董玲玲 玉素甫·買買提 郭雅文 王昶文 黃韜 克力木·阿不都熱依木

·論著·

沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

董玲玲 玉素甫·買買提 郭雅文 王昶文 黃韜 克力木·阿不都熱依木

目的 研究沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(SIRT1)在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)法和組織芯片技術(shù)檢測88例甲狀腺乳頭狀癌組織中SIRT1的表達(dá)，分析SIRT1蛋白的表達(dá)情況及其與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 SIRT1陽性染色主要集中在細(xì)胞核中，呈黃色或者棕色顆粒。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色評分，88例甲狀腺乳頭狀癌組織中SIRT1陽性率為48.9%。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT1表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，SIRT1表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、癌灶多少、甲狀腺包膜浸潤不相關(guān)(P>0.05)。Logistic回歸分析顯示，SIRT1陽性是甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。結(jié)論 SIRT1可能參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并可能成為甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1； 甲狀腺乳頭狀癌； 頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移； 免疫組織化學(xué)法； 組織芯片

沉默信息調(diào)節(jié)因子2-相關(guān)酶類(silent information regulator 2-related enzymes，Sirtuins)是第三類組蛋白去乙?；?，Sirtuin家族(包括SIRT1～SIRT7)的酶活性均依賴于NAD+，但酶活性、底物蛋白和細(xì)胞功能均不一致，其中沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1) 同時(shí)具有致癌和抑癌作用，目前是Surtuin家族的研究熱點(diǎn)[1]。SIRT1蛋白主要定位于細(xì)胞核中，在哺乳動物多種組織如肝臟、胰腺中表達(dá)，在DNA損傷修復(fù) 、抵抗應(yīng)激 、腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮作用[2]。SRIT1在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌中表達(dá)上調(diào)[3-5]，參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展，在皮膚癌、口腔鱗狀上皮癌中表達(dá)下調(diào)，抑制癌癥的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[6-7]。Herranz等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在甲狀腺癌中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤蛋白c-MYC水平相適應(yīng)，促進(jìn)甲狀腺癌的生長，加快腫瘤進(jìn)程。甲狀腺癌中最常見的病理類型是甲狀腺乳頭狀癌，其預(yù)后與臨床病理特征顯著相關(guān)[9]。我們采用免疫組織化學(xué)法和組織芯片技術(shù)，檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中SIRT1的表達(dá)水平，并分析SIRT1與臨床病理特征的關(guān)系及臨床意義。

對象與方法

一、對象

88點(diǎn)甲狀腺乳頭狀癌組織芯片購自上海國家生物芯片工程中心。組織芯片是在每個(gè)甲狀腺乳頭狀癌組織中取一個(gè)直徑1.5 mm的標(biāo)本組成的組織微陣列。甲狀腺乳頭狀癌患者88例，年齡14～91歲，中位年齡47.0歲，病歷資料完整。術(shù)前經(jīng)B超引導(dǎo)下穿刺證實(shí)為甲狀腺乳頭狀癌或者影像學(xué)檢查高度懷疑甲狀腺惡性腫瘤，術(shù)前均無頭頸部手術(shù)史、放化療史及其他惡性腫瘤病史。所有患者均行甲狀腺切除聯(lián)合頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，術(shù)后病理檢查均證實(shí)為甲狀腺乳頭狀癌，病理分期采用美國癌癥聯(lián)合委員會2010年第7版TNM分期法。

二、方法

1.免疫組織化學(xué)檢測：免疫組化定性檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中SIRT1 的表達(dá)，鼠抗人SIRT1單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自美國CST公司。操作步驟：(1)組織芯片置于恒溫箱(60℃)60分鐘，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水室溫浸泡30分鐘，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5分鐘，共3次；(2)滴加3%H2O2，37℃孵育60分鐘，PBS沖洗5分鐘，共3次；(3)置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0)中，高壓鍋內(nèi)快速煮沸，室溫下自然冷卻，PBS沖洗5分鐘，共3次；(4)10%正常山羊血清抗原封閉，37℃孵育60 分鐘，PBS沖洗5分鐘，共3次；(5)滴加SIRT1單抗，4℃過夜，PBS沖洗5 分鐘，共3次；(6)滴加二抗，37℃孵育60 min，PBS沖洗5分鐘，共3次；(7)滴加親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶工作液，37℃孵育20分鐘，PBS沖洗5分鐘，共3次；(8)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5～10分鐘，蘇木素復(fù)染2分鐘，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片、鏡檢。已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

2.免疫組化結(jié)果判定 ：根據(jù)切片陽性細(xì)胞率和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度記分相乘判定SIRT1結(jié)果。SIRT1著色強(qiáng)度：不著色記0分，淺黃為1分，深黃或者棕黃記3分，淺深黃之間記2分；陽性細(xì)胞率：≤25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分，兩者得分相乘≤6分的判定為SIRT1陰性，8～12分判定為SIRT1陽性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法分析組間差異。采用Logistic二元回歸模型和Log-rank檢驗(yàn)行風(fēng)險(xiǎn)因素的單因素、多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.SIRT1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)：SIRT1陽性著色主要集中在細(xì)胞核中，呈黃色或者棕色顆粒。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色評分對88例甲狀腺乳頭狀癌患者進(jìn)行分組，SIRT1陰性45例，SIRT1陽性43例，SIRT1陽性率48.9%。

2.SIRT1的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系見表1。結(jié)果顯示，SIRT1的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)和臨床分期(P<0.05)顯著相關(guān)。在48例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者中，SIRT1陰性32例，SIRT1陽性16例，SIRT1陽性率33.3%。在40例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者中，SIRT1陰性13例，SIRT1陽性27例，SIRT1陽性率67.5%，SIRT1陽性的患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多見(62.8%)。在49例臨床分期Ⅰ～Ⅱ的患者中，SIRT1陰性32例，SIRT1陽性17例，SIRT1陽性率34.7%，在39例臨床分期Ⅲ～Ⅳ的患者中，SIRT1陰性13例，SIRT1陽性26例，SIRT1陽性率66.7%，SIRT1陽性的患者臨床分期相對較晚(60.5%)。在88例甲狀腺乳頭狀癌患者中，年齡<45歲41例，≥45歲47例，男32例，女56例，SIRT1的表達(dá)在年齡組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本組病例中，腫瘤直徑≤2 cm 42例，SIRT1陽性率47.6%，腫瘤直徑>2 cm 46例，SIRT1陽性率50%，單個(gè)癌灶患者76例，SIRT1陽性率50.0%，多個(gè)癌灶患者12例，SIRT1陽性率41.7%，甲狀腺包膜未浸潤患者80例，SIRT1陽性率48.8%，甲狀腺包膜浸潤患者8例，SIRT1陽性率50.0%，χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT1的表達(dá)與腫瘤大小、癌灶多少、甲狀腺包膜浸潤均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 SRIT1與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系

注：a，皮爾遜卡方；b，F(xiàn)isher精確概率法

3.甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)因素的單因素、多因素分析 ：采用Logistic二元回歸模型分析甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因素，結(jié)果見表2，SIRT1陽性是甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[P<0.05；相對風(fēng)險(xiǎn)(HR)=3.918；95%可信區(qū)間(CI)：1.581～9.711]，年齡、性別、腫瘤大小、癌灶多少、甲狀腺包膜浸潤對甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)因素的單因素、多因素分析

討 論

SIRT1在不同組織腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在兩面性，這可能與腫瘤細(xì)胞的組織特異性以及復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[1]。一方面，p53蛋白是p53抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)，細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F1調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，內(nèi)源性的SIRT1 蛋白通過對p53蛋白、E2F1的去乙?；?，阻礙DNA損傷及致癌應(yīng)激引起的凋亡，發(fā)揮致癌作用[1-10]。另一方面，NF-κB參與免疫應(yīng)答和腫瘤形成，內(nèi)源性的SIRT1蛋白可以通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到抑制腫瘤生長的目的[1]。在胰腺癌細(xì)胞系，SIRT1抑制劑EX-527，顯示一定的抗腫瘤作用[11]。在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中，Kweon等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)癌細(xì)胞遭遇基因毒性損傷，SIRT1通過Sirt1-Foxp3-Bax/p21信號通路下調(diào)Bax，上調(diào)p21，保護(hù)癌細(xì)胞免于凋亡。林新恭等[13]報(bào)道，SIRT1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)顯著高于SIRT1在癌旁正常甲狀腺組織中的表達(dá)，推測SIRT1高表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

本研究采用免疫組化方法檢測88例甲狀腺乳頭狀癌組織中SIRT1的表達(dá)，SIRT1陽性率為48.9%，低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，可能與本研究免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)相對嚴(yán)格有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SIRT1陽性患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較SIRT1陰性患者高，SIRT1陽性患者的臨床分期普遍較晚，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-14]，證實(shí)SIRT1在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，SIRT1的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、癌灶多少、包膜浸潤無關(guān)，與吳文藝等[14]的研究報(bào)道一致，提示SIRT1的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、癌灶多少、包膜浸潤無關(guān)。為了排除混雜因素影響，我們采用Logistic二元回歸模型分析頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因素，單因素和多因素分析結(jié)果顯示，SIRT1陽性是甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測SIRT1高表達(dá)有助于甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。吳文藝等[14]在人類甲狀腺乳頭狀癌組織和配對的癌旁組織中檢測SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在甲狀腺乳頭狀癌組織中SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織中SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白的表達(dá)水平，SIRTl mRNA及SIRT1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組中的表達(dá)顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的表達(dá)，因此可以推測，SIRT1高表達(dá)促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌早期出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

Zhao等[5]研究表明，在胰腺癌組織中檢測SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白水平，SIRT1高表達(dá)與年齡>60歲、腫瘤直徑>4 cm、TNM分期較晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在胰腺癌細(xì)胞系中使用siRNA阻礙SIRT1的合成，胰腺癌細(xì)胞增殖周期被阻滯，增殖及浸潤減少，凋亡增加，癌腫形成被抑制。結(jié)合本研究結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí) SIRT1不僅參與腫瘤的發(fā)生、生長，而且在腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化成具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)行為，上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移密切相關(guān)[15]。Palmirotta等[16]報(bào)道，SIRT1在胰腺導(dǎo)管腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌中均參與上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)并維持癌細(xì)胞的活力和侵襲能力。Byles等[17]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，沉默SIRT1可以顯著上調(diào)E-cadherin，增加細(xì)胞間黏附力，從而降低前列腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。我們推測，在甲狀腺乳頭狀癌中，SIRT1促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移可能與上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，這一機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，SIRT1促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并可能成為甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。

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(本文編輯：楊澤平)

Expression and clinical significance of SIRT1 in papillary thyroid carcinoma

DONGLingling，Yusufu·Maimaiti，GUOYawen，etal.

(DepartmentofBreastandThyroidSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China)

Objective To investigate silent mating type information regulation 2 homolog 1(SIRT1)expression and its clinical significance in papillary thyroid carcinoma.Methods We used immunohistochemistry and tissue microarray technique to detect the expression of SIRT1 in 88 papillary thyroid carcinoma tissues.Results SIRT1 positive staining was mainly located in cell nucleus，showed yellow and brown granulated.According to immunohistochemistry scoring，SIRT1 positive rate in the 88 papillary thyroid carcinoma tissues was 48.9%.χ2test showed that SIRT1 expression was significantly associated with cervical lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05)，and no statistical relationships were found between SIRT1 expression and age，gender，tumor size，cancer lesion number or thyroid capsule invasion(P>0.05).Logistic regression analysis showed SIRT1 was an independent risk factor to cervical lymph node metastasis(P<0.05).Conclusion SIRT1 may be involved in the tumorigenesis and cervical lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma，and may become a new target therapeutic drug to cervical lymph node metastases.

SIRT1； papillary thyroid carcinoma； cervical lymph node metastasis； immunohistochemistry； tissue microarray

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.03.014

華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(0118530088)

430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺甲狀腺外科(董玲玲、郭雅文、王昶文、黃韜)；新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院微創(chuàng)外科(玉素甫·買買提、克力木·阿不都熱依木)

克力木·阿不都熱依木，Email：klm6075@163.com

2016-10-19)