劉文俊，樊振華，王娟萍，姚敬明，吳 忻，孟 帆，韓一超，薛翼鵬，米瑞娟，李紅麗，趙 岳

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032)

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豬流行性腹瀉病毒山西分離株全基因組序列分析

劉文俊，樊振華*，王娟萍，姚敬明，吳 忻，孟 帆，韓一超，薛翼鵬，米瑞娟，李紅麗，趙 岳

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032)

用RT-PCR擴(kuò)增分離的一株P(guān)EDV CH-SXCH11-2015的全基因組序列，測(cè)序拼接后，進(jìn)行了序列分析。CH-SXCH11-2015全長28 038 bp比CV777長5 bp，與BJ-2011-1同源性最高，為98.9%；與LZC、SM98同源性最低，為96.6%。S基因全長均為4 161 bp，突變主要發(fā)生在S1區(qū)，同源性分析表明，CH-SXCH11-2015核苷酸同源性與BJ-2011-1和CH/ZJJS-Z/2012的最高為98.9%，與SM98同源性最低為93.6%，與CV777、CV777vaccine同源性分別為94.2%和93.8%。CH-SXCH11-2015 S基因氨基酸同源性與CH/ZJJS-Z/2012的最高為98.3%，與CV777vaccine、SQ2012同源性最低為91.8%，與CV777的同源性為92.9%。ORF3基因全長均為675 bp，無核苷酸插入和缺失，同源性分析表明，CH-SXCH11-2015的ORF3基因與CH/HBQX/10核苷酸同源性最高，為99.3%，與CV777 truncated核苷酸同源性最低，為90.6%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因推導(dǎo)的氨基酸與(CH/HBQX/10、CH/S、CH/SHH/06、 CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CPF299、GZGY-10、PFF188、PFF285)同源性最高，為98.7%；與CV777 truncated毒株最低，為88%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因與CV777、attenuated DR13的核苷酸同源性分別為96.6%和97.6%，氨基酸同源性分別為95.1%和97.1%。遺傳進(jìn)化分析表明，CH-SXCH11-2015全基因組、S基因、ORF3基因與2010年以后我國分離的毒株親緣關(guān)系較近，與CV777、2個(gè)疫苗株(attenuated DR13、CV777vaccine)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

豬流行性腹瀉病毒；全基因組序列；序列分析

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道傳染病，臨床上以嘔吐、水樣腹瀉和脫水死亡為特征[1]。該病1978年首次報(bào)道于比利時(shí)和英國[2-3]，1984年宣化等證實(shí)該病在我國存在[4]。2010年10月，中國南方暴發(fā)PED[5]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。2014年冬季至2015年春季，山西部分規(guī)?；i場(chǎng)暴發(fā)哺乳仔豬腹瀉病，臨床主要表現(xiàn)為哺乳仔豬水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水和嘔吐，發(fā)病率和病死率高達(dá)90%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了查清山西豬流行性腹瀉的流行情況，課題組對(duì)山西11個(gè)地市的30個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的仔豬腹瀉發(fā)病情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)研，并對(duì)采集的253份病料進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)檢測(cè)，PEDV陽性率為73.26%，TGEV陽性率為7.36%。表明山西豬群發(fā)生的腹瀉，主要是由豬流行性腹瀉病毒引起。課題組從陽性病料中分離出一株P(guān)EDV，命名為CH-SXCH11-2015。本研究通過對(duì)基因組序列的分析，為PED防控提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 2015年從山西某種豬場(chǎng)采集的疑似PED病料中分離出一株P(guān)EDV，命名為CH-SXCH11-2015。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PremixTaqTM、DNA Marker DL2000、pMD18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；E.coliDH5α菌株購自天根生物科技(北京)有限公司；乙醇、異丙醇、氯仿等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中收錄的PEDV CV777、CH/FJND-3/2011全基因組序列，設(shè)計(jì)了31對(duì)引物，引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 病毒總RNA的提取 按RNAiso Plus試劑盒操作說明書，從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取病毒基因組RNA，用適量的DEPC水溶解，置-20℃保存，備用。

1.2.3 PEDV全基因組的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序 以提取的RNA為模板制備cDNA，參照Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作說明書進(jìn)行。在PCR管中依次加入，RNase free H2O 7 μL、RNA 1 μL 、dNTP 1 μL，下游引物1 μL；混勻后，65℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻；在上述的PCR管加入5×Prime Script Ⅱ buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、 PrimeScript Ⅱ RTase 1 μL、 RNase free dH2O 4.5 μL。緩慢混勻，30℃、10 min，42℃、60 min，95℃保溫5 min，冰上放置。PCR反應(yīng)體系：PremixTaq25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水21 μL，混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 80 s，35個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定后將陽性菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 擴(kuò)增PEDV全基因序列的引物

1.2.4 PEDV全基因組、S和ORF3基因的序列比較分析 參考CV777毒株的全基因組序列，用DNAMAN將測(cè)得的序列進(jìn)行拼接。用MegAlign分析CH-SXCH11-2015與GenBank中收錄的國內(nèi)外PEDV參考毒株的全基因組序列和S、ORF3基因同源性和變異情況，并用MEGA5.0分析CH-SXCH11-2015與參考毒株之間遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 全基因組序列序列分析

用DNAMAN將測(cè)得的序列進(jìn)行拼接，結(jié)果顯示，CH-SXCH11-2015毒株全長28038bp，基因結(jié)構(gòu)為5’UTR-ORF1-S-ORF3-E-M-N-3’UTR，符合PEDV基因組的特征。同源性分析表明，CH-SXCH11-2015與BJ-2011-1同源性最高，為98.9%；與LZC、SM98同源性最低，為96.6%。用MEGA5.0分析CH-SXCH11-2015毒株與GenBank中收錄的其他PEDV毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果見圖1。由圖1可見，PEDV毒株可分為2個(gè)群，G1包括CV777、我國2010年以前分離的的毒株(LZC、CH/S)和3個(gè)韓國毒株(SM98、attenuated DR13、virulent DR13)。CH-SXCH11-2015與5個(gè)我國2010年及以后分離的毒株(CH/FJND-3/2011、CH/HNLH/2015、SD2014、CHYJ130330、BJ-2011-1)組成G2群。結(jié)果表明CH-SXCH11-2015與我國2010以后分離的毒株親緣關(guān)系較近，與CV777、我國早期分離的的毒株(LZC、CH/S)和3個(gè)韓國毒株(SM98、attenuated DR13、virulent DR13)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 基因PEDV全基因組序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化分析

2.2 S基因序列分析

2.2.1 S基因序列變化 CH-SXCH11-2015株S基因全長均為4161bp，與CV777比較，既存在堿基位點(diǎn)突變，又存在堿基的插入和缺失現(xiàn)象。在170～171之間插入AAACCAGGGTGT12個(gè)堿基，在401～402之間插入TAA，在467-474位之間缺失TGGAAA。共有251個(gè)堿基發(fā)生突變，其中S1區(qū)有183個(gè)堿基發(fā)生突變。CH-SXCH11-2015株S基因推導(dǎo)的氨基酸與CV777比較，在58～59位之間插入QGVN，在135-136位之間插入N，在153-156位之間缺失DG，共有97個(gè)氨基酸發(fā)生突變，其中在S1區(qū)發(fā)生突變的氨基酸有72個(gè)，占發(fā)生突變的氨基酸比例為74.23%。

2.2.2 S基因同源性分析 CH-SXCH11-2015株S基因核苷酸同源性與BJ-2011-1和CH/ZJJS-Z/2012的最高為98.9%，與SM98同源性最低為93.6%，與CV777、CV777vaccine同源性分別為94.2%、93.8%。CH-SXCH11-2015株S基因氨基酸同源性與CH/ZJJS-Z/2012的最高為98.3%，與CV777vaccine、SQ2012同源性最低為91.8%，與CV777的同源性為92.9%。

2.2.3 S基因的遺傳進(jìn)化分析 CH-SXCH11-2015株S基因與GenBank已收錄的PEDV的23株進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖2。由圖2可知，PEDV毒株可分為2個(gè)群(G1和G2)。G1群又可分為2個(gè)亞群(G1-1和G1-2)，G1-1包括，4株2010年以前分離的中國株(LJB/03、LZC、JS-2004-2、CH/S、)、2014年分離的SQ2014、4株韓國毒株(attenuated DR13、virulent DR13、KPEDV-9、SM98)、1株日本毒株83P-5、 CV777vaccine、CV777。CH-SXCH11-2015與9個(gè)2010年以后我國分離的毒株(CH/HNQX-3/14、CH/FHND-3/2011、CHYJ130330、BJ-2011-1、CH/ZJJS-Z/2012、FJ-PT/2013、SH1404、CH/HNLH/2015、SD2014)組成G1-2群。1個(gè)韓國毒株Chinju99和1個(gè)日本毒株KH組成G2群。結(jié)果表明，CH-SXCH11-2015與2010年以后我國流行毒株(除SQ2014)的親緣關(guān)系較近，與2010年以前我國流行毒株、2個(gè)日本株、5個(gè)韓國株、2個(gè)疫苗株(attenuated DR13、CV777vaccine)、CV777的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 ORF3基因的序列分析

2.3.1 ORF3基因序列變化 CH-SXCH11-2015毒株的ORF3基因全長均為675 bp，與CV777 ORF3基因比較相比，無核苷酸插入和缺失，有23個(gè)相同的核苷酸突變，分別為：62、 162、 360、 393位核苷酸由T→C，54、160、235、301位核苷酸由G→A，63、237 、243 264、274、369、439、450位核苷酸由C→T，238、546位核苷酸由T→G，438位核苷酸由T→A，497位核苷酸由A→G， 616位核苷酸由A→T，630位核苷酸由A→C，631位核苷酸由T→A。CH-SXCH11-2015毒株的ORF3基因推導(dǎo)的氨基酸與CV777相比，第21位氨基酸由V→A，第54、79位由V→I，第80位F→V，第92由L→F，第101由A→T，第165由N→S，第182由H→Q。CH-SXCH11-2015毒株的ORF3基因與attenuated DR13比較，在244-245位之間多了51個(gè)核苷酸，推導(dǎo)的氨基酸序列比attenuated DR13在81-82位氨基酸之間多了17個(gè)氨基酸。

2.3.2 ORF3基因同源性分析 CH-SXCH11-2015與CH/HBQX/10核苷酸同源性最高，為99.3%，與CV777 truncated核苷酸同源性最低，為90.6%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因推導(dǎo)的氨基酸與(CH/HBQX/10、CH/S、CH/SHH/06、CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CPF299、GZGY-10、PFF188、PFF285)同源性最高，為98.7%；與CV777 truncated毒株最低，為88%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因與CV777、attenuated DR13的核苷酸同源性分別為96.6%和97.6%，氨基酸同源性分別為95.1%和97.1%。

圖2 基因PEDV S基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹

圖3 基因PEDV ORF3基因組序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹

2.3.3 ORF3基因的遺傳進(jìn)化分析 CH-SXCH11-2015的ORF3基因與GenBank已收錄的PEDV的ORF3基因序列比對(duì)，利用MEGA5.0建進(jìn)化樹(圖3)。由圖3可知，PEDV毒株可分為2大群(G1和G2)，其中G1群又可分為3個(gè)亞群(G1-1、G1-2和G1-3)。CH-SXCH11-2015與11個(gè)我國2010年以來分離的毒株(CH/HNLH/2015、GZGY-01、BJ-2011-1、CH/HBQX/10、CH/HNQX-3/14、CH/ZJHZHY-6/2013、SH5、CH/TY/12、CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CH/FJND-3/2011)和2009分離的CH/JL/09組成G1-1。G1-2群包括1個(gè)我國2010年以前我國分離的毒株(CH/SHH/06)、1個(gè)我國2010年以后我國分離的毒株(SD2014)和3個(gè)韓國毒株(PFF188、PFF285、CPF299)。G1-3群包括我國早期分離的毒株CH/S、3個(gè)韓國毒株(Chinju99、virulent DR13、attenuated DR13)和CV777 truncated。CV777、Brl/87、LZC組成G2群。遺傳進(jìn)化關(guān)系：CH-SXCH11-2015毒株與11個(gè)我國2010年以來分離的毒株(CH/HNLH/2015、GZGY-01、BJ-2011-1、CH/HBQX/10、CH/HNQX-3/14、CH/ZJHZHY-6/2013、SH5、CH/TY/12、CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CH/FJND-3/2011)的親緣關(guān)系較近，與CV777、LZC、Brl/87、2個(gè)弱毒株(attenuated DR13和CV777 truncated)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

用DNA Man將測(cè)得的序列進(jìn)行拼接，結(jié)果顯示，CH-SXCH11-2015毒株全長28 038 bp，基因結(jié)構(gòu)為5’UTR-ORF1-S-ORF3-E-M-N-3’UTR，符合PEDV基因組的特征。CH-SXCH11-2015比CV777多5個(gè)堿基，是由于CH-SXCH11-2015的5UTR比CV777少了4個(gè)堿基，S基因比CV777多了9個(gè)堿基。全基因組序列分析表明，CH-SXCH11-2015與2010年以后分離的毒株位于同一亞群，親緣關(guān)系較近，同源性為98.3%～98.9%。2010年以前分離的2個(gè)毒株(CH/S、LZC)，3個(gè)韓國毒株(SM98、virulent DR13、 attenuated DR13)和CV777位于另一亞群，與CH-SXCH11-2015的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性為96.6%～97.3%。

CH-SXCH11-2015的S基因全長均為4 161 bp， 與CV777比較，共有251個(gè)堿基發(fā)生突變，其中S1區(qū)有183個(gè)堿基發(fā)生突變。氨基酸序列比較，共有97個(gè)氨基酸發(fā)生突變，其中在S1區(qū)發(fā)生突變的氨基酸有72個(gè)，占發(fā)生突變的氨基酸比例為74.23%，表明突變主要發(fā)生在S1區(qū)，這一結(jié)果與鄭逢梅[6]、劉艷成[7]等的結(jié)果一致。遺傳進(jìn)化樹分析表明，CH-SXCH11-2015與2010年以后我國流行毒株的親緣關(guān)系較近，與2010年以前我國流行毒株、疫苗株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

CH-SXCH11-2015的ORF3基因與GenBank已收錄PEDV進(jìn)行對(duì)比分析，CH-SXCH11-2015與11個(gè)2010年以來我國各地方分離的毒株和2009年我國分離的CH/JL/09毒株親緣關(guān)系較近，與CV777、LZC、Brl/87、2個(gè)弱毒株(attenuated DR13和CV777 truncated)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Park[8]等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過細(xì)胞適應(yīng)的毒株比親本毒株和野生毒株的ORF3基因有51個(gè)核苷酸的缺失。CH-SXCH11-2015與attenuated DR13比較，在244～245之間多了51個(gè)核苷酸，表明CH-SXCH11-2015為野毒株。CH-SXCH11-2015 的ORF3與CV777基因相比，無核苷酸插入和缺失，有多處核苷酸發(fā)生變異，與董彥鵬[9]、顧超逸[10]、黃冬妮[11]等分離的毒株既有相同的變異位點(diǎn)，又有不同的變異位點(diǎn)，可能是由于受到各個(gè)地方當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境、免疫壓力或藥物等因素的影響產(chǎn)生不同變異，變異的多樣性，增加了PED的防控難度。

本研究對(duì)2015年從山西發(fā)病豬群中分離的PEDV毒株CH-SXCH11-2015進(jìn)行了遺傳變異分析，結(jié)果表明，CH-SXCH11-2015全基因與弱毒株attenuated DR13親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，CH-SXCH11-2015的S基因和ORF3基因與弱毒株attenuated DR13和CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，PEDV發(fā)生變異，現(xiàn)在的疫苗不能提供很好的保護(hù)，可能是PED流行的主要原因?，F(xiàn)在急需從變異毒株中篩選新的疫苗毒株，用來防控PED的流行。

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Analysis of Complete Genome Sequence of Porcine Epidemic Diarrhea Virus CH-SXCH11-2015

LIU Wen-jun,FAN Zhen-hua,WANG Juan-ping,YAO Jing-ming,WU Xin,MENG Fan,HAN Yi-chao,XUE Yi-peng,MI Rui-juan,LI Hong-li,ZHAO Yue
(InstitutionofAnimalHusbandryandVeterinary,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030032,China)

Through the RT-PCR method,the complete genome sequence of CH-SXCH11-2015 was amplified,and the sequence data were assembled and analyzed by using Lasergene software (DNAstar Inc.,USA).The complete genome sequence of PEDV CH-SXCH11-2015 is 28 038 nucleotides (nt) in length,and has 5 bp longer than that of CV777.The highest sequence homology of the complete genome sequence of CH-SXCH11-2015 with that of BJ-2011-1 was 97.6%,and the lowest sequence homology of CH-SXCH11-2015 with LZC and SM98 was 96.6%.The length of S gene of CH-SXCH11-2015 was 4161 nucleotides,and was 9 bp longer than that of CV777 strain.The mutations of the S gene of CH-SXCH11-2015 occurred mainly in the S1 region.The CH-SXCH11-2015 had the highest nucleotide homology of 98.9% with BJ-2011-1 and CH/ZJJS-Z/2012,had the lowest nucleotide homology of 93.6% with SM98,and had the nucleotide homologies of 94.2%,93.8% with CV777,vaccine strain-CV777,respectively.The amino acid homology of S gene of CH-SXCH11-2015 was highest of 98.3% with CH/ZJJS-Z/2012,and the lowest homology of 91.8%with CV777vaccine and SQ2012,and the homology was 92.9% with CV777.The ORF3 gene of CH-SXCH11-2015 was 675bp in length,and no nucleotide insertion and deletion.The ORF3 gene of CH-SXCH11-2015 had the highest nucleotide homology of 99.3% with CH/HBQX/10,had the lowest nucleotide homology of 93.6% with CV777 truncated,and had the nucleotide homologies of 96.6% and 95.1% with CV777 and attenuated DR13,respectively.The amino acid homology of ORF3 gene of CH-SXCH11-2015 was highest of 98.7% with CH/HBQX/10,CH/S,CH/SHH/06,CH/TJ-2012,CH/ZKXH/11,CPF299,GZGY-10,PFF188,PFF285,and the lowest homology of 88%withCV777 truncated,and the homologies were 97.6% and 97.1% with CV777 and attenuated DR13.Phylogenetic analysis showed that complete genome sequence,S gene,ORF3 gene of CH-SXCH11-2015 have close relationship with the strains isolated in China after 2010,and have genetically quite distant(far genetic relationship) from CV777,and 2 different strains of vaccine strains (attenuated DR13,CV777vaccine).

Porcine epidemic diarrhea virus; complete genome sequence; sequence analysis

2016-09-28

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311020-2-A)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150311018-3)

劉文俊(1979-)，男，山西河津人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.65

A

1007-5038(2017)06-0006-07