張小燕 周齊洋 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （南京 210012）

彩色羧基熒光微球的制備

張小燕 周齊洋 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （南京 210012）

采用活性溶脹種子無(wú)皂乳液聚合法制備了表面修飾有羧基的彩色且在特定激發(fā)下釋放熒光的聚苯乙烯微球。采用乳液聚合首先制備尺寸均一的苯乙烯納米小球作為可溶脹活性種子，采用丙烯?；娜玖戏肿幼鳛楣簿蹎误w，從而制備得到有色苯乙烯微球。所得到的有色微球進(jìn)一步作為種子，通過(guò)溶脹法負(fù)載稀土配合物進(jìn)行熒光標(biāo)記，并再次通過(guò)乳液聚合使其包裹在微球內(nèi)。為了便于生物分子偶聯(lián)，在聚合過(guò)程中引入甲基丙烯酸作為功能化共聚單體，從而使所得微球表面被羧基功能化。

標(biāo)記 無(wú)皂乳液聚合 彩色 熒光 羧基化

聚合物微球因其形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、粒徑分布窄、比表面積大、表面吸附性強(qiáng)等特點(diǎn)在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，如細(xì)胞表面抗原檢測(cè)，血流分析，吞噬功能檢測(cè)，凝集試驗(yàn)為代表的診斷檢測(cè)，藥物篩選等[1-3]。聚合物微球本身為白色，對(duì)比度不強(qiáng)，不易被檢測(cè)，但對(duì)微球進(jìn)行染料或熒光標(biāo)記，成為帶有色彩或熒光信號(hào)的微球時(shí)，易于檢測(cè)。尤其是對(duì)基于聚苯乙烯微球的膠乳凝集試驗(yàn)，有色微球更易于觀察，從而大大提高檢測(cè)的靈敏度[4]。通過(guò)控制有色染料或熒光物質(zhì)的量，可制備出彩色或熒光強(qiáng)度編碼的微球，這樣的信號(hào)編碼微球?yàn)榭乖中?、藥物篩選等高通量檢測(cè)提供了一種高效便捷的手段[5-6]。例如，聶書(shū)明教授課題[7]組用兩種不同顏色的量子點(diǎn)摻雜在樹(shù)脂微球中，通過(guò)控制每種顏色量子點(diǎn)的用量制備出30種不同比例的熒光微球，在不同的微球表面修飾特定的抗體/抗原，就可以通過(guò)混合微球?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的高通量篩選。目前大多選用有機(jī)熒光染料分子，通過(guò)物理吸附、包覆，化學(xué)嫁接到微球表面或者以熒光染料分子為共聚單體，以共聚的方式固定到微球，制得熒光編碼微球[8-10]。但是傳統(tǒng)的有機(jī)熒光分子由于熒光發(fā)射峰寬而不對(duì)稱，不同熒光分子之間易因發(fā)射峰重疊而造成干擾，在一定程度上限制了熒光編碼微球的應(yīng)用。部分稀土元素，因其熒光量子產(chǎn)率高、Stokes位移大、光穩(wěn)定性好、發(fā)射峰窄、熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物成像、生物分子檢測(cè)等研究領(lǐng)域[11-13]。另一方面，為了進(jìn)一步豐富微球的可編碼范圍，同時(shí)減少因摻雜多種稀土配合物而造成各熒光信號(hào)減弱的影響，熒光與可見(jiàn)色彩搭配組合可提供一種新的思路。

在此，我們分別以蘇丹紅Ⅰ和Eu為色彩染料和熒光標(biāo)記物，用以驗(yàn)證制備這種雙重標(biāo)記的聚苯乙烯微球的方法。蘇丹紅Ⅰ在溶液中呈橙黃色，而Eu在360nm紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。通過(guò)兩次溶脹種子無(wú)皂乳液聚合，制備出顯橙黃色且在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光的聚苯乙烯微球。我們相信通過(guò)控制不同標(biāo)記物的量，將可獲得容量巨大的編碼微球庫(kù)。

1.材料與方法

1.1 一般資料

苯乙烯、二乙烯基苯、購(gòu)自Acros公司，堿洗除阻聚劑后減壓蒸餾；菲-9-甲酸甲酯、9-乙酰菲、過(guò)硫酸銨、蘇丹紅Ⅰ、丙烯酰氯，領(lǐng)苯二甲酸正丁酯（DBP）、均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；六水合三氯化銪（EuCl3·6H2O），購(gòu)于魚(yú)臺(tái)縣清達(dá)精細(xì)化工廠；氨基鈉、三氯甲烷、四氫呋喃（THF），鄰菲羅啉（phen）、硅膠層析柱、苯、己烷，均購(gòu)于阿拉丁公司；鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基磺酸鈉（SDS），購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；以上材料均為分析純。日立S4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡；上海棱光技術(shù)有限公司970 CRT熒光分光光度計(jì)；上海讓奇T-6紫外吸收分光光度計(jì)，英國(guó)馬爾文Zetasizer Nano ZSP納米粒度電位儀。

1.2 方法

1.2.1 聚苯乙烯種子微球的制備。通過(guò)無(wú)皂乳液聚合法制備聚苯乙烯微球：在帶有冷凝管、機(jī)械攪拌器的500mL三口瓶中加入200mL水和10mL精制苯乙烯，通入氮?dú)饧訜釘嚢?；水浴升溫?5?C時(shí)，加入引發(fā)劑過(guò)硫酸銨（APS）（100mg過(guò)硫酸銨溶于5mL純水中），繼續(xù)攪拌反應(yīng)20h，得到均一的白色乳液即為聚苯乙烯微球（PSt）。產(chǎn)物離心收集，超純水水清洗6次，最后超聲重懸水中，采用差重法測(cè)定固含量。

1.2.2 彩色聚苯乙烯微球的制備?？删酆喜噬玖蠁误w丙烯?；K丹紅Ⅰ（Acrylated Sudan，AS）根據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法制得。根據(jù)文獻(xiàn)[4,14,15]報(bào)道的方法，采用活性溶脹種子聚合法制備橙黃色聚苯乙烯微球。DBP與0.25%的SDS水溶液混合，超聲至均勻乳液，將聚苯乙烯種子微球置于DBP乳液中在30?C水浴中攪拌溶脹24h。然后把含有苯乙烯（St）、二乙烯基苯（DVB）、可聚合染料單體AS的乳液加到種子懸浮液中，攪拌溶脹24h。混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌升溫至75?C，溫度穩(wěn)定后，加入引發(fā)劑APS，聚合24h，產(chǎn)物通過(guò)離心收集并用乙醇和水洗4次。

1.2.3 羧基熒光微球的制備。稀土Eu配合物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]制得。在濃度為20mg/mL的PSt乳液中加入SDS溶液，使其終濃度為0.25%wt。稱取60mg Eu配合物，溶于1mL苯乙烯中，并加入至50mL PSt懸浮液，超聲乳化后，避光機(jī)械攪拌48h，通入N2，升溫至75?C，加入300mg過(guò)硫酸銨進(jìn)行聚合反應(yīng)。反應(yīng)2h后，補(bǔ)加1mL St和0.3mL甲基丙烯酸（MAA），繼續(xù)反應(yīng)6h。結(jié)束反應(yīng)后離心收集產(chǎn)物，洗滌6次，即為羧基熒光微球。樣品進(jìn)行噴金處理，通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行觀察，微球表面電荷通過(guò)zeta電位進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)時(shí)，取微球懸浮于水中并充分稀釋。每個(gè)樣品測(cè)三次，取平均值。

1.2.4 羧基熒光膠乳表面羧基含量測(cè)定。在聚合過(guò)程中引入甲基丙烯酸，微球表面被羧基功能化，使微球能與生物分子偶聯(lián)。羧基的含量用電導(dǎo)率法測(cè)得[17]：取一定量聚苯乙烯微球懸浮液，加入一定量的0.01M的NaOH溶液中和微球表面羧基，使其pH為11左右，在磁力攪拌下用0.01M的HCl溶液返滴定，直到樣品的pH為3結(jié)束，計(jì)算羧基含量。

2.結(jié)果與討論

雙重編碼微球的制備路徑如圖1所示，通過(guò)無(wú)皂乳液聚合制備尺寸均一的苯乙烯納米小球作為可溶脹活性種子，然后采用丙烯酰化的蘇丹紅Ⅰ作為共聚單體，制備橙黃色苯乙烯微球。將所得微球作為種子，溶脹負(fù)載稀土配合物進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過(guò)乳液聚合使其包裹在微球內(nèi)。

圖1. 表面羧基功能化的彩色熒光微球的制備路徑示意圖

圖2. (a)蘇丹紅Ⅰ的紫外-可見(jiàn)吸收光譜；(b)Eu配合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜；(c)Eu配合物的熒光光譜。

圖3. (a)聚苯乙烯種子微球，(b)蘇丹紅標(biāo)記彩色微球，(c)經(jīng)雙重標(biāo)記的熒光微球的SEM照片。照片中scalebar長(zhǎng)度為300nm。

圖4. 聚苯乙烯微球在水中的zeta電位：(a)蘇丹紅標(biāo)記的彩色微球，(b)雙重標(biāo)記的熒光微球。

蘇丹紅Ⅰ是一種顏色鮮艷的油溶性染料，固體呈紅色，在低濃度溶液中呈橙黃色，常被用作汽油、機(jī)油、鞋油、蠟等產(chǎn)品的染色。如圖2a所示，蘇丹紅Ⅰ在470nm左右有最大吸收，而稀土Eu配合物在這一波長(zhǎng)沒(méi)有吸收（圖2b），Eu配合物在600nm以上有狹窄的熒光發(fā)射峰，最強(qiáng)熒光在615nm左右（圖2c）。選用蘇丹紅Ⅰ和Eu配合物的組合，不會(huì)因?yàn)樽贤馕兆V的重疊產(chǎn)生干擾，同時(shí)也避免了蘇丹紅Ⅰ的吸收譜和Eu配合物的發(fā)射譜重疊而導(dǎo)致熒光減弱。因此，由這兩種物質(zhì)標(biāo)記制得的微球可以采用470nm處紫外吸收強(qiáng)度（蘇丹紅Ⅰ）和615nm處熒光強(qiáng)度作為兩組檢測(cè)信號(hào)。通過(guò)控制二者的比例，可制得編碼微球。

聚苯乙烯種子微球、丙烯?；K丹紅Ⅰ標(biāo)記橙黃色微球以及蘇丹紅和Eu配合物雙重標(biāo)記的熒光微球的SEM照片分別如圖3（a）、（b）、（c）所示。所制備的種子微球直徑約為150nm，第一次溶脹并聚合后微球直徑約為200nm，第二次溶脹并進(jìn)行乳液聚合后，微球直徑增加到約260nm。SEM照片表明，在最優(yōu)條件下制備的微球表面光滑，球形形貌均勻，尺寸均一。隨著種子溶脹乳液聚合的進(jìn)行，微球尺寸分布有所變化，但整體單分散性仍較好。

微球分散在水中后，通過(guò)zeta電位進(jìn)行表征，其結(jié)果如圖4所示。在第二次種子聚合引入共聚單體甲基丙烯酸（MAA）前，微球的zeta電位為-25mV，這是由于引發(fā)劑為陰離子型自由基，引發(fā)劑過(guò)硫酸銨在分解后產(chǎn)生的陰離子結(jié)合在聚合物末端，并暴露在聚合物微球表面所致。在引入MAA后，微球的zeta電位降低到約-60mV，表明表面所帶負(fù)電荷明顯增多。

圖5. 電導(dǎo)率法測(cè)定熒光微球表面羧基含量

為了定量測(cè)定微球表面羧基的密度，采用電導(dǎo)滴定法對(duì)所制備的微球進(jìn)行測(cè)定，滴定曲線如圖5所示[18]。滴定初期（階段Ⅰ），HCl中和樣品懸浮液中的過(guò)量NaOH，逐步消耗的OH-電導(dǎo)率比Cl-強(qiáng)，從而使整個(gè)體系的電導(dǎo)率下降。HCl完全中和游離的NaOH時(shí)，體系的電導(dǎo)率達(dá)到最低。繼續(xù)滴加HCl，其中的H+與微球表面的COO-結(jié)合使其質(zhì)子化生成弱酸。這一階段由于HCl滴加而引入的Cl-流動(dòng)性比帶電微球大，從而使整個(gè)體系電導(dǎo)率有所增加，這一階段電導(dǎo)率曲線相對(duì)比較平緩（階段Ⅱ）。當(dāng)乳液體系中的COO-都已經(jīng)質(zhì)子化形成COOH后，繼續(xù)滴加HCl將直接導(dǎo)致體系電導(dǎo)率上升（階段Ⅲ）。

聚合物微球表面羧基含量根據(jù)公式（1）進(jìn)行計(jì)算所得約為1.2mmol/mg。

3.結(jié)論

本文分別以蘇丹紅Ⅰ和Eu為色彩染料和熒光標(biāo)記物，通過(guò)兩次溶脹種子無(wú)皂乳液聚合成功制備出有色染料和熒光物質(zhì)雙重標(biāo)記的表面羧基功能化的聚苯乙烯微球。微球在無(wú)激發(fā)光激發(fā)的狀態(tài)下呈現(xiàn)橙黃色，而360nm紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。兩種標(biāo)記物分別可提供470nm處紫外吸收和615nm處熒光作為檢測(cè)信號(hào)。我們有理由相信，通過(guò)控制兩種標(biāo)記物的含量，可以制備出雙重信號(hào)編碼的功能化微球，為生物分子檢測(cè)、藥物篩選等領(lǐng)域研究提供有力工具。

參考文獻(xiàn)

[1] S. W. Bae, W. H. Tan, J. I. Hong. Fluorescent dye-doped silica nanoparticles:new tools for bioapplications[J]. Chem. Commun, 2012,48(17):2270-2282.

[2] V. Holzapfel, A. Musyanovych, K. Landfester, et al. Mail?nder. Preparation of Fluorescent Carboxyl and Amino Functionalized Polystyrene Particles by Miniemulsion Polymerization as Markers for Cells[J]. Macromol. Chem. Phys, 2005,206(24):2440-2449.

[3] H Nhung Tran, THL Nghiem, TDV Thi, et al. Dye-doped silica-based nanoparticles for bioapplications[J]. Adv. Nat. Sci. Nanosci. Nanotechnol, 2013,4(4):43001-43014.

[4] 李倩, 陳新福, 張政樸. 帶羧基單分散彩色微球的制備[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2008,29(2):399-403.

[5] Y. -P. Ho, M. C. Kung, S. Yang, et al. Multiplexed hybridization detectionwith multicolor colocalization of quantum dot nanoprobes [J]. Nano Lett, 2005,5(9):1693-1697.

[6] Liu JB, Yang XH, He XX, et al. Fluorescent nanoparticles for chemical and biological sensing [J]. Science China Chemistry, 2011,54(8):1157-1176.

[7] X. H. Gao, S. M. Nie. Doping Mesoporous Materials with Multicolor Quantum Dots[J]. J. Phys. Chem. B, 2003,107(42):11575-11578.

[8] M. -T. Charreyre, P. Zhang, M. A. Winnik, et al. Adsorption of Rhodamine 6G onto Polystyrene Latex Particles with Sulfate Groups at the Surface [J]. J. Colloid Interface Sci, 1995,170(2):374-382.

[9] F. Tronc, M. Li, J. Lu, et al. Fluorescent polymer particles by emulsion and miniemulsion polymerization [J]. J. Polym. Sci, 2003,41(6):766-778.

[10] Zhang Z, Long Y, Pan J, et al. Preparation of fuorescence-encoded microspheres in a core-shell structure for suspension arrays [J]. J. Mater. Chem, 2009,20(6):1179-1185.

[11] K. Binnemans. Lanthanide-based luminescent hybrid materials[J]. Chem. Rev, 2009,109(9):4283-4374.

[12] Lee YI . Fluorescence Spectroscopy of Polymer Systems Doped with Rare-Earth Metal Ions and Their Complexes [J]. Appl. Spectrosc. Rev, 2010,45(6):409-446.

[13] 李哲峰, 張洪杰. 稀土有機(jī)配合物電致發(fā)光研究進(jìn)展[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2008,29(12):2597-2608.

[14] A. Tuncela, M. Tuncelb, B. Erguna, et al. Carboxyl carrying-large uniform latex particles [J]. Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects, 2002,197(1-3):79-94.

[15] Q. C. Wang, F. ?vec, J. M. J. Fréchet. Fine control of the porous structure and chromatographic properties of monodisperse macroporous poly(styrene-co-divinylbenzene) beads prepared using polymer porogens [J]. Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry, 1994,32(13):2577–2588.

[16] Jiang X, Jen KY, Huang D, et al. The effect of ligandConjugation length on europium complex performance in light-emitting diodes[J]. Synthetic metals, 2002,125(3):331-336.

[17] 秦學(xué), 秦守磊, 周雷激. 羧基聚苯乙烯微球的單分散制備及表征[J]. 廣東化工, 2011,38(223):12-13.

[18] 郭豐梅, 姚金水, 范瑞, 等. 用電導(dǎo)滴定法測(cè)定聚丙烯酸酯乳液中的羧基分布[J]. 齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,28(3):66-68.

The Preparation of Colorfulcarboxyl Fluorescent Microsphere

ZHANG Xiao-yan ZHOU Qi-yang Jiangsu Province Medical Instrument Testing Institute (Nanjing 210012)

In this paper we report the preparation of colored polymer beads that possess carboxyl groups on the surface and emit fuorescence under excitation by UV with specifc wavelength, through active swollen seeds based soap-free emulsion polymerization. Uniform polystyrene nano-spheres are frstly synthesized by emulsion polymerization and utilized as swellable seeds, onto which the co-polymerization of styrene and acrylated dye molecules produces colored polystyrene beads.The as-obtained polymer beads then act as seeds for loading of rare earth ion Eu complex and the following polymerization to encapsulate the Eu complex as well as incorporation of carboxyl group to facilitate coupling of biomolecules.

encoded, soap-free emulsion polymerization, colored, fuorescent, carboxylate

1006-6586(2017)09-0045-04

TQ325.2

A

2017-03-09