陳 進，馮崇廉，聶釗源，鄧 煒，李偉杰

（廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 510150）

疏肝消脂Ⅲ方膠囊對非酒精性脂肪肝大鼠CYP2E1基因表達的影響

陳 進，馮崇廉*，聶釗源，鄧 煒，李偉杰

（廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 510150）

目的 探討疏肝消脂Ⅲ方膠囊對非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠的防治作用及對肝組織細胞色素P4502E1mRNA表達的影響。方法 用高脂乳劑灌胃建立NAFLD大鼠模型，于灌胃第6周末形成脂肪肝后，給予疏肝消脂Ⅲ方膠囊和水飛薊賓膠囊4周，在光鏡下觀察各組肝臟病理變化，并通過熒光定量(qPCR)法測定大鼠肝組織CYP2E1的mRNA的表達情況。結果 與模型組相比，各藥物組肝臟病理變化改善；疏肝消脂Ⅲ方組CYP2E1的mRNA水平較模型組降低（P ＜0.05）。結論 疏肝消脂Ⅲ方膠囊能明顯改善高脂飲食大鼠脂肪肝病理學變化，抑制NAFLD氧化應激反應，保護肝臟，作用機制可能與CYP2E1表達有關。

疏肝消脂Ⅲ方膠囊；非酒精性脂肪肝； 細胞色素P4502E1

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種遺傳—環(huán)境—代謝應激相關性疾病，其發(fā)病機制尚未完全明確，其中氧化應激對于NAFLD的發(fā)生發(fā)展起著關鍵作用。NAFLD通常與代謝紊亂（如肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和血脂異常等）密切相關，目前現(xiàn)代醫(yī)學并沒有專門針對脂肪肝的藥物，對于NAFLD的治療僅限治療相關的代謝綜合征及預防致病因素，如適量運動、合理飲食、藥物（如胰島素增敏劑、調(diào)脂藥、保肝劑）等綜合治療[1-2]。疏肝消脂Ⅲ方膠囊是馮崇廉主任近20年應用中藥治療脂肪肝的臨床經(jīng)驗方，原方疏肝消脂湯在臨床上治療脂肪肝療效顯著[3]。疏肝消脂Ⅲ方膠囊由原方疏肝消脂湯及后來的疏肝消脂Ⅰ方、疏肝消脂Ⅱ方不斷改進，經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝加工而成。周大林等[4]研究表明疏肝消脂膠囊可以顯著降低NAFLD大鼠肝組織細胞色素P450-2El（CYP2E1）。本研究通過實時熒光定量PCR（PCR）觀察疏肝消脂Ⅲ方膠囊對NAFLD大鼠肝組織的CYP2E1mRNA表達的影響，從抗氧化角度進一步深入揭示疏肝消脂Ⅲ方膠囊治療NAFLD的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 46只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0002。

1.2 試劑與設備 高脂乳劑（主要組成：200 mL豬油、100 g膽固醇、10 g丙硫氧嘧啶、10 g蛋黃粉、20 g膽酸鈉、200 m L吐溫- 80、200 m L丙二醇、300 g果糖、蒸餾水等）由廣東省醫(yī)學實驗動物中心配制；Trizol試劑盒：Invitrogen Life Technologies公司產(chǎn)品；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)：Roche公司產(chǎn)品；PCR引物由Invitrogen Biotechnology Co.LTD公司合成；臺式高速冷凍離心機Neofuge 15R：Heal Force公司產(chǎn)品；Step One Plus熒光定量PCR儀：ABI公司產(chǎn)品；MUVB-20凝膠分析系統(tǒng)：美國 Ultra-lum 公司產(chǎn)品。

1.3 藥物 疏肝消脂Ⅲ方膠囊，由牛黃田七散合四逆散組方加減而成，每粒膠囊含原生藥量約3.12 g。由廣州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院中醫(yī)科委托廣東新峰藥業(yè)協(xié)制。水飛薊賓膠囊，購于天津天士力圣特制藥有限公司，每粒含水飛薊賓35 mg。

1.4 模型的建立及分組 46只SD大鼠正常喂養(yǎng)1周后，隨機分成正常組10只和非酒精性脂肪肝組36只。非酒精性脂肪肝組36只再隨機分模型組,水飛薊賓膠囊對照組及疏肝消脂Ⅲ方膠囊觀察組,每組各12只。正常組（n=10）普通飼料喂養(yǎng)；非酒精性脂肪肝組按1 m L/100 g 體質(zhì)量灌服高脂乳劑。實驗動物自由飲水進食，分籠飼養(yǎng)于（20±2）℃、明暗各12 h的動物實驗室內(nèi)。在6周時，將高脂乳劑灌胃的3組實驗大鼠各抽取2只（共6只）處死行肝組織病理學觀察，病理切片顯示大部分肝細胞腫脹，形態(tài)排列不規(guī)則，胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂滴，表明NAFLD模型建立成功。實驗第7周起開始對實驗大鼠灌胃給藥。正常組和模型組按1 m L/100 g 體質(zhì)量生理鹽水灌胃，1次/d；治療組予疏肝消脂Ⅲ方膠囊溶液灌胃，1次/d。大鼠灌胃藥量按照1 mL/100 g 體質(zhì)量折算。

1.5 標本采集 藥物治療4周后（即實驗第10周末），觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛光澤度、活動情況，稱取體質(zhì)量，然后采取頸椎脫臼法處死大鼠，迅速剖腹，觀察肝臟外形、色澤、質(zhì)地，稱取全肝濕重并記錄，取相同部位肝組織，按常規(guī)制備肝勻漿、肝組織石蠟切片標本，肝組織于-80 ℃冰箱保存，用于qPCR檢測。

1.6 病理學檢測 取大小相等、部位相同的肝右葉組織放入4%甲醛中固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察各大鼠肝臟脂肪病變及炎癥表現(xiàn)。

1.7 Q-PCR檢測大鼠肝組織CYP2E1的mRNA表達水平 1）總RNA提取 按Trizol試劑盒常規(guī)一步法提取肝臟總RNA。2）反轉錄取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液和1 μL oligo(dT)15；用無核糖核酸酶的去離子水補足至12 μL；再放于PCR儀上70 ℃保溫5 m in后迅速置冰上冷卻；依次加入4 μL 5×buffer，2 μL10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL 反轉錄酶，用槍抽吸混勻；于PCR儀上42 ℃保溫60 m in，結束后80 ℃保溫5 min滅活反轉錄酶。3）定量PCR首先取出0.2 m L PCR管，配制反應體系：12.5 μL 2× qPCR M ix、2.0 μL 7.5 μmol/L基因引物、2.5 μL反轉錄產(chǎn)物、8.0 μL ddH 20，每個反轉錄產(chǎn)物配制3管；重復上一操作，將目標基因引物換成內(nèi)參基因引物；將上述反應體系于95 ℃預變性10 m in，然后按下述條件循環(huán)40次，變性95 ℃ 30 s、退火60 ℃ 1 m in、延伸72 ℃5 min；溶解曲線75～90 ℃，每20 s升溫1 ℃。實驗中熒光本底信號和閾值均采用儀器中設置的默認數(shù)值，由每次PCR反應結束后系統(tǒng)自動生成，每個PCR反應管內(nèi)的熒光信號強度達到設定閾值（即基線熒光信號的10倍）時所處的循環(huán)數(shù)定義為Ct值；待測基因每個模板做3個復孔，分別測得取平均值，△CT=CT目的基因-Ctcyp2e1，△△CT=△CT實驗-△CT對照，目的基因的相對表達水平用2-△△CT計算得出。引物序列見表1。

表1 大鼠CYP2E1、GAPDH引物合成基因序列

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (x±s) 表示，多組樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗，組間比較運用單因素方差分析(ANOVA)。方差齊者的兩兩比較采用LSD法，方差不齊者則采用Dunnet’s T3檢驗。P ＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝臟病理學變化 光鏡下HE染色顯示，正常對照組大鼠肝組織無脂滴和炎癥細胞浸潤，而模型組及各藥物組所有動物肝組織均出現(xiàn)不同程度的肝細胞脂肪變性，肝細胞體積變大，胞漿內(nèi)可見脂滴空泡，小葉內(nèi)可見炎癥細胞浸潤，模型組脂肪肝程度最重，各藥物組脂肪肝程度較模型組明顯減輕。

2.2 大鼠肝組織勻漿CYP2E1的mRNA的表達 見表2。

表2 大鼠肝組織勻漿CYP2E1的mRNA的表達

表2 大鼠肝組織勻漿CYP2E1的mRNA的表達

注：與正常組比較，# P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組 別劑量/(mg/kg)CYP2E1的相對值正常對照組 －1.00±0.18模型組 －2.68±0.26#水飛薊賓組44.1 1.55±0.22#△Ⅲ方膠囊組315 1.39±0.29#△

3 討論

NAFLD是一種最常見的肝臟疾病，近年我國代謝綜合征、肥胖人數(shù)逐漸增多，NAFLD發(fā)病率也明顯升高[5-6]。目前認為脂肪肝的危害不僅僅是肝硬化的發(fā)生，同時也增加心腦血管事件發(fā)生的比例[7]。因此，NAFLD越來越受到廣泛重視。對于NAFLD的確切發(fā)病機制尚不十分清楚，近年提出腸道微生態(tài)失衡可能與NASH的發(fā)生發(fā)展有關[8]，但是醫(yī)學界廣泛接受的非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制是Day等[9]提出的“二次打擊”學說。在NAFLD的“二次打擊學說”中，“首次打擊”是胰島素抵抗影響脂質(zhì)代謝，導致肝細胞內(nèi)脂肪酸儲積；“第二次打擊”則是在胰島素抵抗的基礎上，肝細胞中大量游離脂肪酸的聚集使線粒體內(nèi)β氧化反應率增加，并引起CYP2E1的水平升高，導致活性氧的增加，這一系列氧化應激的改變即為NAFLD發(fā)病的“第二次打擊”[10]。而細胞色素氧化酶P450-2El亞型(CYP2E1)是參與氧化應激和脂質(zhì)過氧化過程中的關鍵酶[11]。細胞色素P450酶是微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶，主要存在于肝細胞微粒體中，是參與藥物代謝與失活以及身體其他外來物質(zhì)代謝作用重要的酶，其中CYP2El作為細胞色素P450超家族(CYP450)重要成員之一，參與乙醇、四氯化碳、丙酮、苯等藥物、毒素、前致癌物質(zhì)代謝活化及不飽和脂肪酸氧化，在非酒精性脂肪肝的發(fā)病中起到重要作用[12-13]。CYP2E1主要分布在肝臟，約占肝臟CYP總量的7%，在一些肝外組織(如腦、肺、胃、腸、心臟等)也有高表達[14]。研究[11]表明，CYP2E1的表達與非酒精性脂肪肝的易感因素：肥胖、2型糖尿病及高脂血癥等密切相關。在非酒精性脂肪肝中CYP2E1蛋白被自然地誘導，隨著脂肪肝程度的加重，肝細胞結構和功能的損害，脂質(zhì)過氧化反應加劇，CYP2El表達明顯增高[15]。CYP2E1的高表達使線粒體、微粒體氧化反應異常增強，發(fā)生生物膜脂質(zhì)過氧化，并減弱抗氧化系統(tǒng)的保護作用，引起肝細胞損害[16]。CYP2E1與肝毒性物質(zhì)如脂多糖、花生四烯酸等有協(xié)同肝毒性作用，促進肝細胞的凋亡、壞死[17]。本實驗研究提示模型組大鼠較空白對照組存在明顯的脂肪肝變性、壞死，且CYP2E1mRNA表達量明顯增加（P＜0.05），說明CYP2E1活性增強在非酒精性脂肪肝發(fā)病中起作用。

馮崇廉教授認為：肝臟異常堆積的脂肪為黃白有形之物，類似于中醫(yī)痰凝，痰阻氣機，氣機不利；肝郁氣滯，氣滯則血瘀，痰瘀互為因果。認為肝郁氣滯、痰瘀互結乃脂肪肝病機的關鍵所在[18]。疏肝消脂Ⅲ方膠囊根據(jù)“肝主疏泄”理論，針對肝郁氣滯、痰瘀互結的病機關鍵，以疏肝解郁，祛瘀化痰為主要治則。疏肝消脂Ⅲ號方主要以四逆散合牛黃田七散加味而成，方中以四逆散加郁金、素馨花疏肝行氣解郁，丹參、山楂活血祛瘀消脂；澤瀉、萆薢利濕去濁；溪黃草利濕退黃；荷葉升清降濁；白花蛇舌草清熱涼肝解毒，而牛黃、三七對降解肝內(nèi)血脂堆積有良好療效；諸藥合伍共奏疏肝利氣，清脂降脂，降解肝內(nèi)脂肪堆積之功。從本實驗的結果筆者觀察到，與模型組相比，疏肝消脂Ⅲ方膠囊能夠明顯改善脂肪肝大鼠肝臟病理表現(xiàn)，且能抑制cyp2e1基因的表達；與水飛薊賓膠囊藥物組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。根據(jù)本次實驗結果可以推斷，以疏肝解郁，祛瘀化痰為主要治則能夠切中非酒精性脂肪肝的病機關鍵，疏肝消脂Ⅲ方膠囊對NAFLD大鼠具有防治作用，其療效與水飛薊賓膠囊相當，其作用機制之一是抑制肝細胞中CYP2E1基因的表達,從而減輕氧應激和脂質(zhì)過氧化反應。本研究為臨床預防和治療NAFLD 提供了新的思路。

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Effect ofS hugan Xiaozhi decoction IIIcapsule on the CYP2E1 in the rat w ith non-alcoholic fatty liver disease

CHEN Jin, FENG Chonglian*, NIE Zhaoyuan, DENG Wei, LI Weijie
(The Third A ffi liated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, China)

Objective To study the therapeutic effects of Shugan Xiaozhi decoction III capsule on the expression of hepatic cytochrome P4502E1mRNA in the rats w ith non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).Methods The animal model of non-alcoholic fatty liver disease w ith high fat emulsion, and rats were treated w ith Shugan Xiaozhi decoction III capsule or Silibinin capsules for four weeks after fatty liver in rats was developed by irrigation at 6th week. To observe the pathological changes in the liver of each group under the light m icroscope, and the rat liver CYP2E1 mRNA expression were determ ined by fl uorescence quantitative PCR (qPCR) method.Results Comparing w ithmodel group, the levels of the pathological changes in the liver were decreased in all medicine groups. The mRNA expressions of CYP2E1 in Shugan Xiaozhi decoction III capsule group were lower than those in model group (P<0.05). Conclusion Shugan Xiaozhi Decoction III capsule can signifi cantly improve pathology, oxidative stress reaction and protect the liver, which may related w ith the expression of CYP2E1 in NAFLD.

Shugan Xiaozhi decoction III capsule; nonalcoholic fatty liver; cytochrome P4502E1

R285.5

A

2095-6258（2017）03-0351-04

2016-05-18）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.003

廣州市“十二五”重點中醫(yī)肝病?？疲ㄋ胄l(wèi)中[2013] 6號）；廣州市中醫(yī)藥科技項目（穗衛(wèi)中[2014] 3號；20142A011005）。

陳 進（1990 -），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學方向研究。

*通信作者：馮崇廉，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，電話-18928916692, 電子信箱-fengchonlian@126.com