邢 鵬 吳 琪 陳崢剛 夏志蘭

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樹脂純化姬松茸多酚工藝及抗氧化活性分析

邢 鵬 吳 琪 陳崢剛 夏志蘭*

（湖南農業(yè)大學園藝園林學院，湖南長沙 410128）

采用大孔吸附樹脂對姬松茸粗提物進行分離純化，以得到純度比較高的姬松茸多酚，并研究其最佳工藝。先通過靜態(tài)吸附-解析吸附實驗，確定NKA-2樹脂對其有比較好的效果，按所確定的最佳工藝條件，即料液濃度0.32 mg/mL，料液pH值2.0～3.0，原料液以4 BV/h的流速上柱吸附，上樣體積為柱體積5 BV。再用6 BV樹脂體積的80%乙醇以3 BV/h的流速解吸，在此條件下姬松茸多酚純度為22.8%。同時測定純化后樹脂對普魯士藍法和水楊酸法的活性效果。

姬松茸；多酚；樹脂；純化；抗氧化活性

姬松茸（）又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇等，是原產(chǎn)于美洲巴西、秘魯、美國的一種食藥兼用菌[1,2]。富含多糖、蛋白質、氨基酸、維生素、甾醇化合物、多酚化合物等多種營養(yǎng)成分，具有很好的提高免疫力、抗癌、抗氧化、抗病毒等能力[3～5]。

多酚主要指植物多酚（plant ployhenols），是一類廣泛存在于植物體內的復雜酚類次生代謝物，包括單寧及相關化合物，主要存在于植物的皮、根、莖和果實中，在部分真菌生物中也有發(fā)現(xiàn)[6]。植物多酚的提取與純化工藝成熟，費用不高，廣泛應用于食品、藥理、營養(yǎng)、生化、日化、植物保護等領域。植物多酚結構的特點是有很好的抗氧化和清除自由基能力。酚羥基的結構特別是鄰苯二酚或鄰苯三酚中的鄰位酚羥基，很容易被氧化成醌類結構，其對活性氧等自由基有很強的捕捉能力，能與氧化反應產(chǎn)生的脂質自由基結合，減少或阻止組織中氧化反應的進行[7]。

大孔吸附樹脂是近些年來廣泛應用于化學、醫(yī)藥和食品等領域的一種多孔立體結構，是由人工合成的有機高分子聚合物，能有效分離純化黃酮、三萜、多酚等化合物。筆者在前人的研究基礎上用對植物多酚的樹脂純化方式進行真菌的多酚分離純化，并對分離后的產(chǎn)物進行抗氧化實驗，以期探索適合于姬松茸多酚分離和純化的最佳工藝[8,9]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

姬松茸購自長沙馬王堆大市場，用粉碎機粉碎后，過60目篩，避光干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：福林-酚（FC）試劑（北京索萊寶科技有限公司），沒食子酸標準品（含量﹥98%）、硫酸亞鐵、乙醇、水楊酸、鐵氰化鉀、維生素C、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、三氯化鐵（國藥集團化學試劑有限公司，分析純），30%過氧化氫溶液（天津市恒興化學試劑制藥有限公司，分析純）。

主要儀器：FZ-102 微型植物粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司），UV-2100型紫外分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司），SK3300LH 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司），HY-4調速振蕩儀（江蘇金壇中大儀器廠），RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝實驗儀器廠），真空抽濾裝置，配有SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科技工貿有限公司），DHG-9146A型電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），真空冷凍干燥設備以及實驗室常見的玻璃儀器。

圖1 沒食子酸標準曲線

1.2 姬松茸總多酚提取

稱取5 g姬松茸粉末，用蒸餾水提取，料/液比1/20（g/mL），提取溫度100 ℃，提取時間1 h。測定在765 nm波長下的吸光度值，并計算姬松茸總多酚提取得率，以此比較提取效果[10]。

1.3 沒食子酸標準曲線的制作

配置0.5 mg/mL沒食子酸標準品溶液：準確稱量50 mg沒食子酸標準品于100 mL容量瓶中，用水溶解后，定容。取20、40、60、80、100 μL標準品溶液，在10 mL玻璃管中，定容至2 mL，再加0.5 mL菲林C試劑和5 mL Na2CO3。然后在30 ℃水浴鍋下水浴1 h，在760 nm UV紫外分光光度計下比色吸光度值，用清水做空白對照，重復2次。

所得標準曲線方程為：＝21.318＋0.015 6 （=0.998 2）。

式中：為吸光度值，為沒食子酸含量（mg）。曲線（圖1）表明，在恒定體積條件下，沒食子酸的含量0.01～0.05 mg，與吸光度值以正相關系數(shù)增長。在此范圍內，有良好的線性相關。

1.4 純化工藝研究方法

1.4.1 吸附樹脂的預處理和再生

樹脂的預處理[11]：大孔吸附樹脂先用95%乙醇充分浸泡24 h，濕法裝柱，繼續(xù)用95%乙醇在柱上流動洗脫，不時檢查流出液，直至流出液與蒸餾水混合（體積比為1︰5）不呈白色混濁為止，然后用蒸餾水洗滌至無醇味，備用。

樹脂再生：用5%的鹽酸溶液洗滌樹脂，至流出液呈無色，再用3%的NaOH溶液洗滌樹脂，最后用蒸餾水洗至中性，即可用于下一周期。

1.4.2 大孔吸附樹脂上樣原料液制備

取姬松茸干燥原料，用20倍質量水在90 ℃下提取一次，每次1 h。將提取液旋轉蒸發(fā)濃縮一定倍數(shù)，過濾，即得姬松茸原料液。

（1）樹脂的篩選。將預處理好的6種大孔吸附樹脂（ADS-17、AB-8、D4020、NKA-9、NKA-2、HPD-600）去表面水后，各精密量取1.0 g，放置于具塞磨口錐形瓶中，分別加入100.0 mL質量濃度為0.32 mg/mL的姬松茸多酚原料液，在搖床中振蕩24 h，待吸附飽和，過濾，測定濾液中多酚濃度。吸附飽和的樹脂再各用100 mL95%乙醇解吸24 h，待解吸完全后，測定解吸液中多酚濃度，按下列公式分別計算樹脂的吸附量和解吸率（樹脂吸附量以單位質量濕樹脂吸附的多酚量表示）。

吸附量（mg/g）=原料液體積×（吸附前濃度－吸附后濃度）/樹脂濕重 （1）

根據(jù)公式（1）和公式（2）計算獲得各種樹脂的吸附量和解吸率，通過比較，確定分離姬松茸多酚的最佳樹脂類型。

（2）最佳pH的確定。按1.4.2中原料液的制備方法，得到pH為5.6、多酚濃度為0.32 mg/mL的水溶液，取5份各100 mL，用鹽酸和氫氧化鈉分別調節(jié)pH至2.0、3.0、5.6、7.0，9.0，然后加入到一系列1.0 g已去表面水的NAK-2樹脂中，在搖床中振蕩吸附24 h，測定吸附后溶液中多酚含量，并計算出樹脂的吸附量，根據(jù)樹脂吸附量的大小綜合考慮，確定最佳pH。

（3）最佳料液濃度的確定。取濃度為0.32 mg/mL的原料液5份，每份100 mL，分別加蒸餾水至100、150、200、250、300 mL，將料液濃度稀釋成0.32、0.21、0.16、0.13、0.11 mg/mL，同時調節(jié)pH至3.0，用50 mL的NKA-2樹脂以流速3 BV/h進行動態(tài)實驗。檢測流出液中的多酚含量，計算樹脂對多酚的吸附量，根據(jù)吸附量的大小綜合考慮，確定最佳料液濃度。

（4）最佳上柱流速的確定。取pH=3.0、最佳多酚濃度的原料液5份，每份100 mL，分別按2、3、4、5、6 BV/h的流量通過裝柱體積為50 mL的樹脂柱，檢測流出液中的多酚含量，計算樹脂的吸附量，根據(jù)樹脂吸附量的大小綜合考慮，確定最佳上柱流速。

（5）最佳上柱體積的確定。按上述所確定的吸附條件，取pH=3.0、最佳濃度姬松茸原液以4 BV/h的流速通過裝柱體積為50 mL的NKA- 9樹脂柱，分步收集流出液。對流出液進行檢測，測定每份流出液的吸光度值，計算樹脂對多酚的吸附量，制做上樣體積下樹脂吸收多酚效果表。

（6）解吸劑的選擇。分別取250 mL最佳多酚含量料液，以4 BV/h的流速通過裝柱體積為50 mL的樹脂柱，吸附完全后，先用100 mL的去離子水，再用300 mL不同質量分數(shù)（20%，40%，60%，70%，80%）的乙醇溶液分別洗脫，分別收集各部分洗脫液，檢測洗脫液中的多酚含量，計算各種洗脫劑的洗脫率，選擇最佳解吸劑。

（7）洗脫流速的確定。取4份各250 mL的最佳多酚濃度原料液（pH 3.0），以4 BV/h的流速通過50 mL的樹脂柱，吸附后，先用100 mL的去離子水洗至流出液無色，再用300 mL的80%乙醇溶液分別以2、3、4、5 BV/h的流速進行洗脫，測定洗脫液中多酚含量，計算不同流速下的洗脫率，根據(jù)洗脫率的大小選擇最佳洗脫流速。

（8）洗脫體積的確定。按上述所確定的吸附、洗脫條件，取姬松茸原液250 mL（多酚濃度為0.32 mg/mL，pH 3.0）通過50 mL樹脂柱進行吸附。吸附后用水洗至流出液無色，再用80%乙醇洗脫，50 mL為一流分收集洗脫液。測定各洗脫液中的多酚含量，制作不同洗脫體積下的多酚洗脫效果表。

（9）樣品純度的檢測。按上述確定的工藝條件進行2次重復試驗，洗脫液濃縮后冷凍干燥，得到棕紅色產(chǎn)品，取適量樣品用水溶解，按1.3中方法檢測樣品中多酚含量，測定樣品純度。純度測定公式如下所示：樣品純度（%）=樣品中多酚含量／樣品干重×100。

1.5 抗氧化實驗

1.5.1 實驗原理

用FeSO4和H2O2通過Fen ton反應，生成的自由基OH·能與水楊酸在526 nm處產(chǎn)生強吸收的有色產(chǎn)物2,3-二羥基苯甲酸。加入有清除自由基作用的多酚，可以阻止自由基和水楊酸反應，減少有色產(chǎn)物2,3-二羥基苯甲酸的量，降低在526 nm處的吸光度值。因此，可以用此方法檢測多酚對自由基OH·的抗氧化效果[12]。

普魯士藍法。具有還原能力的樣品可將赤血鹽K3[Fe(CN)6]還原成黃血鹽K4[Fe(CN)4]3。普魯士藍在700 nm處有最大的吸收波長。在此波長下，吸光度值越大，樣品還原能力越強，抗氧化效果也越好[12]。

1.5.2 方法

（1）水楊酸法。配制不同濃度的總多酚溶液：將7.5 mmol/L FeSO4溶液、7.5 mmol/L水楊酸乙醇溶液和7.5 mmol/L H2O2溶液按1︰1︰1的比例混合，作為檢測儲備溶液備用。分別移取1 mL不同濃度姬松茸總多酚溶液原液于不同的玻璃管中，加入2 mL檢測儲備液；用去離子水代替上述樣品液，其他步驟相同。在526 nm下測定加樣品和未加樣品的吸光度值，通過計算自由基OH·清除率，獲得樣品抗氧化活性。

公式：（%）＝[1－（1－2）/0]×100。

式中，為多酚對清除自由基清除率%；0為不含樣品的多酚溶液檢測液的吸光度；1為含多酚檢測液的吸光度；2為多酚溶液的吸光度。

（2）普魯士藍法。配置1 mg/mL的維生素C溶液：取10、20、30、40、50、60、70 μL，定容1 mL，置于7個不同玻璃管中，依次加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）、1 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液，50 ℃下水浴20 min，再加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，3 000 r/min下離心10 min。取2 mL上清液，加入3 mL去離子水、0.2 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻。以去離子水做參照，700 nm下測吸光度值。制作標準曲線，用樣品代替維生素C溶液，測定吸光度值，計算對應的抗氧化活性。

所得標準曲線方程為：＝9.543 2－0.002 5 （=0.998 7）。

式中：為吸光度值；為沒食子酸含量（mg/mL）。曲線（圖2）表明，在0.01～0.07 mg/mL范圍內與吸光度值成正相關系數(shù)增長。在此范圍內，有良好的線性相關。

圖2 普魯士藍法VC標準曲線

2 結果與分析

2.1 姬松茸多酚分離純化工藝

2.1.1 分離純化姬松茸多酚的最佳樹脂

實驗選用的6種不同的樹脂都被廣泛應用于不同植物總多酚的分離純化。對姬松茸多酚的吸附及解吸結果見表1。經(jīng)綜合考慮，選擇NKA-2樹脂作為最佳樹脂。

表1 6種大孔吸附樹脂的吸附量與解吸率

2.1.2 原料液pH對吸附量的影響

原料液不同pH對樹脂吸附量的影響見表2。從表2可看出，當原料液pH值在2.0～3.0時，樹脂的吸附量比較大。根據(jù)大孔吸附樹脂吸附原理，在吸附過程中吸附介質以分子狀態(tài)被吸附，因此要達到較好的效果，必須使吸附介質保持分子狀態(tài)。一般情況下，酸性化合物在適當酸性溶液中能被充分吸附，但是酸度過強可能導致化合物結構變化。因此，原料液在上柱前應調節(jié)pH值至3.0。

表2 料液不同pH值的吸附量

2.1.3 料液濃度對吸附量的影響

不同姬松茸總多酚濃度的料液對吸附量的影響見表3。不同初始濃度的上樣液，樹脂的泄漏曲線不同，樹脂吸附量也不相同，濃縮后的原料液濃度為0.32 mg/mL，在原料多酚含量一定的條件下稀釋成不同濃度梯度。由表3可以看出，在多酚含量一定的條件下，隨著上樣體積增加，樹脂的吸附量減少。因此，用原液（料液濃度0.32 mg/mL）時吸附量較佳，效果較好。

表3 不同料液濃度的吸附量

2.1.4 上柱流速對吸附量的影響

上柱流速過快，多酚類化合物沒有被樹脂充分吸附，影響吸附量；上柱流速慢，多酚類物質可以充分吸收，但在工業(yè)化生產(chǎn)中會影響生產(chǎn)效率；故應選擇合適的上柱流速。從表4可看出，隨著上柱流速的增大，吸附率逐漸降低。因此選擇較低流速有利于吸附率的增大。綜合考慮工作效率和樹脂的吸附性能，確定上柱流速以4 BV/h為宜。

表4 不同上柱流速的吸附量

2.1.5 不同上樣體積下的樹脂吸收多酚的效果

由表5可以看出，50 mL NKA-2樹脂處理450 mL（9 BV）的原料液，此時樹脂對多酚的吸附量已經(jīng)基本穩(wěn)定，繼續(xù)上樣，雖然還能繼續(xù)吸附，但是吸附效果有限，造成樣品的很大浪費。在上樣至9 BV時飽和吸附量為92.51 mg；而在5～6 BV時，吸附效果在70%左右，則比較合適，可以減少損失率。工廠化生產(chǎn)控制在5 BV為宜。

表5 不同上樣體積下樹脂吸收多酚的量

2.1.6 不同乙醇濃度對洗脫效果的影響

不同濃度的乙醇對多酚的洗脫效果以80%乙醇洗脫的含量為最高?？紤]到乙醇濃度越高，帶出的雜質也越少，所以選用80%乙醇作為洗脫劑。水洗后直接用同倍體積的80%乙醇洗脫，洗脫率可達77.93%（表6）。

表6 不同乙醇濃度下多酚的洗脫效果

2.1.7 洗脫流速對洗脫率的影響

從表7可知，用相同體積的洗脫劑洗脫，流速越慢，洗脫率越高。但流速過慢，耗時太長，不經(jīng)濟也不利于工業(yè)化生產(chǎn)。綜合考慮，洗脫流速以3 BV/h為宜。

表7 不同洗脫流速的洗脫率

2.1.8 洗脫體積的確定

洗脫體積對解吸附的效果見表8。從表8可以看出，當洗脫液體積達到6 BV左右時，以10個BV洗脫液總含量占比為1計，前面6個BV洗脫液所含多酚的量為43.19 mg，占比為78.90%；而后面的4個BV的多酚含量為11.56 mg，占比為21.10%。表明6 BV的洗脫體積就能把大部分多酚洗脫下來，從生產(chǎn)實際考慮，如果再增加洗脫體積后續(xù)處理成本高，不利于生產(chǎn)，故選擇6 BV 80%乙醇的洗脫效果較佳。

表8 不同洗脫體積下的多酚洗脫效果

2.1.9 最佳工藝條件的確定及樣品純度檢測

按上述所確定的最佳工藝條件，即料液濃度為0.32mg/mL，料液pH值在2.0～3.0左右，原料液以4 BV/h的流速上柱吸附，上樣體積為5 BV（根據(jù)樹脂柱體積計算），再用6 BV（樹脂體積）80%乙醇以3 BV/h的流速進行解吸，重復試驗2次，洗脫液濃縮后冷凍干燥，得到棕紅色產(chǎn)品，取樣品進行經(jīng)檢測，產(chǎn)品中多酚含量為22.08%。

2.2 姬松茸多酚抗氧化活性分析

從表9可以看出，姬松茸過樹脂后的粗提取物，采用普魯士藍法和水楊酸法測定其抗氧化活性，其相對誤差最高分別為1%和0.7%，其結果重復性和穩(wěn)定性均良好。

表9 姬松茸過樹脂后粗提取物的抗氧化活性

3 結論與討論

配置濃度為27.27 mg/mL的樣品，取樣10 μL進行檢測，通過計算得出樣品中的總多酚含量為13.28 mg，占樣品含量為22.83%。而對應地取樣50 μL采用普魯士藍法和水楊酸法進行多酚的抗氧化活性測定，結果50 μL樣品中含有總多酚0.66 mg，對應維生素C濃度為0.05 mg/mL，在此含量下，自由基清除率為79.3%～79.7%。但在本次實驗中，因為姬松茸是真菌，其總多酚含量比較低，僅5‰左右，因而在提取過程中存在量少而不利于提高樹脂純化純度。本實驗是以提取和純化植物多酚的方法對真菌的多酚提取純化進行改良。在植物多酚的樹脂純化中，總多酚的含量一般都能提高到50%左右，而提取的姬松茸多酚在純化過程中只能提高到20%。這里是一個技術點，在此基礎上的改良還擁有很大的空間。

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Resin purification of polyphenols fromMurill and analysis of its antioxidant activity

Xing Peng Wu Qi Chen Zhenggang Xia Zhilan*

（College of Horticulture and Landscape Architecture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

In order to obtain the high purity pineal polyphenols, the macromolecule extract of Agaricus blazei was isolated and purified by macroporous adsorption resin, and the optimum process was studied. The effect of NKA-2 resin on the optimum conditions was determined by static adsorption-analytical adsorption experiment. The optimum conditions were as follows: 0.32 mg/mL, pH value was 2.0～3.0, The raw material liquid to 4 BV/h flow rate column adsorption, loading volume for the column volume 5 times. And then with 6 times the volume of resin 80% ethanol to 3 BV/h flow rate of desorption, under the conditions of Agaricus blazei polyphenols purity of 22.8%. At the same time, the effect of Prussian blue method and salicylic acid method on the purification of resin was determined.

; polyphenols; resin; purification; antioxidant activity

S646

A

2095-0934（2017）03-192-07

邢鵬（1992—），男，碩士在讀，E-mail：978305674@qq.com

*為通訊作者，E-mail：695218379@qq.com