孫驪珠 羅 蘭 袁忠林

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院 青島 266109)

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馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)酶活性的影響*

孫驪珠 羅 蘭 袁忠林

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院 青島 266109)

【目的】 探究馬纓丹氯仿提取物、乙酸乙酯和石油醚萃取物對黃胸散白蟻體內(nèi)纖維素酶系及解毒酶系活性的影響，初步探討其作用機(jī)制?！痉椒ā?采用濾紙片帶毒飼喂，測定處理不同時間點(diǎn)其對黃胸散白蟻體內(nèi)3種纖維素酶[內(nèi)切-β-1,4-葡萄糖酶(EG)、外切-β-1,4-葡萄糖酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(BG)]和3種解毒酶[羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFO)]酶活性的影響。【結(jié)果】 馬纓丹氯仿提取物、乙酸乙酯和石油醚萃取物在6～72 h對黃胸散白蟻體內(nèi)6種酶活性的影響存在差異，主要表現(xiàn)為有一定的抑制作用。對3種纖維素酶活性的影響而言，氯仿提取物對EG酶活性無顯著影響，但對CBH和BG酶有顯著的抑制作用，尤其對CBH酶抑制作用較強(qiáng)，在72 h時抑制率最大，達(dá)17.61%； 乙酸乙酯萃取物對3種酶均有抑制作用，對EG和BG酶活性抑制作用較強(qiáng)，在48 h時對EG的抑制率最大，為27.18%，在24 h時對BG酶活性抑制作用最大，為29.28%； 石油醚萃取物對CBH酶活性無顯著影響，但對其他2種酶抑制作用顯著，對EG酶的抑制作用較強(qiáng)，在72 h時對此酶的抑制作用最大，為39.89%。對3種解毒酶活性影響而言，3種提取物對CarE酶的活性影響不大； 對GSTs酶的影響主要在12～48 h，其中乙酸乙酯萃取物的抑制作用最強(qiáng)，36 h時抑制率最大，為39.54%； 對FMO酶的抑制作用呈波動式變化，其中以12 h、36 h抑制作用較強(qiáng)?！窘Y(jié)論】 馬纓丹氯仿提取物、乙酸乙酯和石油醚萃取物能抑制黃胸散白蟻體內(nèi)的纖維素酶和解毒酶，擾亂其正常的生理代謝功能。

黃胸散白蟻； 馬纓丹提取物； 纖維素酶； 解毒酶； 殺蟲作用機(jī)制

白蟻是地球上最為古老的社會性昆蟲之一，是熱帶、亞熱帶重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)昆蟲，它們能協(xié)助分解纖維素使得營養(yǎng)物質(zhì)得以循環(huán)，但它們能損壞建筑物、堤壩、作物和樹木等，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失(Vermaetal.， 2009； Quarcooetal.， 2010)。目前白蟻的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主(Forschleretal., 2000; Sukartanaetal., 2009)，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用帶來的“3R”問題引起人們的高度重視。隨著人們的環(huán)保意識不斷提高，尋找能替代化學(xué)農(nóng)藥的方法進(jìn)行有害生物綜合防治成為當(dāng)今各國科研工作者關(guān)注的熱門領(lǐng)域 (Meepagalaetal., 2006; Isman， 2008)。例如，在美國應(yīng)用對昆蟲具有拒避作用的植物莖葉組織粉碎物與建筑物周圍土壤混合防治白蟻已成為人們最感興趣的方法之一(Chamchalow, 2003; Nixetal., 2006)。國內(nèi)外有關(guān)植物源農(nóng)藥生物活性的研究已做了大量的工作，為進(jìn)一步開發(fā)對環(huán)境安全的新農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)(張興等， 2015)。

馬纓丹(Lantanacamara) (馬鞭草科Verbenaceae) 提取物對昆蟲的殺蟲活性研究已有一些報道，其殺蟲作用主要有毒殺、拒食、拒避、抑制生長發(fā)育等。如馬纓丹石油醚和甲醇提取物對綠豆象(Callosobrachuschinensis)有拒食、致死和抑制繁殖作用(Saxenaetal., 1992)； 馬纓丹花的椰子油提取物對2種伊蚊(Adesalboptctus和A.aegypti)有驅(qū)避作用(Duaetal., 2010)； 馬纓丹石油醚和丙酮提取物對谷蠹(Rhizoperthadominica)、玉米象(Sitophtluszeamais)有致死活性(El-Lakwahetal., 1996; Boudaetal., 2001)； 馬纓丹提取物對黃曲條跳甲(Phyllotretastridata)成蟲具有取食忌避、拒食和觸殺作用(顏振敏等， 2005)； 馬纓丹總巖茨烯對小菜蛾(Plutellaxyllostella)和斜紋夜蛾(Prodenialitura)幼蟲有拒食作用(董易之等， 2005)； 馬纓丹氯仿提取物對白蟻有拒食作用和毒殺作用(Yuanetal., 2012)； 馬纓丹提取物對亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)的卵有毒殺作用，并能延緩幼蟲的發(fā)育(申翠翠等， 2014)等。雖有上述研究，但馬纓丹提取物對昆蟲具有生物活性的作用機(jī)制目前尚未見報道。殺蟲劑對昆蟲體內(nèi)酶活性的影響是其作用機(jī)制的重要方面。白蟻像其他昆蟲一樣，除具有代謝解毒酶系外，更重要的是具有分解纖維素的纖維素酶系(許利霞等， 2012)。本文以馬纓丹不同溶劑提取物對黃胸散白蟻(Reticulitermesflaviceps)(等翅目Isoptera： 鼻白蟻科Rhinotermitidae) 體內(nèi)的纖維素酶體系[包括內(nèi)切-β-1,4-葡萄糖酶(EG)、外切-β-1,4-葡萄糖酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(BG)]、解毒酶系[包括羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)]的酶活性影響進(jìn)行研究，初步探討提取物的作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃胸散白蟻于2014年8月20日采于福建省南平市延平區(qū)，用松木在人工氣候箱(溫度為25 ℃、濕度為80%)黑暗條件下飼養(yǎng)，用成熟健壯工蟻作為試蟲。馬纓丹葉片于2013年8月采自福建農(nóng)林大學(xué)校園內(nèi)，陰干粉碎，粉碎過40目篩(孔徑0.37 mm)后，裝入自封塑料袋中于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器

本試驗所用的試劑均為國產(chǎn)分析純試劑； BIO-RAD酶標(biāo)儀(上海珂淮儀器有限公司)； D-37520冷凍離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品)。

1.3 方法

1.3.1 馬纓丹提取物的制備 氯仿提取物的制備： 稱取馬纓丹干粉末50 g，裝入500 mL 錐形瓶中，加入適量(淹沒馬纓丹粉末)氯仿，用保鮮膜封口，25 ℃左右室溫下避光靜置浸提48 h后進(jìn)行抽濾，上述步驟再重復(fù)2次，合并3次濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮得到浸膏狀物質(zhì)，置于4 ℃冰箱中保存待用。

乙酸乙酯和石油醚萃取物的制備： 稱取馬纓丹干粉末100 g，裝入1 000 mL 錐形瓶中，加入適量(淹沒馬纓丹粉末)乙醇，保鮮膜封口，25 ℃左右室溫下避光靜置浸提48 h后抽濾，上述步驟再重復(fù)2次，合并3次濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮得到浸膏狀的乙醇提取物。將乙醇提取物用乙酸乙酯溶解，加入蒸餾水混勻，在分液漏斗中靜置12 h，放出下面的水層，再重復(fù)加入蒸餾水2次，放出下面水層后，將上面的乙酸乙酯層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，4 ℃冰箱中保存待用。然后將上述放出的水層中加入石油醚，用同樣的方法(每次在放出的下面水層中加入石油醚)重復(fù)2次，共3次，合并石油醚萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后置于4 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 白蟻處理 準(zhǔn)確稱量馬纓丹氯仿提取物、乙酸乙酯和石油醚萃取物，用丙酮分別配成亞致死劑量200 mg·mL-1的溶液。每種溶液取0.4 mL分別均勻滴在直徑為80 mm的圓形濾紙片上，通風(fēng)櫥放置24 h讓溶劑揮發(fā)，然后放入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，每張濾紙片上均勻加入0.4 mL的蒸餾水使其濕潤。溶劑對照(丙酮處理)采用同樣的方法進(jìn)行處理，并設(shè)空白對照(蒸餾水處理)，每處理重復(fù)3次。

每個培養(yǎng)皿接入白蟻200頭，分別于處理后6,12,24,36,48和72 h從培養(yǎng)皿內(nèi)取出60頭活蟲(每個重復(fù)取20頭)，放于指形管中，標(biāo)記處理及時間，超低溫冰箱(-80 ℃)保存，用于酶活性測定。

1.3.3 白蟻纖維素酶酶活性測定 纖維素酶酶活性的測定參照Liu等(2008)的方法。1) 白蟻纖維素酶粗酶液制備 每個指形管中取白蟻10頭，放入離心管中，用 0.1 mol·L-1HAc-NaAc緩沖液(SAB，pH 5.6)反復(fù)漂洗，加200 μL SAB緩沖液在冰浴條件下用研磨棒研磨，每處理3個重復(fù)。磨碎后，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管里，分裝保存于-80 ℃冰箱以保持酶活性，測定前用SAB緩沖液(pH5.6)稀釋5倍即為粗酶液。

2) 纖維素酶活性單位 纖維素酶活性單位(U)是每min底物被酶解產(chǎn)生1 μmol還原糖(以葡萄糖計)所需酶量。

3) 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(EG)活性的測定 以0.1 mol·L-1pH 5.6的SAB緩沖液為溶劑，配制1%(m/V)的羧甲基纖維素鈉溶液為底物。取950 μL底物與50 μL酶液充分混和，在(35±1) ℃恒溫條件下水浴反應(yīng)，加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)終止反應(yīng)，沸水浴5 min，定容到20 mL，用BIO-RAD酶標(biāo)儀在540 nm下測定吸光值。

4) β-葡萄糖苷酶(BG)活性的測定 以0.1 mol·L-1pH 5.6的SAB緩沖液為溶劑，配制1%(m/V)水楊素溶液為底物。取900 μL底物與100 μL酶液充分混和反應(yīng)，其余步驟同3)。

5) 纖維二糖水解酶(即外切-β-1,4葡聚糖酶，CBH)活性的測定 以0.1 mol·L-1、pH 5.6的SAB緩沖液為溶劑，配制1%(m/V)微晶纖維素溶液為底物。取900 μL底物與100 μL酶液充分混和反應(yīng)，其余步驟同3)。

1.3.4 白蟻解毒酶酶活性測定 1) 白蟻解毒酶粗酶液提取 酶活性均以每mg蛋白質(zhì)每min分解底物的μmol數(shù)表示 (μmol·mg-1pro min-1)。

參照龔佑輝(2009)的方法。取處理后白蟻2頭放入離心管中，加入50 μL預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH7.5，0.1 mol·L-1)，置于冰盒上用玻璃研磨棒研磨勻漿，再加入450 μL緩沖液沖洗研磨棒。每處理3個重復(fù)。勻漿液于4 ℃，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液即為酶液，用于測定羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性。

取處理后白蟻3頭放入離心管中，加入500 μL 0.1 mol·L-1pH 7.8 的磷酸緩沖液[含1 mmol·L-1的乙二胺四乙酸(EDTA)，1 mmol·L-1的二硫蘇糖醇(DTT)，1 mmol·L-1的苯硫脲(PTU)，1 mmol·L-1的苯甲基磺酰氟(PMSF)]，置于冰盒上用玻璃研磨棒研磨勻漿。每處理3個重復(fù)。于4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于16 000 r·min-1再次離心30 min作為酶液，用于測定多功能氧化酶活性。

2) 羧酸酯酶(CarE)活性測定 參照J(rèn)esen (2000)的方法。在酶標(biāo)板中依次加入25 μL酶液，75 μL 1.5 mol·L-1的α-乙酸萘酯，反應(yīng)5 min后，加入50 μL染色液(固藍(lán)B終濃度為0.1%，十二烷基磺酸鈉終濃度為1.0%)。終止平衡5 min后于595 nm波長處測吸光值。用α-萘酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酯酶比活性單位為μmol·mg-1min-1。

3) 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性測定 參照J(rèn)esen (2000)的方法。以1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)為底物，在酶標(biāo)板中依次加入 20 μL酶液，100 μL 2 mmol·L-1的 CDNB和 80 μL 12.5 mmol·L-1的谷胱甘肽(GSH)(用pH6.5，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液稀釋)； 以1,2-二氯-4-硝基苯(DCNB)為底物，在酶標(biāo)板中依次加入 100 μL 酶液，50 μL 4 mmol·L-1的 DCNB和 50 μL 20 mmol·L-1GSH (用 pH 7.5，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液稀釋)。將酶標(biāo)板靜置平衡2 min后，于340 nm波長下連續(xù)測定吸光值。每處理重復(fù)3次。根據(jù)CDNB共軛消光系數(shù)(9.6 mmol-1·cm-1)和DCNB共軛消光系數(shù)(8.5 mmol-1·cm-1)，將吸光值轉(zhuǎn)化為共軛形成率。

4) 多功能氧化酶(MFO)活性測定 以對硝基苯甲醚為底物，參照Yu等(1992)的方法測定多功能氧化酶O-脫甲基活性。在酶標(biāo)板中依次加入90 μL酶液、10 μL 9.6 mmol·L-1的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、100 μL 2 μmol·L-1的對硝基苯甲醚。30 ℃下靜置30 min后在405 nm下測定吸光值。用對硝基苯酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活性單位為μmol·mg-1min-1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和作圖在Excel中進(jìn)行，數(shù)據(jù)采用DPSv6.55軟件進(jìn)行方差分析和差異性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)纖維素酶活性的影響

2.1.1 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)內(nèi)切-β-1,4葡聚糖酶(EG)活性的影響 從圖1可以看出，溶劑對照(丙酮)與空白對照(蒸餾水)相比，對EG酶活性影響差異不顯著。對其他5種酶活性測定結(jié)果同樣表明，溶劑對照與空白對照差異均不顯著，由于提取物是以丙酮為溶劑進(jìn)行配制的，因此，在下面各提取物對酶活性的影響均以溶劑對照進(jìn)行比較。氯仿提取物除在36 h稍有激活作用(激活率1.37%)外，其余時間均對EG酶有抑制作用，平均抑制率2.13%，但與溶劑對照無顯著差異。而乙酸乙酯和石油醚萃取物都對白蟻體內(nèi)EG酶活性有顯著的抑制作用，隨著時間推移對酶活性抑制作用越強(qiáng)； 乙酸乙酯萃取物在6～72 h對EG酶活性的抑制率為9.23%～27.18%，平均18.95%； 石油醚萃取物對酶的抑制率為14.77%～39.89%,平均為28.95%。石油醚萃取物對EG酶活性有更強(qiáng)的抑制作用。

2.1.2 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)β-葡萄糖苷酶(BG)活性的影響 由圖2可以看出，3種溶劑的提(萃)取物在6～72 h與溶劑對照相比，對BG酶活性均具有抑制作用。在6 h時，氯仿提取物、乙酸乙酯萃取物對BG酶抑制率分別為3.82%、5.97%和4.30%，與對照差異不顯著，但其余時間與對照均差異顯著。氯仿提取物在12～72 h對BG酶活性的抑制率為14.37%～23.18%，平均18.35%； 乙酸乙酯和石油醚萃取物的抑制率分別為21.64%～29.28%和13.22%～19.80%，平均分別為24.77%和15.75%。3種溶劑提(萃)取物在24～48 h的抑制作用均較強(qiáng)。總體來看，3種溶劑提取物對白蟻體內(nèi)BG酶活性抑制作用的強(qiáng)度順序是乙酸乙酯萃取物 > 氯仿提取物 > 石油醚萃取物。

圖1 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(EG)活性的影響Fig.1 Effects of extracts from L. camara leaves on EG activity in R. flaviceps workers同一時間段柱形圖上不同字母表示差異顯著(P < 0.05) Different letters on the bars of same time indicate significant difference at 0.05 levels. DMK：丙酮Acetone;TCM:氯仿Chloroform;EAC:乙酸乙酯Ethyl acetate;MSO石油醚Petroleum ether.下同 The same below.

圖2 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)β-葡萄糖苷酶(BG)活性的影響Fig.2 Effects of extracts from L. camara leaves on BG activity in R. flaviceps workers

2.1.3 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)纖維二糖水解酶(CBH)活性的影響 從圖3可知，石油醚萃取物對白蟻體內(nèi)CBH酶活性無影響，與溶劑對照差異均不顯著； 氯仿提取物和乙酸乙酯萃取物在6～72 h對CBH酶的抑制作用與對照相比均達(dá)顯著程度。其中氯仿提取物對酶活性的抑制作用最大，為8.35%～17.61%，平均12.54%； 乙酸乙酯萃取物抑制作用次之，為4.74%～11.20%，平均8.56%。

圖3 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)纖維二糖水解酶(CBH)活性的影響Fig.3 Effects of extracts from L. camara leaves on CBH activity in R. flaviceps workers

通過對以上3種纖維素酶活性的測定，氯仿提取物對EG酶活性的影響與對照相比差異不顯著，但對BG和CBH2種酶有抑制作用，尤其對CBH酶抑制作用較強(qiáng)； 乙酸乙酯萃取物對3種酶均有抑制作用，對EG和BG酶活性抑制作用較強(qiáng)； 石油醚萃取物對CBH酶影響與對照差異不顯著，但對其他2種酶有抑制作用，其中對EG酶的抑制作用較強(qiáng)。

2.2 馬纓丹提取物對白蟻體內(nèi)解毒酶活性的影響

2.2.1 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)羧酸酯酶(CarE)活性的影響 由圖4可以看出，氯仿提取物在6，24和36 h對CarE有抑制作用，12，48和72 h有激活作用，但都與溶劑對照差異不顯著； 乙酸乙酸和石油醚萃取物對CarE酶均有激活作用，平均激活率分別為5.41%和6.47%，除12 h乙酸乙酯與對照相比有顯著差異外，其他時間2種萃取物與對照均無顯著差異，說明3種提取物對CarE酶的活性影響不大。

圖4 馬纓丹提取物對白蟻體內(nèi)羧酸酯酶(CarE)酶活性的影響Fig.4 Effect of extract of L. camara leaves on CarE activity in R. flaviceps workers

2.2.2 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響 由圖5可以看出，氯仿提取物6，48和72 h對GSTs酶的影響與對照相比差異不顯著，而在12，24和36 h的抑制作用顯著，抑制率分別是12.08%，14.82%和22.93%； 乙酸乙酯萃取物在72 h對GSTs抑制作用不顯著，其余時間均有顯著的抑制作用，尤其是在12～36 h時抑制作用較強(qiáng)，抑制率為27.13%，34.11%和39.54 %； 石油醚萃取物在6，72 h對白蟻體內(nèi)GSTs酶的抑制作用與對照差異不顯著外，在12～36 h時抑制作用顯著，抑制率分別為19.46%，23.66%和31.68%。乙酸乙酯萃取物對GSTs酶的抑制作用最強(qiáng)。

圖5 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)GSTs酶活性的影響Fig.5 Effects of extracts from L. camara leaves on GSTs activity in R. flavceips workers

2.2.3 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)多功能氧化酶(MFO)活性的影響 由圖6可知，3種提取物對MFO酶有一定的抑制作用，且抑制作用隨著時間的變化而波動變化。氯仿提取物和石油醚萃取物在6，24，48，72 h對白蟻體內(nèi)MFO酶活性的影響與對照差異不顯著； 乙酸乙酯萃取物在6，48 h對MFO的抑制與對照相比差異不顯著。3種提取物在12 h的抑制作用最強(qiáng)，36 h次之； 氯仿提取物在這2個時間對MFO酶的抑制率分別是29.48%和22.92%，乙酸乙酯萃取物分別為35.85%和23.48%，石油醚萃取物分別是23.28%和18.39%。

圖6 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)多功能氧化酶(MFO)活性的影響Fig.6 Effects of extracts from L. camara leaves on MFO activity in R. flaviceps workers

從3種提取物對黃胸散白蟻體內(nèi)解毒酶系來看，3種提取物對CarE酶的活性影響不大； 對GSTs酶的影響主要在12～48 h，其中乙酸乙酯萃取物的抑制作用最強(qiáng)； 對FMO酶的抑制作用呈波動式變化，其中以12，36 h抑制作用較強(qiáng)。

3 討論

白蟻最顯著的特征就是其食木性，這就決定了其纖維素酶活性是其消化酶的重要組成部分。白蟻消化纖維素除自身分泌的纖維素酶和木質(zhì)素酶之外，還需要寄生于后腸的大量共生微生物(如原生動物、鞭毛蟲、細(xì)菌、真菌)產(chǎn)生大量的纖維素酶共同構(gòu)成纖維素酶系統(tǒng)消化纖維素(Todakaetal., 2007)，以維持白蟻的營養(yǎng)(Martinetal., 1978; Tomme, 1995; Ohkuma, 2003; 楊紅等， 2006)。張時妙等(2004)用啶蟲脒、氰戊菊酯和硼酸的亞致死劑量對黃胸散白蟻工蟻體內(nèi)纖維素酶活性的影響進(jìn)行了測定，結(jié)果表明啶蟲脒處理對黃胸散白蟻工蟻體內(nèi)的EG和BG酶活性無顯著影響，氰戊菊酯處理可顯著降低黃胸散白蟻工蟻體內(nèi)的EG和BG酶活性，硼酸對黃胸散白蟻工蟻體內(nèi)EG和BG酶活性的影響與處理濃度和處理時間有關(guān)。本研究表明，氯仿提取物對EG酶活性沒有顯著影響，但對BG和CBH酶有抑制作用； 乙酸乙酯萃取物對3種酶均有抑制作用，對BG酶和EG酶抑制作用較強(qiáng)； 石油醚萃取物對CBH酶沒有影響，但對BG和EG酶有抑制作用，其中對EG酶的抑制作用較強(qiáng)。酶的活性降低使白蟻不能有效降解纖維素從而導(dǎo)致白蟻饑餓直至死亡(Ahmedetal.， 2007)。

CarE酶、GSTs酶、MFO酶系是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，在防御外來不利因子方面具有重要的作用(郭晶等， 2007)。當(dāng)外源毒物進(jìn)入生物體內(nèi)后，會引起酶活性增高而加強(qiáng)代謝，對其進(jìn)行分解，保證生命正?；顒?。但外源毒物的劑量與毒物在生物蟲體內(nèi)的時間不同，對酶的活性影響不同。

有些外源毒物對CarE酶具有激活作用，如細(xì)辛(Asarumsieboldii)精油對玉米螟和黏蟲(Mythimnaseparata)幼蟲(姬蘭柱等， 2013)、亞致死濃度多殺菌素對西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)(龔佑輝等， 2009)、殺蟲藥劑和植物代謝物質(zhì)對棉蛉蟲(Helicoverpaarmigera)(高希武等， 1998)等； 有些外源毒物對昆蟲體內(nèi)CarE酶活性也有抑制作用，如蒼耳(Xanthiumsibiricum)氯仿萃取物對黏蟲(熊正燕等， 2010)、高濃度假蒟(Pipersarmentosum)石油醚萃取物對螺旋粉虱(Aleurodicusdispersus)(林江等， 2012)等。本研究發(fā)現(xiàn)馬纓丹氯仿提取物、乙酸乙酯和石油醚萃取物對白蟻體內(nèi)的CarE酶活性的激活作用，在12 h時激活作用顯著，其他時間與對照均無顯著差異，這說明3種提取物對CarE酶的活性影響不大。

GSTs是害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生代謝抗性的重要酶系，參與許多分子的解毒機(jī)制(任學(xué)祥等， 2011)，GSTs能使有害的親電物質(zhì)與內(nèi)源的還原型谷胱甘肽(GSH)結(jié)合，參與轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)重要的脂類化合物(呂敏等， 2003)。GSTs可通過代謝保護(hù)組織免受氧化損傷，或通過與殺蟲物質(zhì)螯合而起保護(hù)作用(何玉杰等， 2013)。有些植物代謝產(chǎn)物可抑制GSTs酶的活性，如旋覆花(Inulajaponica)石油醚提取物對朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)(段丹丹等， 2011)，八角茴香(Illiciumverum)甲醇、乙酸乙酯、石油醚提取物對長角扁谷盜(Cryptolestespusillus)(何玉杰等， 2013)等； 有些則可激活GSTs酶活性，如蕓香苷對棉鈴蟲(董向麗等， 1998)等。 本研究表明，馬纓丹氯仿提取物、乙酸乙酯和石油醚萃取物對白蟻體內(nèi)的GSTs酶有抑制作用，在12～48 h的抑制作用較強(qiáng)。

MFO系是一類由細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素b5、NADPH-細(xì)胞色素b5還原酶、NADPH-細(xì)胞色素c還原酶及磷脂等組成的氧化酶系，能夠催化各種結(jié)構(gòu)不同的內(nèi)源或外源化合物氧化，如脂肪酸、甾體激素、藥物、殺蟲劑及各種環(huán)境有害化合物等(高新菊等， 2011)。張君霞等(2014)研究表明蒼耳氯仿提取物對蘿卜蚜(Lipaphiserysimi)和黏蟲MFO酶活性的影響呈波動變化，對蘿卜蚜在4,8和24 h起抑制作用，對黏蟲在4 h時起抑制作用。本研究表明，馬纓丹3種溶劑的提取物對MFO有抑制作用，且隨著時間變化而波動變化，在12,36 h時抑制作用較強(qiáng)。

4 結(jié)論

馬纓丹提取物對白蟻體內(nèi)纖維素酶和解毒酶活性有較為顯著的影響。纖維素酶活性的降低使得白蟻不能有效分解纖維素而缺乏營養(yǎng)，解毒酶活性的降低使其不能有效解決外來毒物的為害，從而表現(xiàn)出對白蟻的毒殺作用。外源毒物通過熏蒸、觸殺、胃毒等作用方式均能引起昆蟲體內(nèi)酶活性的變化，馬纓丹葉片3種溶劑提(萃)取物用圓形濾紙片飼喂白蟻可能均具有這幾種作用，并引起白蟻體內(nèi)纖維素酶和保護(hù)酶的變化； 由于提取物為多種馬纓丹代謝物的混合物，究竟哪些成份在起作用，各自的作用是什么，分別對白蟻起到怎樣的毒性表現(xiàn)，還需要進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

Effects of Extracts ofLantanacamara(Verbenaceae) Leaves on Cellulose and Detoxifying Enzymes Activities ofReticulitermesflaviceps(Isoptera： Rhinotermitidae)

Sun Lizhu Luo Lan Yuan Zhonglin

(College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University Qingdao 266109)

【Objective】In order to explore the action mechanisms, the effects of 3 different solvent extracts fromLantanacamara(Verbenaceae) leaves on cellulose and detoxification enzyme in the termiteReticulitermesflaviceps(Isoptera: Rhinotermitidae) were studied.【Method】Termites were fed with filter paper saturated with 3 different solvent extracts ofL.camaraleaves for different times, and then we measured the enzymes activities of endo-β-1,4-glycanase (EG), exo-β-1,4-glucanase (CBH), β-1,4-glucosidase (BG), carboxylesterase (CarE), glutathione-S-transferase (GSTs) and mixed-functional oxidase (MFO). 【Result】The all extracts had to some degree inhibiting effects on the six enzymes activities, however there were differences in the inhibition with extracts of chloroform, ethyl acetate and petroleum ether at 6-72 h. As for the three cellulose enzymes, the chloroform extract had no significant effect on EG, but had significantly inhibiting effect on CBH and BG, especially on CBH with the highest inhibition rate of 17.61% at 72 h. The ethyl acetate extract also had inhibiting effect on the 3 enzymes activities, with relatively stronger inhibition on EG and BG, and the inhibition rate on EG was 27.18% at 48 h, and 29.28% at 24 h, respectively. The petroleum ether extract had no significant effect on CBH, but had strongly inhibited on EG and BG, with the highest inhibition rate of 39.89% on EG at 72 h. As for the three detoxification enzymes, the 3 extracts had no significant effect on CarE, but had inhibiting effect on GSTs, which mainly occurred at 12-48 h. The ethyl acetate extract had the strongest inhibition, with the highest inhibition rate of 39.54% at 36 h. The MFO activities fluctuated after being treated with 3 extracts, and the relatively stronger inhibition on the 3 detoxification enzymes occurred at 12 h and 36 h. 【Conclusion】The extracts of chloroform, ethyl acetate and petroleum ether could decrease the cellulose and detoxification enzymes activities, disrupting the normal physiological metabolism.

Reticulitermesflaviceps;Lantanacamaraextract; cellulose enzyme; detoxification enzyme; insecticidal mechanism

10.11707/j.1001-7488.20170513

2016-02-01；

2016-10-09。

國家自然科學(xué)基金項目(31272106)；山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項。

S718.7

A

1001-7488(2017)05-0107-09

*袁忠林為通訊作者。