褐化劑及使用最適濃度。[方法]在B5培養(yǎng)基中分別添加各種抗褐化劑，芽外植體培養(yǎng)30 d后計(jì)算出褐化率，對(duì)褐化率結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并比較三種抗褐化劑的抗褐化效果；另外，在組培過(guò)程中定期取樣，利用HPLC測(cè)定芽外植體中咖啡酸、綠原酸和對(duì)香豆酸含量變化。[結(jié)果]表明：天女木蘭芽外植體褐化過(guò)程中咖啡酸和綠原酸含量下降幅度較大，而對(duì)香豆酸含量下降幅度較小，說(shuō)明咖啡酸和綠原酸容易被氧化，而對(duì)香豆酸較為穩(wěn)定；三種抗褐化劑控制褐化現(xiàn)象發(fā)生的最佳效果排序?yàn)閂C>PVP>CA；盡管PVP控制酚酸氧化效果不如CA，但是預(yù)防褐化效果確強(qiáng)于CA，其原因是由于二者抗褐化機(jī)理不同所致；VC使用的最適濃度為500 mg·L-1，如果超過(guò)此濃度會(huì)導(dǎo)致外植體褐化率增加； PVP最適濃度為1 000～1 500 mg·L-1, CA最適濃度為300 mg·L-1。[結(jié)論]天女木蘭芽外植體褐化底物是咖啡酸和綠原酸，而與對(duì)香豆酸無(wú)關(guān)；VC、PVP和CA三種抗褐化劑抗褐化機(jī)理各不相同，綜合比較VC抗褐化效果最好，其次是PVP,CA排在最后。

天女木蘭，外植體，抗褐化劑，酚酸氧化

天女木蘭(MagnoliasieboldiiK. Koch)又名小花木蘭，為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia)的落葉小喬木，是國(guó)家三級(jí)瀕危植物。天女木蘭在組培過(guò)程中外植體褐化非常嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了其組培成功率。木本植物與草本植物相比褐化現(xiàn)象更為嚴(yán)重，其原因是木本植物含較多的酚類(lèi)化合物。多酚氧化酶(PPO)是末端氧化酶，在正常情況下植物體酚類(lèi)物質(zhì)與醌類(lèi)分布在細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域，酚類(lèi)物質(zhì)分布在液泡內(nèi)，PPO分布在質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)中與膜結(jié)合呈潛伏狀態(tài)，當(dāng)外植體被切割后膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，PPO與酚類(lèi)物質(zhì)接觸，在外植體傷口處發(fā)生氧化作用，酚類(lèi)物質(zhì)被氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，醌類(lèi)物質(zhì)再經(jīng)非酶促反應(yīng)聚合形成褐色物質(zhì)，并對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[1-5]。為了控制外植體褐化，人們?cè)谂囵B(yǎng)基中添加抗褐化劑達(dá)到預(yù)防褐化目的，比如：維生素C、檸檬酸、半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和活性炭等。目前，有少量使用抗褐化劑抑制天女木蘭組培褐化方法的研究報(bào)道[6-7]，而關(guān)于抗褐化劑控制天女木蘭外植體褐化機(jī)理的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文以天女木蘭芽作為外植體，在培養(yǎng)基中分別添加維生素C、檸檬酸和聚乙烯吡咯烷酮三種類(lèi)型抗褐化劑，在組織培養(yǎng)過(guò)程中定期取樣，利用高效液相色譜儀測(cè)定芽外植體中主要酚酸含量動(dòng)態(tài)變化，確定引起天女木蘭褐化現(xiàn)象的主要酚酸種類(lèi)，從外植體褐化率及外植體主要酚酸含量動(dòng)態(tài)變化兩方面，比較三種抗褐化劑的抗褐化效果，確定酚酸種類(lèi)與褐化的關(guān)系，為解決天女木蘭組培褐化問(wèn)題及揭示不同類(lèi)型抗褐化劑的作用機(jī)理提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)材料與培養(yǎng)方法

于4月初采集天女木蘭成年樹(shù)上一年生枝條，放置在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行水培8～10 d，待芽萌動(dòng)膨大時(shí)剪取頂芽和側(cè)芽，芽長(zhǎng)0.5～1.0 cm，用洗潔精浸泡20 min，流水沖洗2 h。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將芽放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液中消毒30 s，用無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞處理7 min，無(wú)菌水沖洗5次，接種。

1.2 培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)條件及褐化率計(jì)算、統(tǒng)計(jì)分析方法

在B5培養(yǎng)基中分別添加不同濃度維生素C(以下簡(jiǎn)稱VC)、檸檬酸(以下簡(jiǎn)稱CA)和聚乙烯吡咯烷酮(以下簡(jiǎn)稱PVP)三種抗褐化劑，其余添加成份相同，分別添加0.5 mg·L-1六芐基腺嘌呤(6-BA)、0.3 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)、蔗糖30 g·L-1，調(diào)pH 5.6～5.8。試驗(yàn)設(shè)一個(gè)對(duì)照(CK)和三個(gè)不同濃度(T1、T2和T3)處理，每個(gè)處理培養(yǎng)30瓶，重復(fù)3次。各處理添加抗褐化劑濃度詳見(jiàn)表1。培養(yǎng)溫度25℃，光照1 500～2 000 lx，培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)外植體褐化率。褐化率計(jì)算方法為：褐化率=褐化瓶數(shù)/培養(yǎng)瓶數(shù)×100%。試驗(yàn)采用單因素方差分析及多重比較，利用Spass 18.0版軟件對(duì)褐化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 取樣與酚酸測(cè)定方法

1.3.1 取樣 接種10 d后開(kāi)始取樣，取樣時(shí)間為10 d、20 d 和30 d，選取具有代表的芽外植體，液氮冷凍，存放于-80℃超低溫冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酚酸提取及測(cè)定方法 參考 Rosa等[8]發(fā)表的方法略加改動(dòng)。稱取冷凍樣品 2.0 g，加液氮研磨，用 16 mL 60% 乙醇超聲波提取 30 min，重復(fù)提取3次，過(guò)濾，濾液合并。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 35℃低壓蒸出乙醇剩水相，用 6 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)水相 pH至 2.0，用 30 mL 乙酸乙酯萃取 3次，合并酯相。在35℃下濃縮至干，殘?jiān)?60%甲醇溶解，定容至 5 mL，用 0.45μm 濾膜過(guò)濾，上樣檢測(cè)。

1.3.3 HPLC測(cè)定酚酸的條件及方法 高效液相色譜儀(型號(hào)LC-20A，島津公司生產(chǎn))；二極管陣列檢測(cè)器(型號(hào)SPD-M20A)；InertSustainC18色譜柱(規(guī)格4.6 mm ×250 mm,5 μm)。使用A和B雙泵系統(tǒng)，流速0.8 mL·min-1, 柱溫30℃。流動(dòng)相A為1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水溶液，流動(dòng)相B為1%乙酸甲醇溶液；采用梯度洗脫，洗脫梯度：起始濃度10% B;0～15 min,18% B;15～35 min,25% B;35～45 min,35% B;45～60 min,50% B;60～65 min,95% B。甲醇和乙酸均為色譜純，咖啡酸、綠原酸和對(duì)香豆酸純度>99%(Sigma公司生產(chǎn))。定量方法采用孫洪圳[9]等介紹的方法進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)三次進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗褐化劑對(duì)芽外植體褐化的影響

三種抗褐化劑對(duì)外植體褐化率的影響見(jiàn)表1。從表1得出，除VC(T3)處理之外，其余各處理褐化率與對(duì)照相比差異均極顯著。三種抗褐化劑處理褐化率最低的前三名排序?yàn)閂C (T2)、VC (T1)和PVP(T3)處理，VC表現(xiàn)出良好的抗褐化效果，但是其三個(gè)不同濃度處理褐化率差異較大，VC(T2)處理褐化率最低為12.2%，其次是VC(T1)處理16.7%，二者差異不顯著，但是VC(T3)處理褐化率高達(dá)48.9%，與T1、T2處理相比差異極其顯著，而與CK處理褐化率差異不顯著，其原因在后面討論中進(jìn)行。PVP抗褐化效果僅次于VC(T1和T2)處理，PVP處理褐化率變化比較有規(guī)律性，隨著添加PVP濃度增加，外植體褐化率下降，T1、T2和T3處理褐化率分別為26.7%、18.9%和17.8%。CA處理的褐化率最高，其T1、T2和T3處理的褐化率分別為 36.7%、26.7%和27.8%，T2和T3處理抗褐化效果明顯好于T1處理，差異十分顯著，但是T2和T3處理之間差異不顯著。

表1 不同濃度抗褐化劑處理對(duì)外植體褐化的影響

表中褐化率一欄數(shù)據(jù)為褐化率平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫(xiě)字母表示差異極顯著(α=0.01)。

褐化程度分輕、中和重度三級(jí)，分別用“+”、“++”和“+++”表示。

Values represent the means ±SE,and different small letters within the column indicated significance atα=0.01 level.

Browning degree is categorized into light, moderate, and severe levels, represented by +”, “++”and “+++”, respectively.

2.2 VC處理對(duì)芽外植體中酚酸含量變化影響

不同濃度VC處理對(duì)天女木蘭芽中咖啡酸含量變化影響見(jiàn)圖1A。在培養(yǎng)第10～30 d，各處理咖啡酸含量均呈下降趨勢(shì)，其中CK處理咖啡酸含量下降幅度高達(dá)66.4%，而T1、T2和T3分別下降43.4%、12.8%和66.7%，T2處理咖啡酸下降幅度最小，其次是T1處理，T3處理咖啡酸下降幅度最大，其下降幅度還略高于CK處理下降幅度；在培養(yǎng)初期第10 d時(shí)，T1和 T2處理與CK處理相比咖啡酸含量高出8.21%和15.56%，而T3處理咖啡酸含量比CK處理低28.3%。外植體中咖啡酸的下降幅度越大，說(shuō)明咖啡酸氧化程度高。試驗(yàn)結(jié)果顯示T2處理預(yù)防咖啡酸氧化效果最好，其次是T1處理，T3處理從結(jié)果看似乎是咖啡酸氧化加劇，但是其原因比較復(fù)雜，這一現(xiàn)象在后面討論中進(jìn)行。

圖1B顯示VC處理對(duì)綠原酸含量變化的影響。各處理綠原酸含量均呈下降趨勢(shì)，第10～30 d，CK處理綠原酸含量下降70.9%，而T1、T2和T3處理綠原酸下降幅度分別為32.9%、24.5%和67.4%，其中T2處理下降幅度最小，其次是T1處理，T3處理下降幅度最大；在第10 d，CK處理綠原酸含量分別比T1和T2處理下降4.9%和7.6%，而與T3處理相比綠原酸含量還高16.7%；在第10～30 d，CK處理綠原酸含量一直低于T1和T2處理，但高于T3處理，綠原酸與咖啡酸含量變化具有相同規(guī)律。

圖1C顯示VC處理對(duì)對(duì)香豆酸含量變化的影響。在第10 ～30 d，對(duì)香豆酸含量整體呈下降趨勢(shì)，其中CK處理對(duì)香豆酸含量下降僅為7.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于咖啡酸和綠原酸CK處理66.4%和70.9%的下降幅度。T1、T2和T3處理對(duì)香豆酸含量下降幅度分別是7.4%、6.1%和13.8%，T1和T2處理與CK處理相差不大，而T3處理與CK處理相比下降幅度相對(duì)較大。

圖1 不同濃度VC處理對(duì)芽中咖啡酸(A)、綠原酸(B)和對(duì)香豆酸(C)含量變化的影響 Fig.1 Effects of different VC levels on content changes of caffeic acid (A), chlorogenic acid (B), and p-coumaric acid (C) in buds

從圖1(A、B和C)的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，天女木蘭外植體芽中咖啡酸和綠原酸化學(xué)性質(zhì)非?；钴S易被氧化。在培養(yǎng)初期，外植體中咖啡酸和綠原酸含量下降幅度較大，VC可以阻止二者含量大幅下降的趨勢(shì)，即具有預(yù)防咖啡酸和綠原酸被氧化的功能。培養(yǎng)基中添加VC濃度在250～500 mg·L-1范圍時(shí)，隨著VC濃度增加預(yù)防酚酸氧化效果越好，當(dāng)培養(yǎng)基中VC濃度達(dá)750 mg·L-1時(shí)，VC起到加速咖啡酸和綠原酸下跌作用，即失去了保護(hù)酚酸的功效。對(duì)香豆酸含量在芽組培過(guò)程中變化幅度不大，說(shuō)明其較為穩(wěn)定，不易被氧化。培養(yǎng)基中添加VC濃度250～500 mg·L-1時(shí)，對(duì)其含量變化無(wú)太大影響，但VC濃度達(dá)到750 mg·L-1時(shí)，對(duì)香豆酸含量亦會(huì)快速下降。

2.3 CA處理對(duì)芽外植體中酚酸含量變化影響

CA對(duì)咖啡酸含量變化影響見(jiàn)圖2A，在第10～30 d，各處理咖啡酸含量整體均呈下降趨勢(shì)，其中T2處理咖啡酸含量下降44.8%，下降幅度最小，其次是T3處理下降47.2%，T1處理下降幅度最大為63.1%。三處理咖啡酸含量下降幅度均低于CK處理66.4%下降幅度；在第10 d時(shí)，CK處理與T1、T2和T3處理相比，咖啡酸含量分別下降4.9%、6.3%和6.9%，至第20 d，下降幅度加大，分別為13.4%、43.0%、40.7%。

圖2B顯示CA對(duì)綠原酸含量變化的影響。綠原酸含量變化規(guī)律與咖啡酸很相似，整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在第10～30 d，T1、T2和T3處理綠原酸含量下降幅度分別為50.5%、34.2%和36.2%，均低于CK處理 70.9%下降幅度；在第10 d時(shí)，CK處理綠原酸含量與T1、T2和T3處理相比分別低4.8%、6.5%和6.6%，至第20 d時(shí)下降幅度加大，分別低 30.8%，23.4%和 22.0%。

對(duì)香豆酸含量變化見(jiàn)圖2C，在第10～30 d，各處理對(duì)香豆酸含量均小幅呈下降趨勢(shì)， T1、T2和T3處理對(duì)香豆酸含量下降幅度分別為6.2%、8.1%和5.2%，與CK組7.4%的下降幅度相比，差別不大。

圖2 不同濃度CA對(duì)咖啡酸(A)、綠原酸(B)和對(duì)香豆酸(C)含量變化的影響Fig.2 Effects of different CA levels on content changes of caffeic acid (A), chlorogenic acid (B), and p-coumaric acid (C) in buds

從圖2(A、B和C圖)可以得出，CA對(duì)咖啡酸和綠原酸具有顯著的保護(hù)作用，在100～300 mg·L-1范圍內(nèi)隨著CA濃度增加，二者含量下降幅度減小，即CA預(yù)防酚酸氧化能力增強(qiáng)；當(dāng)CA濃度達(dá)到500 mg·L-1時(shí)，預(yù)防酚酸氧化效果并未增強(qiáng)。CA與VC均具有防止咖啡酸和綠原酸被氧化的功能，不同之處在于，高濃度VC會(huì)導(dǎo)致咖啡酸和綠原酸含量大幅下降，而CA則未出現(xiàn)此現(xiàn)象。在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)香豆酸含量變化幅度不大，CA對(duì)其保護(hù)作用不顯著。

2.4 PVP對(duì)酚酸含量變化的影響

不同濃度PVP對(duì)咖啡酸含量變化的影響見(jiàn)圖3A。 在第10～30 d，各處理咖啡酸含量均呈下降趨勢(shì)， T1、T2和T3處理咖啡酸含量分別下降63.3%、59.1%和49.3%，均低于CK組66.4%的下降幅度；第10 d時(shí)，CK處理咖啡酸含量與T1、T2和T3處理相比變化幅度不大，變化在5%范圍內(nèi)，至20 d時(shí)，下降幅度分別為11.7%、19.6%和34.8%，下降幅度開(kāi)始加大。

PVP對(duì)綠原酸含量變化影響見(jiàn)圖3B，各處理綠原酸含量整體呈下降趨勢(shì)，在第10～30 d，T1、T2和T3處理綠原酸含量下降幅度分別為60.7%、57.1%和55.2%，低于CK對(duì)照 66.4%的下降幅度；第10 d時(shí)，各處理處理綠原酸含量與CK處理相比相差不大，CK處理咖啡酸含量略高于T1和T2處理，低于T3處理，至第20 d時(shí)，CK組綠原酸含量與T1、T2和T3處理相比下降幅度加大，分別為26.0%、32.9%和35.9%。

PVP處理與對(duì)香豆酸含量變化關(guān)系見(jiàn)圖3C，在培養(yǎng)第10～30d，各處理香豆酸含量均呈小幅下降趨勢(shì)，T1、T2和T3處理對(duì)香豆酸含量下降幅度分別為5.6%，5.6%和5.3%，略低于CK處理7.4%的下降幅度，PVP處理對(duì)對(duì)香豆酸含量變化影響不大。

從圖3(A、B和C)可以得出，PVP亦具有預(yù)防咖啡酸和綠原酸含量下降作用，即對(duì)外植體內(nèi)咖啡酸和綠原酸具有保護(hù)功能，但是通過(guò)與VC和CA處理咖啡酸和綠原酸含量變化比較，PVP對(duì)咖啡酸和綠原酸的保護(hù)效果不如VC和CA處理。對(duì)香豆酸化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，PVP處理與VC和CA處理對(duì)其含量變化影響不大。

圖3 不同濃度PVP處理對(duì)咖啡酸(A)、綠原酸(B)和對(duì)香豆酸(C)含量變化的影響Fig.3 Effects of different PVP levels on content changes of caffeic acid (A), chlorogenic acid (B), and p-coumaric acid (C) in buds

3 結(jié)果與討論

3.1 主要酚酸與外植體褐化之間關(guān)系

酚類(lèi)物質(zhì)是植物體內(nèi)次生物質(zhì)，其種類(lèi)繁多，主要包括酚酸、黃酮、單寧和木質(zhì)素。植物組培褐化現(xiàn)象產(chǎn)生經(jīng)常由于不同種酚類(lèi)物質(zhì)造成，如板栗與蝴蝶蘭褐化主要是由于單寧氧化引起[10-12]，綠原酸是造成蘋(píng)果、油橄欖和甜菜褐化的主要底物[13-15]。印芳等對(duì)蝴蝶蘭研究發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭褐化與總酚含量有關(guān)，其中綠原酸、咖啡酸、兒茶酚和對(duì)香豆酸等可能是褐化底物[16-17]。天女木蘭組培褐機(jī)理研究尚未見(jiàn)報(bào)道，我們?cè)肏PLC儀對(duì)天女木蘭芽中咖啡酸、綠原酸、對(duì)香豆酸、沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮素、阿魏酸、香豆素和蘆丁等十種酚酸進(jìn)行了定性定量測(cè)定，僅檢測(cè)到了對(duì)香豆酸、咖啡酸和綠原酸三種酚酸，其中對(duì)香豆酸含量最高，其次是咖啡酸，綠原酸含量最低。

綜合本文研究結(jié)果分析，CK處理與抗褐化劑處理相比褐化率最高，而其外植體中咖啡酸和綠原酸下降幅度亦最大，說(shuō)明二者被氧化程度高，外植體中大量咖啡酸和綠原酸被氧化成醌類(lèi)物質(zhì)導(dǎo)致其含量大幅下降，CK處理結(jié)果顯示咖啡酸和綠原酸氧化與褐化率密切相關(guān)；另外，從抗褐化劑處理試驗(yàn)結(jié)果亦可以得出相同結(jié)論，抗褐化劑各處理外植體褐化率均低于CK處理，證明抗褐化劑對(duì)咖啡酸和綠原酸具有保護(hù)作用，具有預(yù)防酚酸氧化功能，在抗褐化劑理中VC(T3處理除外)處理褐化率最低，而其外植體在培養(yǎng)過(guò)程中咖啡酸和綠原酸的下降幅度最小，說(shuō)明二種酚酸被氧化程度低，外植體褐化率與咖啡酸和綠原酸氧化程度呈正相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明，咖啡酸和綠原酸是天女木蘭組培褐化底物，盡管在天女木蘭芽外植體中對(duì)香豆酸含量高于咖啡酸和綠原酸，但是在組培期間，CK處理對(duì)香豆酸含量下降幅度僅為7.4%，抗褐化劑處理(VC T3處理除外)對(duì)其含量變化影響也不大，說(shuō)明對(duì)香豆酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定不易被氧化，與外植體褐化關(guān)系不大，因此我們認(rèn)為對(duì)香豆酸不是天女木蘭褐化底物。

3.2 三種抗褐化劑抗褐化效果比較

植物中酚酸類(lèi)物質(zhì)由于具有活躍的羥基，其化學(xué)性質(zhì)非常活躍。酚酸根據(jù)結(jié)構(gòu)分為苯甲酸型和肉桂酸型兩種類(lèi)型，常見(jiàn)的苯甲酸型有沒(méi)食子酸、香草酸、原兒茶素等，咖啡酸、芥子酸、阿魏酸屬于肉桂酸型， Sroka[18]和RiceEvans[19]等人認(rèn)為酚酸的活性與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，羥基的數(shù)量和位置都會(huì)影響到酚酸活性，羥基越多越活躍，羥基數(shù)量相同時(shí)，取代位置不同活性不同，如果取代位置相同時(shí)，肉桂酸型活性強(qiáng)于苯甲酸型酚酸?？Х人岷蛯?duì)香豆酸屬于肉桂酸型酚酸，綠原酸是咖啡酸與奎寧酸的脂化物，所以它們的化學(xué)活性非常強(qiáng)易被氧化。

VC作為一種強(qiáng)抗氧化劑，因其具有較好抗褐化效果而被廣泛使用，現(xiàn)有研究資料表明，人們使用VC作為抗褐化劑的方法性研究較多，而關(guān)于VC抗褐化機(jī)理研究報(bào)道相對(duì)較少。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在組培期間，CK處理外植體中咖啡酸和綠原酸含量大幅下降，說(shuō)明二者化學(xué)性質(zhì)活躍容易被氧化。VC具有顯著預(yù)防咖啡酸和綠原酸氧化的作用，培養(yǎng)基添加VC濃度不超過(guò)500 mg·L-1時(shí)，隨著VC濃度增加抑制酚酸氧化效果增強(qiáng)，但是培養(yǎng)基中添加VC濃度超過(guò)500 mg·L-1會(huì)導(dǎo)致外植體中咖啡酸和綠原酸含量大幅下降，褐化現(xiàn)象加劇。VC抗褐化機(jī)理很復(fù)雜，它可以作為醌類(lèi)物質(zhì)還原劑，將醌類(lèi)物質(zhì)還原，同時(shí)又具有PPO抑制劑功能，螯合PPO的輔基銅離子起到抗褐化作用[20]。VC作為還原劑還原醌類(lèi)物質(zhì)時(shí)，其使用濃度非常重要，濃度低還原效果不顯著，濃度過(guò)高時(shí)氧化形成的酮化合物與氨化合物發(fā)生非酶褐變使外植體褐變加重[21]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明該觀點(diǎn)。所以，使用VC作為抗褐化劑要根據(jù)培養(yǎng)植物材料不同，選用不同濃度，因?yàn)椴煌参锊牧戏宇?lèi)物質(zhì)含量不同。

CA屬于多酚氧化酶抑制劑，經(jīng)常被用作抗褐化劑使用。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，CA對(duì)天女木蘭外植體中的咖啡酸和綠原酸氧化具有一定的預(yù)防作用，培養(yǎng)基中添加濃度CA濃度不超過(guò)300 mg·L-1時(shí)，隨著CA濃度的增加預(yù)防酚酸氧化效果越顯著。與VC相比，無(wú)論是外植體褐化率還是預(yù)防酚酸氧化，CA均不如VC效果顯著，劉均偉等對(duì)紫薯PPO活性的研究發(fā)現(xiàn)，VC對(duì)PPO活性的抑制作用強(qiáng)于CA[21]；彭思佳等對(duì)荻外植體褐化研究結(jié)果顯示，VC處理抑制外植體褐化效果好于CA處理[22]，本試驗(yàn)結(jié)果他們的研究結(jié)論基本一致。

PVP是酚類(lèi)物質(zhì)吸附劑，可以用來(lái)吸附外植體釋放的酚類(lèi)物質(zhì)，阻止酚類(lèi)物質(zhì)被氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，從而達(dá)到預(yù)防外植體褐化的目的[23]。試驗(yàn)結(jié)果表明PVP對(duì)預(yù)防咖啡酸和綠原酸氧化亦具有一定效果，隨著添加PVP濃度的增加，抑制酚酸氧化效果增強(qiáng)。在抑制酚酸氧化效果方面，三種抗褐化劑排序?yàn)閂C(T3處理除外)效果最好，其次為CA，PVP排在最后；在控制外植體褐化率方面，VC處理(T3處理除外)褐化率最低，其次是PVP處理，CA處理褐化率最高。在外植體褐化率排序與控制酚酸氧化效果排序上CA和PVP的位置略有不同，其原因可能是PVP抗褐化機(jī)理與CA不同所致，PVP屬于吸附劑，能吸附外植體由于切割釋放的酚類(lèi)物質(zhì)，以及酚類(lèi)物質(zhì)氧化形成的醌類(lèi)物質(zhì)，從而達(dá)到預(yù)防褐化的目的，而CA主要通過(guò)抑制PPO氧化酶活性角度來(lái)達(dá)到抗褐化的目的，所以在防止酚酸氧化方面強(qiáng)于PVP。

VC、PVP和CA三種抗褐化劑在預(yù)防天女木蘭外植體褐化均具有一定效果，綜合比較VC抗褐化效果最好。培養(yǎng)基中添加抗褐化劑時(shí)還應(yīng)考慮外植體細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和分化，培養(yǎng)基中添加抗褐化劑濃度應(yīng)該控制在即具有顯著抗褐化效果，又不影響外植體的生長(zhǎng)、分裂和分化，所以在使用時(shí)盡量減小使用濃度。

4 結(jié)論

本文在培養(yǎng)基中添加三種類(lèi)型抗褐化劑進(jìn)行天女木蘭芽外植體的培養(yǎng)，并定期取樣，利用HPLC定量測(cè)定芽外植體中咖啡酸、綠原酸和對(duì)香豆酸含量的動(dòng)態(tài)變化，初步確定天女木蘭褐化底物是咖啡酸和綠原酸，盡管外植體中對(duì)香豆酸含量高于咖啡酸和綠原酸，但它并不是褐化底物。通過(guò)褐化率和三種酚酸的含量變化比較得出：VC處理外植體褐化率最低，其次是PVP，CA處理褐化率最高；VC在預(yù)防酚酸氧化方面也表現(xiàn)出良好效果，但是應(yīng)注意使用濃度，使用濃度不易過(guò)高，PVP在預(yù)防酚酸氧化效果不如CA處理，但是在控制外植體褐化率方面強(qiáng)于CA處理，可能是其抗褐化機(jī)理與CA不同所致。

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(責(zé)任編輯：張 研)

Effects of Browning Inhibitors on Bud Explants Browning and Phenolic Acids Oxidation ofMagnoliasieboldiiK. Koch

GAO Hong-bing , DU Feng-guo, WANG Huan

(The Provincial Key Laboratory on Forestry and Ecological Environment, Beihua University, Jilin 132013, Jilin, China)

[Objective]To identify the types of phenolic acids that result in bud explants browning ofMagnoliasieboldiiand determine the most effective anti-browning agent at an optimum concentration. [Method] Bud explants were cultured in B5 medium for 30 days. At the beginning, three kinds of anti-browning agents were added separately to the B5 medium. The browning rates were calculated and analyzed. Then the effects of the three inhibitors on anti-browning were compared on the basis of the browning rates. In addition, the content variations of caffeic acid, chlorogenic acid, and p-coumaric acid in the bud explants were measured with HPLC using samples regularly selected during tissue culturing. [Result] The results showed that the contents of caffeic acid and chlorogenic acid decreased sharply while the content of p-coumaric acid experienced a slight decrease, proving that caffeic acid and chlorogenic acid were more likely to be oxidized than p-coumaric acid. Moreover, the effects of the three inhibitors on anti-browning were sorted in a decreasing order of VC, PVP, and CA. Although PVP was inferior to CA with respect to controlling phenolic acid oxidation, its anti-browning effect was more efficient than CA. This result was explained by their different mechanisms for anti-browning. Lastly, the optimal concentration for VC was 500 mg·L-1, and a higher concentration would result in a greater browning rate of the bud explants. Respective optimal concentrations for PVP and CA were 1 000～1 500 mg·L-1and 300 mg·L-1. [Conclusion] The browning substrates in bud explants of M. sieboldii are caffeic acid and chlorogenic acid rather than p-coumaric acid. VC, PVP, and CA have distinguishable anti-browning mechanisms and the anti-browning effects of them will decrease gradually.

Magnoliasieboldii, explant, browning inhibitor, phenolic acid oxidation

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.03.023

2016-08-31

吉林省科技廳項(xiàng)目(20140101016JC);吉林省教育廳項(xiàng)目(吉教合字2014第172號(hào))。

高紅兵(1962—)，教授，主要研究方向：植物組織培養(yǎng)與逆境生理。電話：18604498160，郵箱：gao-hongbing@163.com.

S763.7

A

1001-1498(2017)03-0525-08