武虹波 趙丕文 孫麗萍 蔡欣悅 趙笛 楊蕾 盧迪

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四物合劑干預順鉑作用卵巢顆粒細胞E2分泌水平的實驗研究

武虹波 趙丕文 孫麗萍 蔡欣悅 趙笛 楊蕾 盧迪

目的 探討四物合劑對順鉑損傷后顆粒細胞分泌E2水平的影響。 方法 取10只22～24天SD雌性大鼠卵巢顆粒細胞培養(yǎng)，另取48只22～24天SD雌鼠隨機分為生理對照組、模型組、陽性組、四物合劑大、中、小劑量組，每組8只，以生理鹽水(生理對照組與模型組，0.5 mL/天)，戊酸雌二醇片陽性組(0.4 mg/kg·d)，四物合劑大劑量組(13.5 mL/kg·d)、中劑量組(6.75 mL/kg·d)、小劑量組(3.38 mL/kg·d)分別灌胃3天后取藥理血清。顆粒細胞用含20 %藥理血清的細胞培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24小時后檢測指標。MTT法觀察藥理血清對順鉑損傷后原代顆粒細胞增殖的影響；放射免疫法觀測四物合劑藥理血清對順鉑作用顆粒細胞E2分泌的干預效果；免疫組化法檢測四物合劑藥理血清對順鉑作用顆粒細胞CYP19a1基因表達和Smad2/3激活的干預效果。 結果 MTT法檢測結果表明：與模型組相比，陽性組、四物合劑各劑量組細胞吸光度均增強，四物合劑大劑量數值最高(P<0.01)；放免法檢測結果表明，四物合劑藥理血清對E2的分泌有促進作用，且大劑量效果最明顯(P<0.05)；免疫組化法結果表明，四物合劑藥理血清可以提高CYP19a1基因、Smad2/3蛋白、Psmad2/3蛋白的表達，其中大劑量作用明顯(P<0.01)。 結論 四物合劑藥理血清對順鉑作用后的顆粒細胞E2的分泌水平有改善作用，但可能還不能起到完全修復的作用，還需進一步的實驗觀察。

卵巢顆粒細胞； 順鉑； 四物合劑； 雌二醇

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指婦女40歲之前卵巢功能衰退、閉經，伴有低雌激素和高促性腺激素狀態(tài)的一組疾病[1]，其病因復雜，具體發(fā)病機理目前仍有待探究。近年來關于癌癥化療藥物導致卵巢雌激素分泌水平的下降形成卵巢早衰的報道日益增多[2]。順鉑(cis-diamne dichloroplatinum,CDDP)是一種用來治療多種腫瘤的化療藥物，有研究表明，順鉑的使用對卵巢有直接的不良作用，可誘導卵巢顆粒細胞的凋亡，最終形成卵巢早衰[3-4]。西醫(yī)對該病多采取激素替代療法，但不良反應明顯。本實驗選用四物湯中成藥即四物合劑來作為治療藥物。人類細胞色素蛋白P450(CYP19a1)作為雌二醇(estradiol，E2)合成關鍵酶，E2的合成與分泌又與TGF-β-Smad信號轉導通路有關[5]，Smad2/3蛋白作為該信號轉導通路的關鍵信號傳導分子，故本研究擬通過使用四物合劑作用于順鉑建立起來的大鼠卵巢早衰模型，通過檢測對CYP19a1以及Smad2/3蛋白表達的影響，探討四物合劑對卵巢顆粒細胞E2分泌水平的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性22～24天SD大鼠，體質量75～80 g，清潔級，檢疫合格，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司。許可證號：SCXK(京) 2011-0004。

1.2 藥物、試劑與儀器

DMEM F-12培養(yǎng)液(批號：SH-30023，Hyclone公司)、DAB顯色試劑(批號：ZLI-9018，中杉金橋)，免疫組化試劑盒(批號：SP-9001，中杉金橋)，DMSO(批號：DB370，Amresco)。Smad2/3(批號：sc-8332，Santa)，Psmad2/3(批號：sc-11769，Santa)，CYP19a1(批號：sc-30086，Santa)，二抗：山羊抗兔IgG(批號：ZB2301)、山羊抗小鼠IgG(批號：ZB2305)由中杉金橋公司生產。

順鉑粉針劑(CDDP，濟南齊魯制藥，10 mg/支，批號：H37021358)，注射時使用生理鹽水將其配制濃度為2.5 μg/mL稀釋液；四物合劑(吉泰安藥業(yè)有限公司，100 mL/瓶)；補佳樂(拜耳醫(yī)藥有限公司生產，1 mg/片，批號：B01007102)。

CO2培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-18AIC)；超凈工作臺(北京亞泰隆實驗技術中心，022-2522) ；低溫離心機 (SIGMA，3K15)；倒置顯微鏡( NIKON，TS100)；多功能熒光酶標儀( TECAN，SAFIRE2 )。

1.3 原代大鼠卵巢顆粒細胞分離收集

取22～24天SD雌性大鼠，腹腔注射孕馬血清(PMSG，50 IU/只)，常規(guī)飼養(yǎng)48小時后，10%水合氯醛麻醉后處死，無菌條件下取出雙側卵巢并用預冷的Hank’s液清洗3次。將卵巢移入3 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液(含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)中，用1 mL一次性注射器針頭刺破卵泡，釋放顆粒細胞，加入0.25%胰酶1mL，用吸管反復吹打懸液數次，使顆粒細胞團塊分離，37℃消化10分鐘(其間每隔3分鐘振蕩或吹打1次)。加入5 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液(含20 %胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)終止胰酶消化，并靜置10分鐘，取懸液加入離心管離心(1000 rpm，10分鐘)，棄上清，加入5 mL Hank’s液，吹散細胞后再離心一次，棄上清，加入1 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液(含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)后吹打，血球計數板計數，調整細胞懸液濃度至5×105/mL。

1.4 藥理血清制備

將48只22～24天SD大鼠隨機分六組，每組8只，分組及造模方法：(1)生理對照組：生理鹽水灌胃每天0.5 mL/次；(2)模型組：同生理對照組；(3)陽性組：每天0.4 mg/kg；(3)四物合劑大劑量組(成人用藥量20倍)：每天13.5 mL/kg；(4)四物合劑中劑量組(成人用藥量10倍)：每天6.75 mL/kg；(5)四物合劑低劑量組(成人用藥量5倍)：每天3.38 mL/kg。各組連續(xù)灌胃3天，最后1次灌胃1小時后心臟取血并分離血清，在超凈臺過濾后分裝，-20℃保存。

1.5 檢測指標

1.5.1 MTT法觀察藥理血清對CDDP損傷后原代顆粒細胞增殖的影響 細胞按5×105個/孔的密度接種于96孔板內，每孔培養(yǎng)液總體積為200 μL。在蓋上做好標記，每兩列為一組，共六組，分為生理對照組、模型組、陽性組、四物合劑大劑量組、四物合劑中劑量組、四物合劑小劑量組。培養(yǎng)72小時待細胞貼壁后，除正常組外，其余吸去孔內培養(yǎng)液，加入等體積的CDDP稀釋液(濃度為2.5 μg/mL)，作用12小時后，吸去所有孔內培養(yǎng)液，加入各組對應血清(藥理血清濃度為20 %)。培養(yǎng)24小時后，每孔加MTT溶液20 μL(5 mg/mL，用PBS配制，pH=7.4)，37oC孵育4小時后，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。酶標儀波長490 nm，測吸光度值(optical density，OD)。

1.5.2 放免法測定四物合劑藥理血清對順鉑作用顆粒細胞E2分泌水平的影響 細胞按5×105個/孔的密度接種于48孔板內，每孔培養(yǎng)液總體積為400 μL。將48孔板分六組，方法同上。培養(yǎng)72小時待細胞貼壁后，除生理對照組外，其余組吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入等體積的CDDP稀釋液，作用12小時后，吸去所有孔內培養(yǎng)液，加入等量血清稀釋液(濃度為20%)以及E2分泌誘導劑雄烯二酮(0.5 μmol/L)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH，14 IU/L)。藥理血清培養(yǎng)24小時后，取每孔上清液測定E2水平。

1.5.3 免疫組化法觀察四物合劑藥理血清對順鉑作用顆粒細胞CYP19a1基因表達的影響以及對Smad2/3蛋白的激活效果 選取細胞密度約5×105個/孔的48孔板，移去培養(yǎng)基，用PBS 清洗一遍；4%的多聚甲醛室溫固定20分鐘；PBS室溫漂洗三次，3分鐘/每次；含0.5% Triton-X-100室溫通透處理20 分鐘；PBS室溫漂洗三次；3% H2O2去離子水孵育10分鐘；PBS室溫漂洗三次；滴加試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)室溫孵育15分鐘，傾去，勿洗；各蛋白抗體作為一抗，室溫孵育2～3小時；PBS室溫漂洗三次；滴加試劑B(生物素二抗工作液)，室溫或37℃孵育10～15分鐘；PBS室溫漂洗三次；滴加試劑C(辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液)，37℃孵育30分鐘，PBS沖洗3次；DAB顯色劑顯色，室溫孵育10～15分鐘，自來水洗兩次；于倒置顯微鏡下觀察拍照并使用Image pro-plus進行圖像分析，測定積分光密度值(immunity group image gradation analysis integral light density，IOD)。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MTT計數法及放免法觀察藥理血清對CDDP作用顆粒細胞吸光度、E2分泌水平的影響

MTT法結果顯示：與生理對照組相比，模型組吸光度值降低明顯(P<0.01)，證明造模成功；與模型組相比，陽性組、四物合劑各劑量組細胞吸光度均增強，效果尤以四物合劑大劑量組明顯(P<0.01)。

放免法結果顯示：模型組細胞在順鉑作用下E2分泌水平較生理對照組明顯降低(P<0.05)，在陽性藥與四物合劑各劑量組的作用下，E2分泌水平均較模型組有所增加，除陽性組效果較為明顯之外(P<0.01)，四物合劑大劑量組也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見表1。

2.2 免疫組化法檢測四物合劑藥理血清對順鉑作用顆粒細胞CYP19a1基因表達和Smad2/3蛋白激活的干預

順鉑作用后，顆粒細胞中CYP19al蛋白表達減少(P<0.01)，在陽性藥及四物合劑各劑量組作用后，表達量有所提升，其中四物合劑組中以大劑量組染色較深，蛋白表達量增加較顯著(P<0.01)， 分析IOD值后得出四物合劑各劑量組相比模型組均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，大劑量組效果最為顯著，中劑量次之。結果見表2。

表2 各組大鼠卵巢顆粒細胞CYP19a1、Smad2/3、Psmad2/3表達的IOD值

注： 與生理對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

注： A.生理對照組；B.模型組；C.陽性組；D.四物合劑大劑量組；E.四物合劑中劑量組；F.四物合劑小劑量組

圖1 各組大鼠卵巢顆粒細胞Cyp19al基因的表達(DAB染色法×400)

注： A.生理對照組；B.模型組；C.陽性組；D.四物合劑大劑量組；E.四物合劑中劑量組；F.四物合劑小劑量組

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細胞Smad2/3蛋白的表達(DAB染色法×400)

注： A.生理對照組；B.模型組；C.陽性組；D.四物合劑大劑量組；E.四物合劑中劑量組；F.四物合劑小劑量組

圖3 各組大鼠卵巢顆粒細胞Psmad2/3蛋白的表達(DAB染色法×400)

表1 各組大鼠卵巢顆粒細胞吸光度值及E2分泌水平

注： 與生理對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

Smad2/3蛋白主要表達于細胞質中，磷酸化的Smad2/3蛋白即Psmad2/3蛋白主要表達于細胞核中。如圖1～3所示，順鉑作用后的顆粒細胞，Smad2/3蛋白及Psmad2/3蛋白表達量均下降(P<0.01)，陽性藥以及四物合劑作用后各組蛋白表達量均較模型組增加，四物合劑組中以大劑量效果較為顯著(P<0.01)。

3 討論

四物合劑來源于補血調經的經典名方“四物湯”，是由熟地黃、當歸、白芍、川芎四味藥在傳統(tǒng)方劑的基礎上，結合現代技術而制成的口服液。四物湯出自唐人集著的《仙授理傷續(xù)斷秘方》，在宋代的《太平惠民和劑局方》中被列入治療“婦科諸疾”[6]，歷來都是醫(yī)家治療婦科疾病的經典要方。本研究旨在探討四物合劑對順鉑損傷后的卵巢顆粒細胞分泌E2水平的影響，明確四物合劑對卵巢早衰的治療效果，從而為四物合劑在臨床上對卵巢早衰的治療提供實驗依據。

研究表明，順鉑可引起卵巢抗氧化及氧化損傷指標的異常，從而導致卵巢功能衰退[7]，故本實驗采用順鉑作用于正常卵巢顆粒細胞造模。MTT計數法和放免法檢測結果表明，順鉑造模后的大鼠卵巢顆粒細胞增殖能力減弱，且E2分泌水平降低，但在四物合劑的作用下，細胞增殖能力以及E2分泌水平均有所改善，且在本研究中，四物合劑各組中以大劑量效果較為顯著。

E2作為女性體內最為重要的性激素之一，具有促進卵泡生長，改善卵巢功能的作用。E2的合成原料為膽固醇，在類固醇激素快速合成調節(jié)蛋白作用下轉運至線粒體，經一系列酶催化轉化為E2，此過程中CYP19a1是E2生成的限速酶[8]。實驗結果表明，順鉑作用下，影響顆粒細胞分泌E2能力的CYP19a1的表達水平下降，但在四物合劑藥理血清的干預下，CYP19a1的表達水平上升，尤以大劑量組效果最為明顯，說明四物合劑可通過影響CYP19a1基因的表達而提高顆粒細胞E2的分泌水平。

Samds家族是一個在脊椎動物、昆蟲和線蟲體內發(fā)現的轉錄因子家族，迄今為止在哺乳動物體內已發(fā)現8個成員：Smad1～8[9]。Smad蛋白將細胞表面轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號傳遞到細胞核中調控相關基因的表達[10]。Smad2和Smad3是TGF-β受體的直接底物，在TGF-β刺激下，Smad2和Smad3蛋白被磷酸化，與Smad4形成復合物，然后穿入細胞核調控靶基因的轉錄[11]。故Smad蛋白在E2的合成過程起到了至關重要的作用。本實驗結果表明，在順鉑作用下，Smad2/3的胞核分布均減少，但在四物合劑藥理血清干預后，Smad2/3蛋白的核質分布均增多，且大劑量效果最為明顯，表明四物合劑對顆粒細胞分泌E2有改善作用，且該作用經過了TGF-β和Smad2/3信號系統(tǒng)的轉導。

綜上所述，對于化療藥物順鉑所致的大鼠卵巢早衰，四物合劑確有療效，可以提升顆粒細胞E2的分泌水平，從而改善由卵巢早衰引起的低雌激素癥狀。但研究也表明，四物合劑的使用也有劑量上的要求，大、中劑量表現出一定的治療作用，而且治療作用隨著劑量降低依次減弱。此外，四物合劑對E2分泌的調節(jié)作用有可能是通過TGF-β和Smad2/3信號轉導通路實現的，但其具體的分子作用靶點還有待進一步的考察。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Experimental study ofSiwumixture intervening the secretion level of E2in ovarian granulose cell induced by cisplatin chemotherapy

WUHongbo，ZHAOPiwen，SUNLiping，etal.

SchoolofBasicMedicalSciences，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

ZhaoPiwen，E-mail：pwzhao@263.net

Objective To explore the effect ofSiwumixture on secretion level of E2in ovarian granulose cell induced by cisplatin chemotherapy. Methods Ovarian granulosa cells from ten SD female rat of 22 to 24 days were taken to culture cells. 48 healthy SD female rats from 22 to 24 days were randomly divided into 6 groups: normal group, model group, positive medicine group, and the high、medium and low dose ofSiwumixture group, 8 rats in each group. Rats were given corresponding drug by gavage for 3 days：Physiological saline (normal group and model group, 0.5 mL/d),Estradiol valerate tablets(positive medicine group, 0.4 mg/kg·d),Siwumixture high group(13.5 mL/kg·d),Siwumixture medium group(6.75 mL/kg·d),Siwumixture low group(3.38 mL/kg·d). The ovarian granulosa cells were cultured by 20% pharmacological serum for 24 hours.MTT method was used to observe the effect of pharmacological serum on proliferation of primary granulosa cells after cisplatin injury. RIA was used to observe the intervention effect of pharmacological serum on E2secretion. Mmunohistochemistry was used to detect intervention effect of serum pharmacological on CYP19a1 gene expression and activation of Smad2/3. Results MTT assay results showed that absorbance of positive medicine group andSiwumixture groups were higher than the normal group, and theSiwumixture high dose group was the highest(P<0.01), RIA method results showed thatSiwumixture had a auxo-action of E2, and high dose group was the most obvious(P<0.05). Immunohistochemical method results showed thatSiwumixture could improve the expression of CYP19a1 gene and Smad2/3 and Psmad2/3 protein, the effect of high dose group was the most obvious(P<0.01，P<0.01，P<0.01). ConclusionSiwumixture has the effect of improvement on the secretion of E2. But it may not be able to play the role of completely repair, and need for further experimental observation.

Ovarian granulose cell; Cisplatin;Siwumixture; Estradiol

國家自然科學基金項目(81673764)；北京中醫(yī)藥大學自主選題項目(2015-JYBJSMS016)

100029 北京中醫(yī)藥大學生命科學學院 [武虹波(碩士研究生)、蔡欣悅(碩士研究生)、趙笛(碩士研究生)、楊蕾(碩士研究生)、盧迪(碩士研究生)、趙丕文、孫麗萍]

武虹波( 1989- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：婦科常用中藥的作用機制。E-mail: wuhongbo0112@126.com

趙丕文( 1967- )，女，博士，教授，碩士生導師。研究方向：婦科常用中藥的作用機制。E-mail: pwzhao@263.net

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.014

2016-10-10)