岑人軍，花奇凱，韋雪亮，張文珍

(1.廣西大學體育學院，廣西南寧 530004;2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西南寧 530004;3.廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院,廣西南寧 530004)

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不同負荷運動對小鼠骨骼肌細胞凋亡的影響

岑人軍1，花奇凱2，韋雪亮1，張文珍3

(1.廣西大學體育學院，廣西南寧 530004;2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西南寧 530004;3.廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院,廣西南寧 530004)

探討不同負荷運動對小鼠骨骼肌細胞凋亡及mTOR、Akt蛋白表達的影響。30只小鼠分為3組，依次為對照組(C)、大強度運動組(H)、力竭組(G)。對照組不做運動訓(xùn)練。大強度運動組(H)給予25 m/min的運動訓(xùn)練。力竭組(G)給予10 m/min的運動訓(xùn)練至力竭。6周運動訓(xùn)練結(jié)束后，取腓腸肌，TUNEL檢測細胞凋亡情況。Western blot檢測組織中Bcl-2、Bax、mTOR、Akt蛋白水平。雙縮脲法檢測丙二醛(MDA)含量。黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性。結(jié)果表明，大強度運動組(H)和力竭組(G)細胞凋亡指數(shù)均高于對照組(C)，大強度運動組(H)比力竭組(G)細胞凋亡指數(shù)高，大強度運動組(H)和力竭組(G)Bax蛋白水平均高于對照組(C)；大強度運動組(H)Bax水平高于力竭組(G)，大強度運動組(H)和力竭組(G)Bcl-2、mTOR、p-Akt蛋白水平均低于對照組(C)，大強度運動組(H)Bcl-2、mTOR、p-Akt蛋白水平低于力竭組(G)；大強度運動組(H)和力竭組(G)Akt蛋白水平與對照組(C)相比沒有明顯變化；大強度運動組(H)和力竭組(G) MDA含量均高于對照組(C)，大強度運動組(H)MDA含量高于力竭組(G)；大強度運動組(H)和力竭組(G) SOD活性均低于對照組(C)，大強度運動組(H)SOD活性高于力竭組(G)；大強度運動和力竭運動均會引起骨骼肌細胞的凋亡，且大強度運動比力竭運動更易引起骨骼肌細胞凋亡。

骨骼肌細胞；不同負荷運動；凋亡；影響

運動訓(xùn)練與體育競技密不可分。運動訓(xùn)練對機體組織器官的作用也越來越成為研究的熱點。運動疲勞引發(fā)機體氧化，損害機體的組織器官[1]。特別是超過機體承受的大強度超負荷的運動訓(xùn)練會引發(fā)骨骼肌細胞的凋亡[2]。力竭運動引起的肌肉酸痛、骨骼肌細胞凋亡是機體運動能力下降的重要標志[3]。研究運動對骨骼肌細胞凋亡是目前研究的熱點。

有研究表明，運動能力下降與骨骼肌組織中的MDA水平和SOD活性有關(guān)[4]。本研究以小鼠為研究對象，分別經(jīng)過大強度運動和力竭運動訓(xùn)練后，檢測骨骼肌細胞的凋亡情況，以期為進一步研究運動對骨骼肌細胞凋亡的作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30只9周齡雄性Balb/c小鼠購自于廣西醫(yī)科大學動物實驗室，體重18 g～22 g。

1.1.2 主要試劑 Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、mTOR單克隆抗體、Akt單克隆抗體、p-Akt單克隆抗體均購自于美國CTS；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；SOD活性檢測試劑盒購自于北京博邁斯科技發(fā)展有限公司；MDA含量檢測試劑盒購自于北京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組及運動訓(xùn)練 30只小鼠分為3組，每組10只，依次為對照組(C)、大強度運動組(H)、力竭組(G)。大強度運動組和力竭組在實驗前分別進行7 d的適應(yīng)性訓(xùn)練，跑臺速度為10 m/min，每天運動1次，每次10 min。適應(yīng)性訓(xùn)練后間隔2 d后開始實驗。對照組不進行運動訓(xùn)練。大強度運動組小鼠在10℃坡度適應(yīng)性訓(xùn)練3 min后，在前4周，以25 m/min的速度負荷運動，運動時間為30 min。從第5周至第6周，速度調(diào)整為30 m/min，運動時間為60 min。力竭組運動方式與大強度運動組相同，速度為10 m/min，坡度為10℃至力竭，每天1次，持續(xù)6周。實驗動物均在室溫為22℃～26℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食。6周后，運動結(jié)束1 h，取腓腸肌，隨機分為兩部分，一部分制作切片，一部分做Western blot及MDA含量、SOD活性檢測。

1.2.2 小鼠骨骼肌細胞凋亡指數(shù)測定 分別取各組小鼠腓腸肌制作切片，經(jīng)HE染色后，采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況。切片脫蠟水合后，加入蛋白酶K工作液，放置于室溫下反應(yīng)30 min后，用PBS洗滌兩次，放在封閉液中封閉10 min，滴加TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片，放在37℃孵育1 h，PBS洗滌后，加Streptavidin-HRP工作液，避光孵育30 min，PBS洗滌后，加入DAB顯示液，蘇木素復(fù)染后，顯微鏡下觀察細胞。凋亡的細胞被染為棕褐色或者棕色，未發(fā)生凋亡的細胞為綠色。計算細胞凋亡指數(shù)(AI)。AI=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

1.2.3 Western blot檢測組織中Bcl-2、Bax、mTOR、Akt蛋白水平 取腓腸肌組織，剪碎后，加入含有PMSF的裂解液，取2 ml裂解液加入到勻漿器中，放置于冰上研磨成粉末。取勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r/min離心10 min，吸取蛋白上清液，按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測提取的蛋白濃度。取蛋白樣品與Loading buffer充分混合后，放在100℃的孵育器煮沸5 min。取變性蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠中，80 V電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠，在4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。分別與一抗(500倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)反應(yīng)后，滴加顯色液，曝光后，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達情況。

1.2.4 雙縮脲法檢測MDA含量 取腓腸肌組織，加入含有預(yù)冷的勻漿緩沖液的勻漿器中，研磨5 min后，加入適量的生理鹽水，制備含有骨骼肌組織為10%的勻漿液。用MDA含量檢測試劑盒檢測MDA含量，計算MDA含量。

MDA含量(nmol/L/g)=10 nmol/L/g×樣品稀釋倍數(shù)×(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-標準空白吸光度)

1.2.5 黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性 取腓腸肌組織，根據(jù)SOD活性檢測試劑盒檢測組織中的SOD活性。550 nm處檢測吸光度。如果樣品中含有SOD，SOD會抑制超氧陰離子的氧化為亞硝酸鹽。

SOD活性(U/g)=2×稀釋倍數(shù)×(對照管吸光度-測定管吸光度)/對照管吸光度

2 結(jié)果

2.1 細胞凋亡指數(shù)檢測結(jié)果

各組小鼠運動訓(xùn)練后，取腓腸肌組織，TUNEL法檢測細胞凋亡指數(shù)。結(jié)果顯示，大強度運動組(H)和力竭組(G)細胞凋亡指數(shù)均高于對照組(C)，差異極顯著(P<0.01)。大強度運動組(H)凋亡指數(shù)明顯高于力竭組(G)(圖1)。

C.對照組；H.大強度運動組；G.力竭組；a.P<0.01 vs 對照組;b.P<0.01 vs 大強度運動組

C.Control group; H.High intensity exercise group; G.Exhaustive group; a.P<0.01 vs control group;b.P<0.01 vs high intensity exercise group

圖1 骨骼肌細胞凋亡指數(shù)檢測結(jié)果

Fig.1 Apoptosis index of skeletal muscle cells

2.2 Bcl-2、Bax蛋白水平檢測結(jié)果

各組小鼠腓腸肌組織經(jīng)蛋白提取，Western blot檢測組織中Bcl-2、Bax蛋白水平。結(jié)果顯示，大強度運動組(H)和力竭組(G)Bax蛋白水平均高于對照組(C)，差異極顯著(P<0.01)。大強度運動組(H)Bax蛋白水平明顯高于力竭組(G)，差異極顯著(P<0.01)。大強度運動組(H)和力竭組(G)Bcl-2蛋白水平均低于對照組(C)，差異極顯著(P<0.01)。大強度運動組(H)Bcl-2蛋白水明顯低于力竭組(G)，差異極顯著(P<0.01)(圖2)。

2.3 mTOR、Akt蛋白水平檢測結(jié)果

各組小鼠腓腸肌組織經(jīng)蛋白提取，Western blot檢測組織中mTOR、Akt蛋白水平。結(jié)果顯示，大強度運動組(H)和力竭組(G)mTOR、p-Akt蛋白水平均低于對照組(C)，差異極顯著(P<0.01)。大強度運動組(H)mTOR、p-Akt蛋白水平均低于力竭組(G)，差異極顯著(P<0.01)。大強度運動組(H)和力竭組(G)Akt蛋白水平與對照組(C)相比沒有明顯變化(圖3)。

2.4 MDA含量檢測結(jié)果

取各組小鼠腓腸肌組織，檢測組織中MDA含量。結(jié)果顯示，大強度運動組(H)和力竭組(G) MDA含量均高于對照組(C)，差異極顯著(P<0.01)。大強度運動組(H)MDA含量高于力竭組(G)，差異極顯著(P<0.01)(圖4)。

C.對照組；H.大強度運動組；G.力竭組；A.Western blot結(jié)果圖；B.蛋白表達率；a.P<0.01 vs 對照組;b.P<0.01 vs 大強度運動組

C.Control group; H.High intensity exercise group;G.Exhaustive group;A.Western blot results ；B.Protein expression rate；a.P<0.01 vs control group;b.P<0.01 vs high intensity exercise group

圖2 Bcl-2、Bax蛋白水平檢測結(jié)果

Fig.2 Detection results of Bcl-2 and Bax protein levels

C.對照組；H.大強度運動組；G.力竭組；A.Western blot結(jié)果圖；B.蛋白表達率；a.P<0.01 vs 對照組;b.P<0.01 vs 大強度運動組

C.Control group; H.High intensity exercise group;G.Exhaustive group;A.Western blot results ；B.Protein expression rate；a.P<0.01 vs control group;b.P<0.01 vs high intensity exercise group

圖3 mTOR、Akt蛋白水平檢測結(jié)果

Fig.3 Detection results of mTOR and Akt protein levels

C.對照組；H.大強度運動組；G.力竭組；aP<0.01 vs 對照組;bP<0.01 vs 大強度運動組

C.Control group; H.High intensity exercise group;G.Exhaustive group;aP<0.01 vs control group;bP<0.01 vs high intensity exercise group

圖4 MDA含量檢測結(jié)果

Fig.4 Detection results of MDA level

2.5 SOD活性檢測結(jié)果

取各組小鼠腓腸肌組織檢測 SOD活性。結(jié)果顯示，大強度運動組(H)和力竭組(G) SOD活性均低于對照組(C)，差異極顯著(P<0.01)。大強度運動組(H)SOD活性高于力竭組(G)，差異極顯著(P<0.01)(圖5)。

C.對照組；H.大強度運動組；G.力竭組；aP<0.01 vs 對照組;bP<0.01 vs 大強度運動組

C.Control group; H.High intensity exercise group;G.Exhaustive group;aP<0.01 vs control group;bP<0.01 vs high intensity exercise group

圖5 SOD活性檢測結(jié)果

Fig.5 Detection results of SOD level

3 討論

不同運動方式和運動時間對骨骼肌細胞凋亡的影響不同。在一定條件下，肌肉組織中細胞凋亡增多，臨近的正常的肌細胞能夠吞噬肌細胞產(chǎn)生的凋亡小體[5]。純種馬經(jīng)過3個月的跑臺訓(xùn)練后，運用TUNEL法檢測了組織中肌細胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)運動后的肌細胞凋亡率高于不訓(xùn)練的純種馬[6]。大鼠力竭運動后，大鼠的骨骼肌細胞凋亡明顯增多[7]。不同負荷的游泳訓(xùn)練能夠損害大鼠骨骼肌細胞的微細結(jié)構(gòu)，影響大鼠的運動能力[8]。本研究將試驗分為三組，經(jīng)過大強度運動和力竭運動后，取各組小鼠的腓腸肌，通過TUNEL法檢測骨骼肌組織中骨骼肌細胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大強度運動和力竭運動均能引起骨骼肌細胞的凋亡。且大強度運動對骨骼肌細胞凋亡的促進作用更為顯著。

Bax和Bcl-2都屬于Bcl-2蛋白家族成員。在細胞凋亡過程中發(fā)揮不同的作用。Bcl-2和Bax廣泛存在于生物體細胞中，在線粒體膜、細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中廣泛表達。Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用，屬于抗凋亡基因，而Bax屬于促凋亡基因，在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進作用[9]。Bcl-2參與調(diào)控細胞的增殖，發(fā)揮琥珀酸脫氫酶活性，能夠延長細胞的壽命，抑制脂質(zhì)的氧化[10]。大鼠在夜間經(jīng)過輪形籠跑步后，大鼠骨骼肌細胞出現(xiàn)凋亡，檢測大鼠骨骼肌中Bcl-2水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌纖維中的Bcl-2水平下調(diào)[11]。大鼠經(jīng)過8周的跑臺運動后，骨骼肌細胞凋亡明顯，且Bax水平升高，Bcl-2水平下降[12]。經(jīng)過長期反復(fù)力竭運動后，骨骼肌細胞抗凋亡能力減弱，引發(fā)骨骼肌損傷[13]。研究表明，細胞凋亡與氧自由基密切相關(guān)。細胞內(nèi)的氧自由基能夠促進細胞凋亡，且這種促進關(guān)系具有劑量依賴的特點[14]。SOD活性和MDA含量能夠間接反應(yīng)組織器官中氧自由基的水平。SOD的活性減弱，細胞凋亡增多。而MDA含量增加，細胞凋亡增多。當MDA含量大幅度增加，而SOD活性大幅度降低時，則可能出現(xiàn)細胞壞死[15]。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，分子質(zhì)量約為289 ku。mTOR蛋白是一種保守蛋白，人和鼠的mTOR蛋白有95%的氨基酸是一致的[16-18]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)廣泛存在于生命機體中，在細胞生長、凋亡過程中發(fā)揮重要作用[19]。運動對骨骼肌組織中mTOR和Akt的影響不一。有研究表明，漸增負荷運動能夠促進老年小鼠骨骼肌內(nèi)mTOR的活化，改善骨骼肌的質(zhì)量[20]。

本研究中，Western blot檢測了各組小鼠腓腸肌組織中Bcl-2、Bax、mTOR、Akt蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大強度運動和力竭運動均能引起B(yǎng)ax蛋白表達上調(diào)，抑制Bcl-2蛋白的表達。而大強度運動和力竭運動小鼠骨骼肌組織中mTOR、p-Akt表達下調(diào)。運動后的小鼠SOD活性降低，MDA含量增加。綜上所述，大強度運動和力竭運動能夠引起小鼠骨骼肌細胞凋亡，這可能與mTOR、Akt蛋白表達及氧自由基有關(guān)。這為進一步研究運動對骨骼肌細胞凋亡的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Different Load Exercises on Skeletal Muscle Cell Apoptosis in Mice

CEN Ren-jun1,HUA Qi-kai2,WEI Xue-liang1,ZHANG Wen-zhen3
(1.CollegeofPhysicalEducationofGuangxiUniversity,Nanning，Guangxi，530004，China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning,Guangxi,530004，China;3.StomatologicalHospitalAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity，Nanning,Guangxi,530004，China)

To investigate the effect of different load exercise on the apoptosis of skeletal muscle cells and the expression of Akt and mTOR protein in mice,30 mice were divided into three groups,which were control group (C),high intensity exercise group (H),and exhaustive exercise group (G).The control group did not exercise training.High intensity exercise group (H) gave 25m/min exercise training.Exhaustive exercise group (G) was given 10m/min exercise training to exhaustion.After 6 weeks of exercise,the gastrocnemius muscle was taken to detect the apoptosis by TUNEL.Detection of Bcl-2,Bax,mTOR,Akt protein levels in the organization by Western blot.Content of malondialdehyde (MDA) was detected by biuret method.SOD activity was detected by xanthine oxidase method.The apoptosis indexes of high intensity exercise group (H) and exhaustion group (G) were higher than that of control group (C).The apoptosis index of high intensity exercise group (H) was higher than that of exhaustive group (G).High intensity exercise group (H) and exhaustion group (G) Bax protein levels were higher than the control group (C).High intensity exercise group (H) Bax level was higher than the exhaustive group (G).The levels of Bcl-2,mTOR and p-Akt in the high intensity exercise group (H) and the exhaustion group (G) were lower than those in the control group (C).High intensity exercise group (H) Bcl-2,mTOR,p-Akt protein levels were lower than the exhaustive group (G).High intensity exercise group (H) and (G) Akt protein levels had no significant change compared with the control group (C).High intensity exercise group (H) and exhaustion group (G) MDA contents were higher than the control group (C).The content of MDA in high intensity exercise group (H) was higher than that in exhaustion group (G).SOD activities in high intensity exercise group (H) and exhaustion group(G) were lower than that in the control group (C).High intensity exercise group (H) SOD activity was lower than the exhaustive group (G).High intensity exercise and exhaustive exercise could induce the apoptosis of skeletal muscle cells,and high intensity exercise exercise is more likely to cause apoptosis in skeletal muscle.

skeletal muscle cell; different load exercise; apoptosis; influence

2016-11-09

岑人軍(1978-)，男，廣西北海人，講師，碩士，主要從事體育運動訓(xùn)練、運動醫(yī)學與運動人體科學。

S852.2

A

1007-5038(2017)06-0052-05