張穎欣，周夢潔，余仲佳，陳思媛，王麗婭，于詠蘭

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

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北京地區(qū)家養(yǎng)犬隱孢子蟲感染情況的調(diào)查

張穎欣，周夢潔，余仲佳，陳思媛，王麗婭，于詠蘭*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

為探索適用于寵物臨床檢測隱孢子蟲的方法，并了解北京地區(qū)寵物犬隱孢子蟲感染情況，于2015年1月-2015年12月，在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收集來自北京各個(gè)地區(qū)的家養(yǎng)犬糞便共104例，分別采用改良抗酸染色法、飽和蔗糖漂浮法以及套式PCR擴(kuò)增隱孢子蟲SSU rRNA基因進(jìn)行隱孢子蟲檢測。結(jié)果顯示，PCR方法適用于臨床犬糞便中隱孢子蟲的檢測，而形態(tài)學(xué)方法僅能檢測出純化后卵囊。北京地區(qū)家養(yǎng)犬隱孢子蟲感染率為3.85%(4/104)，蟲種均為犬隱孢子蟲(C.canis)。對不同年齡段的犬隱孢子蟲感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，不同年齡段的家養(yǎng)犬隱孢子蟲感染率差異顯著(P<0.05)，6月齡以下幼犬易感，不同性別、居住地區(qū)的家養(yǎng)犬隱孢子蟲陽性率無顯著差異(P>0.05)。

犬；隱孢子蟲；感染率；調(diào)查

隱孢子蟲(Cryptosporidium)可廣泛寄生于人、哺乳動(dòng)物及禽類等260余種脊椎動(dòng)物的腸道中，部分蟲種具有宿主特異性[1]。Tyzzer于1907年首次在小鼠胃腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)鼠隱孢子蟲(C.muris)，直到1973年首次在免疫缺陷的幼兒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病原，其感染性才得到證實(shí)[2]。后續(xù)隱孢子蟲感染在各個(gè)國家均出現(xiàn)過不同程度的流行，其對人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，同時(shí)也帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)美國疾病控制中心估計(jì)，每年有大約1 500萬人腹瀉，其中有超過3萬人是由隱孢子蟲感染引起的[3]。感染隱孢子蟲的犬只可通過糞-口傳播至人，造成免疫缺陷人群患隱孢子蟲病，表現(xiàn)為水樣腹瀉，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。其中犬易感的蟲種包括犬隱孢子蟲(C.canis)、微小隱孢子蟲(C.parvum)和火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)，均為人畜共患蟲種[4-6]。

隨著人們生活水平的提高，越來越多的寵物犬成為一些家庭的重要成員，據(jù)歐瑞信息公司報(bào)告，中國至少擁有2 700萬寵物犬。犬所攜帶的人畜共患病原具有威脅人類健康的風(fēng)險(xiǎn)，因此，研究犬隱孢子蟲具有重要的公共衛(wèi)生意義。北京市家養(yǎng)犬?dāng)?shù)量極多，對于犬隱孢子蟲流行病學(xué)調(diào)查具有必要性。由于隱孢子蟲的自限性特點(diǎn)，患犬或不表現(xiàn)出任何的臨床癥狀。同時(shí)蟲體卵囊微小，在糞便中易與酵母菌形態(tài)混淆，因此國內(nèi)小動(dòng)物臨床關(guān)于寵物犬隱孢子蟲感染的報(bào)道較少。

國內(nèi)調(diào)查犬隱孢子蟲多采用檢查卵囊的方法，主要有飽和蔗糖溶液漂浮法、福爾馬林-乙酸乙酯離心沉淀法、改良抗酸染色法、盧戈式碘液染色比色法、金胺-酚染色法。其中，飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法最常用，這兩種方法成本低、操作簡便，缺點(diǎn)在于敏感性不夠高，易出現(xiàn)假陰性。免疫學(xué)診斷方面，常用ELISA法來檢測犬血清中隱孢子蟲特異性抗體。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種靈敏度高的分子生物學(xué)檢測方法，可用于大量樣本的檢測，并可確定隱孢子蟲種的基因型和亞型，進(jìn)行種系發(fā)育分析。其缺點(diǎn)在于費(fèi)用高，耗時(shí)長。本研究旨在通過隨機(jī)收集臨床家養(yǎng)犬的糞便，比較形態(tài)學(xué)和PCR技術(shù)的隱孢子蟲檢測敏感性，評估北京地區(qū)家養(yǎng)犬隱孢子蟲的感染情況，為臨床診斷及防控提出科學(xué)建議。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本試驗(yàn)于2015年1月至2015年12月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院隨機(jī)收集家養(yǎng)犬糞便樣品，共計(jì)104份，這些樣品來自于北京13個(gè)地區(qū)的健康犬和腹瀉犬，其中1月齡～6月齡犬糞便樣品58份，6月齡以上犬糞便樣本46份；公犬糞樣72份，母犬糞樣32份。犬種有泰迪、德國牧羊犬、拉布拉多、比格犬、雪納瑞、邊牧、吉娃娃等。采集糞便方式為直腸推注生理鹽水，抽取糞便5 mL(約10 g)。樣品按1∶1與25 g/L重鉻酸鉀溶液混合，檢測前均置4℃冰箱保存待檢。

1.2 隱孢子蟲卵囊形態(tài)學(xué)檢測

本試驗(yàn)分別采用改良抗酸染色法和飽和蔗糖溶液漂浮法對純化后卵囊(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所陳兆國研究院實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))和糞便樣品進(jìn)行隱孢子蟲卵囊形態(tài)學(xué)檢測。

取糞便-重鉻酸鉀混合液5 mL，3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加蒸餾水重懸，再次3 000 r/min 離心5 min，棄上清，重復(fù)3次，至上清液無色透明，留沉淀待檢。

1.2.1 改良抗酸染色法 染液配制：甲液：石炭酸復(fù)紅4 g，950 mL/L乙醇20 mL，苯酚8 g，雙蒸水100 mL；乙液：孔雀綠0.2 g，蒸餾水100 mL；100 mL/L硫酸脫色液：純硫酸10 mL，蒸餾水90 mL。

染色步驟：取少量上述沉淀，2.5 cm～3 cm糞便涂片，自然風(fēng)干，滴加甲液2滴～3滴，覆蓋糞便膜，染色5min后，蒸餾水輕輕沖洗多余染料，滴加脫色液，20 s后蒸餾水沖洗干凈，最后滴加2滴～3滴乙液，洗耳球吹勻，染色3 min，蒸餾水洗去多余染液，蘸干。染好的玻片置于光學(xué)顯微鏡下鏡檢，油鏡下觀察到玫瑰紅色圓形或橢圓形卵囊，周圍一圈不著色區(qū)域，內(nèi)可見子孢子及殘核形態(tài)，即可判為陽性。

1.2.2 飽和蔗糖溶液漂浮法 溶液按照石炭酸7.0 mL，白糖500 g，蒸餾水320 mL配制，加熱后溶解，冷卻后裝瓶待用。取上述剩余的沉淀物，加飽和蔗糖溶液重懸至2 mL，以3 000 r/min離心10 min，然后用吊環(huán)與液面平行接觸以蘸取表面液膜，抖落于載玻片上，加蓋玻片，于高倍鏡下檢測，觀察到粉紅色圓形或橢圓形卵囊，周圍呈現(xiàn)淡綠色折光性，內(nèi)隱約可見子孢子和殘核的凹凸結(jié)構(gòu)，即可判為陽性。

1.3 PCR檢測

采用QIAamp?DNA Stool Mini Kit提取糞便總DNA：取2 mL糞便-重鉻酸鉀混合溶液按照上述步驟洗去其中的重鉻酸鉀，取0.2 g或200 μL沉淀加入2 mL離心管中，加入1.4 mL ASL，渦旋1 min混勻后，于液氮與熱水(80℃)反復(fù)凍融5次，而后按照試劑盒操作說明進(jìn)行后續(xù)步驟提取DNA。

參照Xiao L H等[7]合成隱孢子蟲SSU rRNA 基因引物，由三博遠(yuǎn)志生物科技公司合成，引物序列見表1。 SSU rRNA的兩輪擴(kuò)增體系為：2×TaqStarmix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，第1輪引物SSU-F2、SSU-R2各1 μL，模板DNA液體1 μL，總體系25 μL(第2輪引物為SSU-F3、SSU-R4；模板為第1輪PCR產(chǎn)物1 μL)。兩輪反應(yīng)條件均為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 60 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min；4℃終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，陽性PCR產(chǎn)物送檢，采用正、反雙向測序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。將本試驗(yàn)SSU rRNA基因產(chǎn)物測序后的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索相關(guān)序列進(jìn)行比對，分析序列間的同源性。

表1 本研究所用引物信息

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和率表示。采用單因素方差分析，分別比較年齡、性別、品種以及飼養(yǎng)管理等因素對隱孢子蟲感染率的影響。

2 結(jié)果

2.1 改良抗酸染色法鏡檢結(jié)果

所檢查的104份犬糞便樣品結(jié)果均為陰性，純化卵囊染色結(jié)果為陽性，鏡下卵囊呈橢圓球形，為玫瑰紅色，可見棕黑色殘?bào)w顆粒(圖1)。

圖1 純化卵囊改良抗酸染色后結(jié)果

2.2 飽和蔗糖溶液漂浮法鏡檢結(jié)果

所檢測的104份犬糞便樣品結(jié)果均為陰性，純化卵囊染色結(jié)果為陽性，卵囊呈橢圓球形，呈玫瑰紅色，外有一圈亮綠色折光帶(圖2)。

2.3 隱孢子蟲SSU rRNA基因檢測結(jié)果

對104個(gè)臨床收集的糞便樣本進(jìn)行隱孢子蟲SSU rRNA基因檢測，結(jié)果顯示，4份樣本為隱孢子蟲陽性，凝膠電泳結(jié)果見圖3，陽性產(chǎn)物送檢測序后比對結(jié)果均為C.canis。

圖2 純化卵囊飽和蔗糖溶液漂浮法染色后結(jié)果

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1～2.SSU rRNA陽性樣品；3.SSU rRNA 陰性樣品；4.陰性對照；5.陽性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-2.SSU rRNA positive samples；3.SSU rRNA negative sample；4.Negative control；5.Positive control

圖3 SSU rRNA 基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果

Fig.3 PCR products ofCryptosporidiumSSU rRNA gene

2.4 風(fēng)險(xiǎn)因子評估

僅發(fā)現(xiàn)年齡因素對隱孢子蟲感染率影響顯著(P<0.05)，低于6月齡的幼犬隱孢子蟲感染率明顯高于6月齡以上的犬只。

而犬只性別、品種、食物、飲水、免疫、體內(nèi)驅(qū)蟲等因素均對隱孢子蟲感染率無顯著影響(P>0.05)。

3 討論

本研究中采用改良抗酸染色法鏡檢犬糞便樣品中的隱孢子蟲均為陰性，但對純化后卵囊溶液制片染色后，可在鏡下能清晰分辨玫瑰紅色的的卵囊，與周圍藍(lán)綠色背景對比明顯，表明此方法適用于隱孢子蟲卵囊檢測，但是臨床樣本的低檢出率或是由于糞便含蟲量過少，敏感性較差。該方法不需要特殊設(shè)備，操作簡單，費(fèi)用低，故在目前流行病學(xué)調(diào)查中使用較為廣泛。董和平等[8]通過采用此法對鄭州地區(qū)犬隱孢子蟲進(jìn)行調(diào)查，報(bào)道感染率為2.59%；王菊花等[9]采用此法對合肥地區(qū)進(jìn)行調(diào)查，犬隱孢子蟲感染率為28.99%。

而采用飽和蔗糖溶液漂浮法對臨床糞便樣品中隱孢子蟲卵囊進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)結(jié)果均為陰性，同改良抗酸染色一樣，此法亦能檢測出純化后卵囊溶液中的隱孢子蟲卵囊，表明其敏感性較差，且鏡檢時(shí)易與酵母菌等微生物或脂肪滴相混淆，故特異性不強(qiáng)。Clarke等[10]將飽和蔗糖溶液漂浮法和離心集卵法結(jié)合起來，提高了卵囊的回收率和活性，可作為提高檢出率的參考方法。國內(nèi)采用此法進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，合肥地區(qū)犬隱孢子蟲感染率為10.34%[11]；四川地區(qū)隱孢子蟲感染率為4.3%[4]。而本試驗(yàn)低檢出率或可歸因于北京地區(qū)家養(yǎng)犬隱孢子蟲感染率較低，或臨床收集的犬糞便量較少，富集卵囊較少，故檢出率過低。

套式PCR檢測方法是目前國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查中最主要的方法，本試驗(yàn)采用此法調(diào)查得到北京地區(qū)犬隱孢子蟲感染率為3.85%，敏感性與特異性明顯高于形態(tài)學(xué)檢測。同時(shí)PCR可用于大量樣品的檢測，對于糞便中卵囊含量較少的無癥狀帶蟲者或輕度癥狀的病例的檢測也較為敏感。通過此法的報(bào)道結(jié)果顯示，河南地區(qū)犬隱孢子蟲感染率為3.8%[12]，黑龍江地區(qū)為4.5%[13]，均接近于本試驗(yàn)結(jié)果，調(diào)查地區(qū)和犬群或是存在感染率差異的原因。國外不同犬群的隱孢子蟲感染率，分別為法國2.9%[14]，荷蘭8.7%[15]，巴西2.2%[16]，日本7.2%[17]意大利3.3%[6]，其感染率的差異或許與各個(gè)國家的發(fā)展情況和地理位置有關(guān)。

本研究所收集的樣本雖然都收集于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院，但犬只來源廣泛地覆蓋了北京的13個(gè)行政區(qū)域，因此在地理位置上具有一定的代表性。經(jīng)單因素方差分析各個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子，僅發(fā)現(xiàn)年齡對隱孢子蟲感染具有顯著影響，且低于6月齡的幼犬感染率明顯高于成犬(P<0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道中6月齡以內(nèi)幼犬的隱孢子蟲感染率較高相符合[18]。而其他因素未見顯著性差異。

將所得陽性序列測序比對后發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)家養(yǎng)犬?dāng)y帶的隱孢子蟲全部是C.canis，而該蟲種為犬主要易感，此結(jié)果也與國內(nèi)外其他報(bào)道一致[19]。盡管C.canis主要感染犬，但是也有其在病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的報(bào)道[20]，具有潛在的人畜共患危害。在國內(nèi)外報(bào)道中，犬易感蟲種包括C.canis、C.muris、C.meleagridis和C.hominis，本試驗(yàn)結(jié)果與該報(bào)道相符[9]。而C.hominis是人易感的蟲種，在本次研究中尚未發(fā)現(xiàn)，該蟲種與C.parvum作為世界范圍內(nèi)隱孢子蟲病重點(diǎn)研究的對象，具有非常重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。而C.canis是具有一定的人畜共患風(fēng)險(xiǎn)的隱孢子蟲蟲種，其公共衛(wèi)生學(xué)意義比較有限[21]。參考文獻(xiàn)：

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Investigation on Infection ofCryptosporidiumin Domestic Dogs of Beijing

ZHANG Ying-xin,ZHOU Meng-jie,YU Zhong-jia,CHEN Si-yuan,WANG Li-ya,YU Yong-lan
(CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

The purposes of this study were to compare the methods for detectingCryptosporidiumspp.in small animal clinical diagnosis and to determine the prevalence ofCryptosporidiumspp.of domestic dogs in Beijing.104 fecal samples of domestic dogs (located in 13 different regions) were collected in China Agricultural University Veterinary Teaching Hospital during the period from Jan 2015 to Dec 2015 and were detected forCryptosporidiumspp.by modified acid fast stain,Sheater's sugar flotation technique and nested polymerase chain reaction (PCR) targeting the small subunit (SSU) rRNA coding region,followed by direct sequencing of the PCR products and analysis of the sequences obtained for genotyping.The result showed that nested-PCR could be applied to clinical detection ofCryptosporidiumin dog feces and morphological methods could only detect purified oocysts.The prevalence of dogs infected withCryptosporidiumspp.in Beijing was 3.85%(4/104).All of the 4 sequence samples were identified asC.canis.In domestic dogs,the differences of prevalence among different ages were statistically significant(P<0.05) and puppies below 6 months were more susceptive.No significant correlation (P>0.05) was observed between gender and location of residence.

dog;Cryptosporidiumspp.; infection rate; investigation

2016-10-06

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510019073)

張穎欣(1995-)，女，四川成都人，本科生，主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S852.7

B

1007-5038(2017)06-0120-04