李志強(qiáng)，劉穎，林風(fēng)，吳麗云

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州，350007)

福建古田紅曲生產(chǎn)用紅曲霉菌主要種類的鑒別

李志強(qiáng)，劉穎，林風(fēng)*，吳麗云*

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州，350007)

以購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)的5株紅曲霉菌為對(duì)照，對(duì)福建省微生物研究所紅曲霉菌資源庫(kù)中收藏自福建省古田縣的60株紅曲霉菌(Monascussp.)進(jìn)行分類鑒定研究。首先根據(jù)不同菌株在麥芽汁瓊脂(Wa)、察氏酵母提取物瓊脂(CYA)和甘油硝酸鹽瓊脂(G25N)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步分類，進(jìn)而基于核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA internal transcribed spacer，rDNA ITS)、核糖體大亞基(28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene，LSU)和核糖體小亞基(18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene, SSU)的基因片段的測(cè)序結(jié)果，在GenBank中通過(guò)BLAST進(jìn)行分子生物學(xué)方面的鑒定研究，并用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過(guò)形態(tài)特征及3個(gè)基因序列的比對(duì)，認(rèn)為所選取的60株古田紅曲霉菌分別歸屬紅色紅曲霉菌(M.ruber)、叢毛紅曲霉菌(M.pilosus)或紫色紅曲霉菌(M.purpureus)3個(gè)種。

紅曲霉菌；ITS；LSU；SSU；鑒定

紅曲霉菌(Monascussp.)為絲狀真菌，可用于生產(chǎn)安全的天然色素和食品添加劑[1]。紅曲霉菌最有名的產(chǎn)品當(dāng)屬紅曲(紅曲霉菌發(fā)酵過(guò)的大米)，在東亞和東南亞國(guó)家被廣泛用作食品著色劑、魚肉防腐劑、醋酒發(fā)酵劑以及心血管病治療藥[1]。近20多年的研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉菌在代謝中可產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括色素、莫納可林、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、多不飽和脂肪酸、黃酮等多個(gè)種類的生物活性物質(zhì)，具有降血脂、降血壓、降血糖、抑菌、抗癌和提高免疫力等多種功效[2-3]?，F(xiàn)階段市售的血脂康和脂必妥中的主要成份即來(lái)源于紅曲。紅曲的產(chǎn)地主要分布在我國(guó)福建、浙江、廣東、臺(tái)灣等地，其中福建的古田紅曲最為著名[4]。

我國(guó)對(duì)制作紅曲所用紅曲霉菌的研究于1960年代開始。經(jīng)過(guò)10多年的研究，中國(guó)科學(xué)院和福建省的相關(guān)學(xué)者應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物分類方法，從紅曲產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)并鑒定了9個(gè)不同的紅曲霉菌種類，并從以古田紅曲為主來(lái)源的150多個(gè)生產(chǎn)菌株中選出11株[分別歸屬紅曲紅曲霉菌(Monascusanka)和變紅紅曲霉菌(Monascusserorubescens)]，推向全國(guó)用于色素和黃酒的生產(chǎn)[5]。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，古田紅曲生產(chǎn)工藝不斷得以改進(jìn)、生產(chǎn)菌種性狀不斷得以改良、產(chǎn)品類型和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不斷得以提升，但生產(chǎn)中使用的紅曲霉菌的主要種類是否發(fā)生變化，至今未見相關(guān)的研究報(bào)道。

由于傳統(tǒng)分類方法的不足，致使紅曲霉菌屬種間的分類和命名尚有交叉、存在爭(zhēng)議，在一定程度上制約了紅曲霉菌的深入研究及更好應(yīng)用。DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)作為一種新興的物種鑒定方法，以其靈敏、精確、方便和客觀的優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)植物和真菌中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[6]。SCHOCH等提出核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA internal transcribed spacer，rDNA ITS)可作為真菌界通用的DNA條形碼，以利于真菌分類學(xué)和生物多樣性的研究[7]。如今，大部分實(shí)驗(yàn)室都采用ITS作為分子標(biāo)記進(jìn)行紅曲霉菌的分類鑒定，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者也已將ITS序列分析用于紅曲霉菌的分類鑒定[8-11]。rDNA ITS一般包含兩個(gè)部分：ITS1和ITS2，5.8S RNA 基因也被包括在ITS之內(nèi)[6]。但I(xiàn)TS序列較短(真菌的ITS長(zhǎng)度一般為650-750 bp)[6]，有時(shí)不同種紅曲霉菌的ITS序列完全一樣[8]，說(shuō)明在紅曲霉菌的分子鑒定中僅僅采用ITS還不能完全滿足需要，還需聯(lián)合其他的分子標(biāo)記。核糖體大亞基(28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene，LSU)和核糖體小亞基(18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene, SSU)也常被用于真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析和分子鑒定，并且LSU在一些真菌類群中具有良好的種間區(qū)分能力[7]。

本研究從福建省微生物研究所的紅曲霉菌種資源庫(kù)中選取收藏自福建省古田縣的60株紅曲生產(chǎn)用紅曲霉菌，在傳統(tǒng)的形態(tài)分類基礎(chǔ)上，輔以ITS、LSU和SSU基因作為分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行菌種鑒定，以期闡明現(xiàn)有古田紅曲產(chǎn)品中紅曲霉菌的主要種類。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本所紅曲霉菌資源庫(kù)中古田紅曲生產(chǎn)用菌株60株(其中40株為原古田紅曲廠的生產(chǎn)菌株，20株分離自古田的色曲和酒曲產(chǎn)品)，給予編號(hào)M1-M60。前期的研究表明，這些菌株分別具有生產(chǎn)色曲、酒曲和功能紅曲的優(yōu)越特性。購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)的5株紅曲霉菌，即CICC5018(M.ruber)、CICC5032(M.purpureus)、CICC5034(M.anka)、CICC5044(M.purpureus)和CICC5045(M.pilosus)(分別給予編號(hào)M61、M62、M63、M64和M65)，作為本研究對(duì)照菌株。

1.2 固體培養(yǎng)基配制及菌落形態(tài)觀察

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(Wa)：麥芽汁(15°Bx)1 000 mL，瓊脂15g。1.0×105kPa 滅菌30 min。

察氏酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基(CYA)：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KC1 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，酵母提取物5.0 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL。1.0×105kPa 滅菌30 min。

甘油硝酸鹽瓊脂(G25N)：CYA加25% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘油。1.0×105kPa 滅菌30 min。

采用點(diǎn)接種法接種斜面保藏的菌種于Wa、CYA和G25N培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)7 d后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，包括菌落大小、顏色等[10]。

1.3 菌株的液體培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基配制(g/L)：葡萄糖50、蛋白胨15、KH2PO41、NaNO33、酵母粉10、MgSO40.5。加熱完全溶化后進(jìn)行分裝，1.0×105kPa 滅菌30 min，冷卻備用。

用扁鏟從PDA培養(yǎng)基上刮取黃豆大小的紅曲霉菌，接入裝有新配置液體培養(yǎng)基的三角瓶，置于28℃恒溫下培養(yǎng)72h左右，收集菌絲體用于DNA提取。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取流程按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

ITS采用引物ITS5 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS4 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)進(jìn)行擴(kuò)增；LSU采用LR0R(5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’)和LR5(5’-TCCTGAGGGAAACTTCG-3’) 進(jìn)行擴(kuò)增；SSU采用NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS4(5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’)進(jìn)行擴(kuò)增[7]。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

基因擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系： 10×PCR反應(yīng)緩沖液 5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 3 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.75 μL，10 mmol/L的正向引物和反向引物各1 μL，Taq聚合酶(2U/μL) 0.5μL，DNA模板2 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52℃(LSU退火溫度為48 ℃)退火30 s，72 ℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min，10 ℃保持。每次反應(yīng)均設(shè)立不含DNA模板的空白對(duì)照組。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后, 用OMEGA凝膠回收試劑盒(OMEGA Bio-Tek)回收目的片段。純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 紅曲霉菌的分子生物學(xué)鑒定

測(cè)序后的基因序列用BioEdit進(jìn)行拼接，獲得所擴(kuò)增基因的完整序列；采用Clustal X[12]軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行排序，參數(shù)值為默認(rèn)值，并對(duì)排序結(jié)果進(jìn)行手工校正，將5’和3’端的非對(duì)位排列區(qū)去除。采用ITS序列數(shù)據(jù)(因?yàn)?5株紅曲霉菌之間的ITS序列差異大于LSU和SSU，見結(jié)果與分析)，用MEGA6軟件[13]基于Kimura 雙參數(shù)模型的鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析進(jìn)化關(guān)系，自展1000次估計(jì)各分支的支持率。從GenBank下載的紅曲霉菌屬物種的ITS序列為AY498573、AY498574、AY498581、AY498583- AY498586、JF922045和JF922046；以曲霉屬的黃曲霉(Aspergillusflavus，DQ683124)、寄生曲霉(A.parasiticus，EF661568)和煙曲霉(A.fumigatus，HQ026746)的3個(gè)物種作為外類群。

將所測(cè)得的ITS、LSU和SSU序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。用MEGA6[13]軟件計(jì)算GC含量、基于Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落的形態(tài)特征

紅曲霉菌在Wa、CYA和G25N培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征在紅曲霉菌的分類和鑒定中具有重要的參考價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)65株紅曲霉菌在相同的培養(yǎng)條件下其菌落形態(tài)特征存在差異，在Wa培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征最穩(wěn)定[10,14]。因此，以Wa培養(yǎng)基上65株紅曲霉菌的菌落形態(tài)特征作為主要分類鑒定依據(jù)，以在另2種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征作為輔助鑒定依據(jù)。形態(tài)鑒定結(jié)果見表1。

表1 65株紅曲霉菌基于菌落形態(tài)特征的鑒定結(jié)果

根據(jù)形態(tài)特征，初步可將61株紅曲霉菌分別歸于紅色紅曲霉菌、紫色紅曲霉菌或叢毛紅曲霉菌，其中9株為紅色紅曲霉菌，38株為紫色紅曲霉菌，14株為叢毛紅曲霉菌。其余4株依據(jù)形態(tài)特征無(wú)法鑒定到種，需輔以分子生物學(xué)方法加以鑒定。

2.2 紅曲霉菌的分子生物學(xué)鑒定

本研究測(cè)定了65株紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU基因序列，經(jīng)過(guò)排序后的長(zhǎng)度分別為581 bp、879 bp和1021 bp，可變位點(diǎn)數(shù)分別為2個(gè)、1個(gè)和1個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)分別為2個(gè)、1個(gè)和1個(gè)。利用本研究獲得的ITS基因序列和從GenBank下載的紅曲霉菌屬和曲霉屬物種的ITS序列構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。基于Kimura 雙參數(shù)模型進(jìn)行1 000次自展檢驗(yàn)構(gòu)建的50% 多數(shù)一致性NJ樹見圖1。從圖1可以看出，M2、M4、M5、M12-M31、M34-M49、M62-M64與紫色紅曲霉菌聚為一支，支持率為81%；M1、M3、M6-M11、M32、M33、M50-M61、M65與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌聚為一支，支持率為86%。

圖1 利用ITS序列基于Kimura 雙參數(shù)模型構(gòu)建的50%多數(shù)一致性NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 50% majority-rule consensus tree resulted from analysis of the ITS sequence data using the Kimura two-parameter model

進(jìn)一步的序列分析表明，M1、M3、M6- M11、M32、M33、M50-M61、M65的ITS、LSU和SSU基因序列分別相同(組1)，而本研究中其余42株紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU基因序列分別相同(組2)。BLAST結(jié)果顯示，組1菌株的ITS與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的ITS同一性為100%， LSU與紅色紅曲霉菌的LSU同一性為100%，SSU與叢毛紅曲霉菌和煙色紅曲霉菌(M.fuliginosus)的SSU同一性為100%(表2)。由于煙色紅曲霉菌在Wa培養(yǎng)基上7天菌落直徑為65 mm[14]；而組1紅曲霉菌株在Wa培養(yǎng)基上的菌落直徑為40～45 mm，因此組1所包含的菌株不應(yīng)為煙色紅曲霉菌，而應(yīng)為紅色紅曲霉菌或叢毛紅曲霉菌。組2菌株的ITS、LSU及SSU分別與紫色紅曲霉菌的ITS、LSU及SSU的同一性均為100%(表2)。

65株紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU序列的平均遺傳距離分別為0.0017、0.0005和0.0004。據(jù)形態(tài)特征鑒定為紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU的遺傳距離均為0。組1紅曲霉菌和組2紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU的遺傳距離分別為0.0037、0.0011和0.0010。

綜上結(jié)果表明：(1)本所保存的M1、M6、M7、M8、M9、M10、M50、M58為紅色紅曲霉菌，M2、M4、M5、M15- M31、M34-M38、M40-M49為紫色紅曲霉菌，M3、M11、M32、M33、M51、M52、M53-M56、M57、M59為叢毛紅曲霉菌。以上56株紅曲霉菌形態(tài)鑒定結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致。(2)結(jié)合基因序列數(shù)據(jù)后，通過(guò)形態(tài)數(shù)據(jù)無(wú)法鑒定到種的4株紅曲霉菌(M12-M14、M39)均被鑒定為紫色紅曲霉菌。(3)從CICC購(gòu)買的5株紅曲霉菌中，4株(M61、M62、M64和M65)的鑒定結(jié)果與原分類吻合，只是原歸類紅色紅曲霉菌的M63的形態(tài)學(xué)特征和3個(gè)基因序列的信息與紫色紅曲霉菌的一致。

本研究用的60株古田紅曲是當(dāng)今生產(chǎn)廣泛使用的紅曲霉菌，經(jīng)鑒定，分別為紅色紅曲霉菌、紫色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌。該結(jié)果與“工業(yè)化應(yīng)用的紅曲菌株多為紅色紅曲霉菌、叢毛紅曲霉菌和紫色紅曲霉菌”[2]實(shí)際情況相符。

3 討論

紅曲霉菌屬中種的分類鑒定至今國(guó)際上仍未能形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)某些獨(dú)立的種，仍有異議[14-15,20]；但現(xiàn)階段，部分研究者認(rèn)為紅曲霉菌屬包含9種紅曲霉菌[16]。目前紅曲霉菌的鑒定主要依賴傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法[14]，并輔以生理生化的鑒定方法[10,17-18]。傳統(tǒng)的形態(tài)和生理生化方法鑒定紅曲霉菌是一種重要的方法，但耗時(shí)耗力；由于菌落顏色、直徑和形狀易受培養(yǎng)條件的影響，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。因此紅曲霉菌的鑒定需引入其他方法進(jìn)行菌種鑒定。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)作為一新興的物種鑒定方法在紅曲霉菌中也逐漸得到應(yīng)用。郭芳和李鐘慶對(duì)白色紅曲霉菌、火紅色紅曲霉菌、煙灰色紅曲霉菌和橙色紅曲霉菌ITS序列進(jìn)行了研究，測(cè)序結(jié)果顯示，橙色紅曲霉菌與火紅色紅曲霉菌相同，而白色紅曲霉菌與煙灰色紅曲霉菌相同，這兩組序列僅有2個(gè)堿基不同[8]。Lv 等從不同的紅曲酒發(fā)酵劑中分離出5株紅曲霉菌，ITS序列長(zhǎng)度均為581 bp，這5株紅曲霉菌與紫色紅曲霉菌的ITS序列同一性均為100%[9]。楊成龍等以不同來(lái)源的41個(gè)紅曲霉菌為材料，結(jié)合ITS序列分析、形態(tài)特征及生理生化特征，最終將41株紅曲霉菌鑒定為紫色紅曲霉菌、叢毛紅曲霉菌、橙色紅曲霉菌、紅色紅曲霉菌、煙灰色紅曲霉菌和白色紅曲霉菌六大類[10]。劉穎等分離出一株功能紅曲霉菌菌株NW3-2，其ITS序列與叢毛紅曲霉菌、發(fā)白紅曲霉菌、紅色紅曲霉菌都只相差1個(gè)堿基，與紫色紅曲霉菌和橙色紅曲霉菌相差2個(gè)堿基[11]。Park等首先通過(guò)紅曲霉菌LSU的D1/D2序列比較闡述了紅曲霉菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[19]。雖然以上研究對(duì)不同種的紅曲霉菌進(jìn)行了一定程度的區(qū)分，但單獨(dú)靠一種手段很難將一些特殊的紅曲霉菌準(zhǔn)確鑒定到具體的種，因此需綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定手段，相互驗(yàn)證，以獲得更加可靠的分析結(jié)果。本研究中就有4株僅依據(jù)形態(tài)特征無(wú)法鑒定到種的菌株，結(jié)合基因序列數(shù)據(jù)后鑒定到種。

本研究表明紫色紅曲霉菌(CICC5032和CICC5044)和紅色紅曲霉菌(CICC5034) 的形態(tài)特征非常接近，在所選的3個(gè)分子標(biāo)記上均沒(méi)有差異；Park和Jong的研究也表明這兩種紅曲霉菌在LSU的D1/D2區(qū)域完全相同[19]，這兩種紅曲霉菌的形態(tài)特征也非常相似，因此我們支持Hawksworth和Pitt的觀點(diǎn)：M.anka是M.purpureus的同種異名[20]。此外，Hawksworth和Pitt觀點(diǎn)，以及Park和Jong的研究結(jié)果，都認(rèn)為M.serorubescens與M.pilosus是同種異名[19-20]。因此，本研究鑒定出的現(xiàn)今古田紅曲生產(chǎn)用的主要紅曲霉菌種類與中國(guó)科學(xué)院1970年代推廣的11株紅曲霉菌主要種類(M.anka和M.serorubescens)大體相符，只是現(xiàn)在用的紅曲霉菌中紅色紅曲霉菌(M.ruber)的比例明顯提高。

表2 65株紅曲霉菌株ITS、LSU和SSU基因序列的GC含量及BLAST結(jié)果

國(guó)外學(xué)者的研究表明紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的LSU的D1/D2區(qū)域完全相同[19]，ITS和β-tubulin的序列也完全相同[15]。本研究中經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌菌株的ITS、LSU和SSU也完全相同。由于紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌在形態(tài)特征上具有較明顯的差異[19-20]，因此大部分學(xué)者認(rèn)為M.ruber和M.pilosus為兩個(gè)不同的種。由于這兩個(gè)種在ITS、LSU、SSU和β-tubulin均沒(méi)有表現(xiàn)出差異，說(shuō)明這兩個(gè)種的親緣關(guān)系非常近，要區(qū)分它們，還需借助其他的分子標(biāo)記才行。本研究在紫色紅曲霉菌與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的鑒別中，還參考了這些菌株的β-tubulin基因的分析結(jié)果(具體數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。

ITS是在真菌的分子鑒定中應(yīng)用最廣泛的一個(gè)分子標(biāo)記，2012年時(shí)GenBank約有172000條真菌的ITS序列，其中56%的ITS序列具有拉丁名[7]。本研究中紫色紅曲霉菌與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的遺傳距離為0.0037，65條ITS序列的平均遺傳距離為0.0017，表明這些菌株的親緣關(guān)系很近。在楊成龍等人的研究中，41株紅曲霉菌ITS序列間的平均遺傳距離為0.0052[10]，也是很小的。紫色紅曲霉菌與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的ITS可變位點(diǎn)有2個(gè)：1個(gè)可變位點(diǎn)位于ITS1，另一個(gè)可變位點(diǎn)位于ITS2。ITS1和ITS2均為非編碼區(qū)域，中度保守，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間具有差異，這也與本研究的結(jié)果有較好的一致性。而本研究采用的LSU和SSU，雖然獲得的序列長(zhǎng)度比ITS長(zhǎng)，但變異位點(diǎn)數(shù)目均只有1個(gè)，少于ITS的2個(gè)。這或許與LSU和SSU在蛋白質(zhì)合成中具有重要的功能有關(guān)，其基因序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守。

本研究涉及的60株紅曲霉菌可謂是福建省古田縣當(dāng)今紅曲生產(chǎn)中應(yīng)用的主要紅曲霉菌株，具有廣泛的代表性。古田紅曲產(chǎn)品中是否還含有紅曲霉菌的其他種，我們將繼續(xù)收集樣品進(jìn)行深入、全面的研究。

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Identification of majorMonascussp. involved in industrial production of Gutian Hongqu

LI Zhi-qiang, LIU Ying, LIN Feng*, WU Li-yun*

(Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products, Fujian Institute of Microbiology, Fuzhou 350007，China)

To characterize and classify major industrial strains ofMonascussp. originated from Gutian Hongqu, we compared 60 strains selected from our institute’s biobank with 5 strains obtained from China Center of Industrial Culture Collection (CICC). The first classification criterion was based upon their colonial morphological characteristics on Wa，CYA and G25N media. Further characterization was performed by comparing the sequences of rDNA internal transcribed spacer (ITS), 28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene (LSU), and 18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene (SSU) of the strains with available sequences in GenBank by BLAST. Neighbor-Joining (NJ) tree was constructed according to the ITS sequences. Based upon the morphological characteristics and the nucleotide sequences comparison, the 60Monascussp. strains were classified asM.ruber,M.pilosusorM.purpureus.

Monascus; rDNA internal transcribed spacer (ITS); 28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene (LSU); 18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene (SSU); identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705011

博士，助理研究員(林風(fēng)副研究員和吳麗云教授級(jí)高級(jí)工程師為通訊作者，E-mail：life8810@aliyun.com；lywu66717@163.com)。

福建省公益類科研院所專項(xiàng)(2015R1009-4)；福建省財(cái)政廳省直教育科研專項(xiàng)(閩財(cái)指[2015]1297號(hào))；福建省公益類科研院所專項(xiàng)(2014R1009-6)；福州市倉(cāng)山區(qū)科技創(chuàng)新公共服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(2015K03)；福州市倉(cāng)山區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015S05)

2016-10-24，改回日期：2017-02-13