陳 玢 劉 偉 史志國 劉 濤 鄭 暉

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院麻醉科，北京 101149；2.國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院麻醉科，北京 100021)

· 麻醉學(xué)與神經(jīng)科學(xué) ·

七氟烷與高濃度氧對(duì)老年小鼠海馬caspase-3的表達(dá)及認(rèn)知功能的影響

陳 玢1劉 偉1史志國1劉 濤1鄭 暉2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院麻醉科，北京 101149；2.國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院麻醉科，北京 100021)

目的 探討七氟烷與高濃度氧對(duì)老年小鼠海馬半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表達(dá)及認(rèn)知功能的影響。方法 健康雄性C57/BL6老年小鼠(14月齡)33只，采用數(shù)字表法將其隨機(jī)分為3組：高濃度氧組(HO組，n=11)：吸100%(體積分?jǐn)?shù))氧4 h；高濃度氧+七氟烷組(HS組，n=11)：吸100%(體積分?jǐn)?shù))氧+2.5%(體積分?jǐn)?shù))七氟烷4 h；對(duì)照組(Con組，n=11)：吸空氣4 h。24 h后采用Morris水迷宮法研究3組小鼠麻醉后連續(xù) 5 d找到平臺(tái)所用的時(shí)間(逃避潛伏期)和第5天去除平臺(tái)后，90 s內(nèi)穿過原平臺(tái)的次數(shù)。利用蛋白質(zhì)印記(Western blotting)法檢測(cè)小鼠海馬caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 與Con組相比，HO組的caspase-3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HS組的穿越平臺(tái)次數(shù)降低(P=0.023)，caspase-3表達(dá)顯著增加(P=0.036)。結(jié)論 吸入100%(體積分?jǐn)?shù))氧對(duì)老年小鼠認(rèn)知功能無影響，2.5%(體積分?jǐn)?shù))七氟烷與100%(體積分?jǐn)?shù))氧同時(shí)吸入增加老年小鼠海馬caspase-3的表達(dá)，與老年小鼠產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙有關(guān)。

老年小鼠；認(rèn)知功能障礙；七氟烷；氧氣；半胱氨酸蛋白酶-3

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是術(shù)后一種常見的合并癥。有研究[1]表明，七氟烷可以引起短暫的術(shù)后認(rèn)知功能障礙。近期研究[2]表明，七氟烷可以誘導(dǎo)β淀粉樣蛋白(amyloid β,Aβ)形成，繼而激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)。Aβ在突觸前的積聚影響突觸前蛋白突觸素和突觸后蛋白(postsynaptic density protein -95,PSD-95)的表達(dá)，從而產(chǎn)生認(rèn)知功能缺陷[3]。Ulue等[4]的研究表明吸入高濃度氧可以導(dǎo)致發(fā)育期腦細(xì)胞死亡，從而產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙，而吸入高濃度氧對(duì)成年腦細(xì)胞的作用還有待研究。本研究通過探討七氟烷和高濃度氧同時(shí)吸入對(duì)老年小鼠認(rèn)知功能的影響，為防止術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生提供思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇與分組

健康雄性C57/BL6老年小鼠33只，14月齡，體質(zhì)量200～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0011。老年小鼠飼養(yǎng)在溫度控制在22 ℃～23 ℃且晝夜平分的屋子里，可隨意攝取標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和水。采用數(shù)字表法將其隨機(jī)分為3組，高濃度氧組(HO組，n=11)：吸100%(體積分?jǐn)?shù))氧4 h；高濃度氧+七氟烷組(HS組，n=11)：吸100%(體積分?jǐn)?shù))氧+2.5%(體積分?jǐn)?shù))七氟烷4 h；對(duì)照組(Con組，n=11)：吸空氣4 h。

1.2 麻醉方法

3組老年小鼠置于特制的麻醉箱內(nèi)，保持自主呼吸，用Datex-Ohmeda麻醉機(jī)進(jìn)行吸入麻醉和吸氧，麻醉過程中用Datex-Ohmeda監(jiān)護(hù)儀連續(xù)監(jiān)測(cè)麻醉藥和氧濃度，用加熱墊將麻醉箱內(nèi)的溫度保持在(37.0±0.5) ℃。麻醉過程中3組的氣體流量保持一致且為4 L/min，七氟烷濃度達(dá)到2.5%時(shí)開始計(jì)時(shí)4 h。

1.3 行為學(xué)測(cè)試

采用Morris水迷宮進(jìn)行測(cè)試。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置為一圓形水池，直徑100 cm，高50 cm，水深30 cm；池壁上以4個(gè)等距離點(diǎn)即東、南、西、北將水池平均分為4個(gè)象限，在西南象限中央離池壁25 cm處放置平臺(tái)(平臺(tái)與池壁、圓心距離相等)，平臺(tái)直徑9 cm，高29 cm，沒于水面下1 cm。每個(gè)象限池壁的中點(diǎn)為動(dòng)物入水點(diǎn)，水池周圍設(shè)有參照物且保持不變。池壁為黑色，池水中加入鈦白粉至看不到平臺(tái)。水溫保持21 ℃～23 ℃，房間內(nèi)光照恒定。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天訓(xùn)練4次，將小鼠分別從4個(gè)不同起始點(diǎn)面向池壁放入水中，限時(shí)90 s，記錄逃避潛伏期(小鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間)和游泳速度，取平均值為當(dāng)天的測(cè)試結(jié)果。最后一次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行空間探索實(shí)驗(yàn)，去除平臺(tái)，然后取距離平臺(tái)最遠(yuǎn)的那個(gè)點(diǎn)將小鼠放入水池中，記錄小鼠90 s內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)。

1.4 Western blotting檢測(cè)海馬caspase-3的表達(dá)

取海馬組織勻漿，離心后取上清液，經(jīng)BCA蛋白定量后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。樣品中加入上樣緩沖液，于沸水中煮10 min使蛋白變性；8%/10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入1：5 000稀釋的兔源的caspase-3抗體，4 ℃孵育過夜；次日1‰TBST洗滌3次×5 min/次，羊抗兔HRP標(biāo)記的抗體室溫孵育1 h，1‰TBST洗滌3次×5 min/次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色，曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

Morris水迷宮法記錄Con組、HO組和HS組小鼠的逃避潛伏期和第5天90 s內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)，見表1、圖1～3。與Con組相比，HO組和HS組的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.875)，而HS組的穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)。

表1 3組小鼠Morris水迷宮測(cè)試指標(biāo)的比較

GroupDayEscapelatency/sPlatformcrossingnumbersConD158.24±20.19D244.17±28.70D337.08±30.82D432.80±24.81D534.15±22.303.64±3.01HOD169.15±21.55D253.26±26.29D344.71±29.99D437.76±25.11D542.14±25.103.08±2.07HSD166.48±11.86D259.11±8.26D364.21±27.97D451.30±8.36D549.33±9.561.2±0.79

Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

Western blotting法檢測(cè)caspase-3在小鼠海馬區(qū)域的表達(dá)。與Con組相比，HS組caspase-3的表達(dá)顯著增加。

圖1 3組小鼠逃避潛伏期的比較Fig.1 Comparison of escaping time among three groups

Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

圖2 3組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的比較Fig.2 Comparison of amounts of crossing the platform among three groups

*P<0.05vsCon group,#P<0.05vsHO group，P<0.05 compared among three groups.Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

圖3 3組小鼠caspase-3表達(dá)Fig.3 Comparison of caspase-3 expression among three groups

*P<0.05vsCon group,#P<0.05vsHO group,P<0.05 compared among three groups. Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

3 討論

1955年，Bedford[5]首次報(bào)道了POCD,他對(duì)5年內(nèi)1 193例全身麻醉后老年病人進(jìn)行回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，接近10%的老年病人術(shù)后存在認(rèn)知功能障礙。1982年，Savageau等[6]首次發(fā)現(xiàn)了POCD、手術(shù)和麻醉之間的聯(lián)系。POCD的發(fā)生率取決于手術(shù)類型、年齡、術(shù)前并存疾病和術(shù)前認(rèn)知功能的情況。目前，POCD的國際研究組織對(duì)實(shí)施非心臟手術(shù)的1 218位老年病人進(jìn)行了國際上最大的關(guān)于POCD的多中心研究。研究[7]表明，術(shù)后1周的發(fā)生率為26%，術(shù)后3個(gè)月為10%，術(shù)后兩年為1%。相反，利用體外循環(huán)實(shí)施心臟手術(shù)的病人術(shù)后1周的發(fā)病率為53%，之后5年的發(fā)病率仍然為42%。POCD的發(fā)病率如此之高，引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。有研究[8]表明老齡是POCD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究正是使用老年小鼠，從動(dòng)物行為學(xué)、海馬區(qū)域蛋白質(zhì)表達(dá)水平兩方面，分別運(yùn)用Morris水迷宮法和Western blotting法探討七氟烷和高濃度氧相互作用對(duì)老年小鼠認(rèn)知功能的影響。

現(xiàn)在普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)事件的結(jié)果, caspase- 3被證實(shí)處于該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游, 它通過降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物使細(xì)胞死亡,其他下游的caspase 成員可能是凋亡事件的真正執(zhí)行者。β位淀粉樣前蛋白(amyloid precursor protein，APP)是一種廣泛存在于各類細(xì)胞的單鏈跨膜糖蛋白, 它可以被caspase-3 剪切, 其蛋白水解產(chǎn)物聚合形成Aβ, Aβ不但出現(xiàn)在老年斑內(nèi), 而且還可誘導(dǎo)caspase-3 激活, 促使細(xì)胞發(fā)生凋亡, 因此推測(cè)caspase-3 可能與POCD 的發(fā)生有關(guān)。有研究[2，9]表明，異氟烷、七氟烷都可以誘導(dǎo)Aβ形成，繼而激活caspase-3。本研究正是采用caspase-3來反應(yīng)POCD的發(fā)生。

七氟烷是目前臨床中最常用的吸入麻醉藥，而且與異氟烷相比，七氟烷有較小的毒性，并且有研究[10]已經(jīng)顯示七氟烷可以激活特定的酶繼而引起tau蛋白的磷酸化產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙，也有研究[11]顯示七氟烷使C/EBP同源蛋白和caspase-12的表達(dá)增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)從而引起老年鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、神經(jīng)退行性變和認(rèn)知功能缺陷。本研究表明七氟烷與高濃度氧同時(shí)吸入時(shí)，老年小鼠海馬caspase-3的表達(dá)水平顯著增多，認(rèn)知功能降低。這表明七氟烷引起的認(rèn)知功能缺陷與細(xì)胞凋亡有關(guān)。但也有研究[12]表明實(shí)施4 h的七氟烷麻醉不會(huì)影響成年鼠和老年鼠的獲得性學(xué)習(xí)記憶力，這有可能是由于使用的七氟烷濃度不同而導(dǎo)致的。之前有研究[13]表明七氟烷引起的短暫認(rèn)知功能損傷是呈劑量依賴性的，與正常0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液組相比，1.5%(體積分?jǐn)?shù))七氟烷麻醉后認(rèn)知功能無改變，而3%(體積分?jǐn)?shù))七氟烷麻醉后認(rèn)知功能顯著降低。

七氟烷可以引起細(xì)胞凋亡及認(rèn)知功能缺陷，同時(shí)高濃度氧引起機(jī)體的氧化應(yīng)激、影響腦內(nèi)平衡、導(dǎo)致腦細(xì)胞壞死，兩者同時(shí)吸入時(shí)，筆者推測(cè)也許產(chǎn)生協(xié)同作用。本研究結(jié)果表明，七氟烷與高濃度氧同時(shí)吸入時(shí)，增加海馬caspase-3的表達(dá)水平，且產(chǎn)生認(rèn)知功能損傷。Chen等[11]的研究比較了單純吸入21%(體積分?jǐn)?shù))氧和七氟烷與高濃度氧同時(shí)吸入的成年與老年大鼠的認(rèn)知功能，結(jié)果表明七氟烷與高濃度氧同時(shí)吸入時(shí)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，C/EBP同源蛋白和caspase-12的表達(dá)增加，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、神經(jīng)退行性變和認(rèn)知功能缺陷。還有研究[13-15]表明3%(體積分?jǐn)?shù))七氟烷與氧同時(shí)吸入時(shí)，通過抑制海馬M1型乙酰膽堿受體mRNA的表達(dá)，從而引起短暫的認(rèn)知功能障礙。以上研究得到的認(rèn)知功能缺陷的結(jié)果與本研究是一致的，但所測(cè)因子不同，說明七氟烷與氧同時(shí)吸入所導(dǎo)致的認(rèn)知功能缺陷機(jī)制是復(fù)雜的，還需要更全面的實(shí)驗(yàn)才能完全闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)七氟烷和高濃度氧同時(shí)吸入可以使老年小鼠認(rèn)知功能降低，但本研究仍存在一些局限性。首先，僅研究了七氟烷與高濃度氧同時(shí)吸入對(duì)認(rèn)知功能的影響，在未來的研究中還需要考慮七氟烷與不同濃度氧，不同濃度七氟烷與相同濃度氧同時(shí)吸入對(duì)認(rèn)知功能的影響。其次，由于時(shí)間原因，僅研究了七氟烷和高濃度氧同時(shí)吸入對(duì)老年小鼠短期認(rèn)知功能的影響，未來還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)決定對(duì)長(zhǎng)時(shí)程認(rèn)知功能的影響。

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編輯 慕 萌

Impact of sevoflurane and high concentration of oxygen on expression of caspase-3 and cognition of aged mice

Chen Bin1, Liu Wei1, Shi Zhiguo1, Liu Tao1, Zheng Hui2*

(DepartmentofAnesthesiology,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China; 2.DepartmentofAnesthesiology,NationalCancerCenter/CancerHospital,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100021,China)

Objective To investigate the impact of sevoflurane and high concentration of oxygen on expression of caspase-3 and cognitive function of aged mice. Methods Thirty three healthy male C57/BL6 elderly mice (14 months) were randomly divided into three groups: group of high concentration of oxygen (HO group,n=11): inhaling 100% oxygen for 4 h; high concentration of oxygen + sevoflurane group (HS group,n=11): taking in 100% oxygen with 2.5% sevoflurane for 4 h; control group (Con group,n=11): taking in air for 4 h. Cognitive function in the elderly mice was tested in the Morris water maze. Western blotting is used to test the expression of caspase-3 in hippocampus. Results Compared with Group Con, Group HO saw no difference in numbers of crossing the platform and Caspase-3 expression. Group HS crossed the platform less (P=0.023)，and the caspase-3 expression of the group increased significantly(P=0.036).Conclusion Inhaling 100% oxygen had no impact on cognitive function in the elderly mice;Inhaling 2.5% Sevoflurane with 100% oxygen could increase expression of caspase-3, and it had close relations with the cognitive dysfunction of the aged mice.

elderly mice; cognitive dysfunction; sevoflurane; oxygen; caspase-3

國家自然科學(xué)基金(81371202)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81371202).

時(shí)間：2017-06-09 17∶07 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1707.002.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.004]

R614

2017-03-20)

*Corresponding author， E-mail：zhenghui0715@hotmail.com