趙 宇，陳忠敏

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

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比色法測定比格犬尿液中檸檬酸的濃度

趙 宇，陳忠敏*

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

建立了一種測定比格(Beagle)犬尿液中檸檬酸濃度的方法，利用檸檬酸與溴化鉀、高錳酸鉀在酸性溶液中生成五溴丙酮，五溴丙酮經(jīng)石油醚(90℃～120℃)萃取后，與硫脲反應(yīng)生成水溶性黃色復(fù)合物，其用紫外分光光度計在435 nm波長處測定。結(jié)果顯示，檸檬酸濃度在0.005 mg/mL～0.25 mg/mL范圍內(nèi)，水溶性黃色復(fù)合物的吸光度與檸檬酸的濃度呈良好的線性關(guān)系，OD435=1.8335C+0.0038，r=0.9996，平均回收率為99.954%(n=5)，變異系數(shù)為1.64%(n=20)。該方法操作簡單，快速準確，適用于非臨床研究中Beagle犬尿液中檸檬酸濃度的測定。

比格犬；尿液；檸檬酸；比色法

檸檬酸化學(xué)名為2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸，是一種天然的果酸[1]，最初從檸檬中制取而得名。檸檬酸是機體內(nèi)最重要的鈣離子結(jié)合物，能降低尿中鈣離子濃度，使鈣鹽飽和度下降，減少含鈣類結(jié)石的形成[2]。檸檬酸是尿液中重要的抑制結(jié)石形成的物質(zhì)，低檸檬酸尿是尿石癥常見的生化異常指標之一，其發(fā)生率為19%～23%[3]。因此，檢測尿液中檸檬酸濃度對尿石癥的基礎(chǔ)研究(包括尿石癥動物模型的建立與評價)和臨床治療具有重要意義。早在1987年檸檬酸鉀就被美國食品與藥品管理局(FDA)批準作為單味藥治療遠端腎小管酸中毒、低檸檬酸尿草酸鈣結(jié)石以及尿酸結(jié)石伴有或不伴有含鈣結(jié)石[4]。

近年來，對于Beagle犬尿液中檸檬酸濃度的測定方法少有報道。羅奇志[5]等通過在尿液中加入紫外吸收劑，利用高效毛細管電泳法來間接檢測尿液中檸檬酸鹽的含量，雖可達到一定的測定效果，但操作繁瑣且試驗中使用的毛細管易被堵塞。據(jù)報道有采用pH指示劑吸光度比值法[6]、高效液相色譜法[7]、超高效液相色譜法[8]、反相高效液相色潽法[9]和離子色譜法[10-11]測定檸檬酸的含量，但只適用于含單一成分的樣品，而Beagle犬尿液中成分復(fù)雜，含有大量高濃度的干擾物質(zhì)，采用這些方法直接檢測比較困難。也有文獻報道利用近紅外光譜法[12]和離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]測定檸檬酸的含量，其靈敏度和準確性高，但所需試驗設(shè)備非常昂貴。

本試驗利用檸檬酸與溴化鉀、高錳酸鉀在酸性溶液中生成五溴丙酮，五溴丙酮經(jīng)石油醚(90℃～120℃)萃取后，與硫脲反應(yīng)生成水溶性黃色復(fù)合物。在一定范圍內(nèi)，水溶性黃色復(fù)合物的吸光度與檸檬酸的濃度具有良好的線性關(guān)系，據(jù)此可計算出Beagle犬尿液中檸檬酸的濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用樣品 Beagle犬尿液，來自湖北省食品藥品安全評價中心的Beagle犬GLP實驗室。

1.1.2 儀器設(shè)備 Easy 10型超純水儀，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；SB-5200D型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SC-3610型低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Bio-DL可調(diào)微量移液器芬蘭百得為澳洲寶德公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；TP214型電子分析天平，丹佛儀器(北京)有限公司；JE1002電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；VORTEX-5型漩渦混懸器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；79-1型磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司。1.1.3 藥品與主要試劑 一水合檸檬酸、三氯乙酸、溴化鉀、單質(zhì)溴、30%過氧化氫溶液、硫脲、十水合四硼酸鈉均為分析純，全部為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；高錳酸鉀，分析純，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，濃硫酸，分析純，信陽市化學(xué)試劑總廠產(chǎn)品。

1 mol/L溴化鉀飽和溴水溶液：在通風(fēng)櫥中，稱取溴化鉀59.50 g于燒杯中，加入適量UP水溶解后，再加入單質(zhì)溴(液態(tài))60.00 g，攪拌混勻后倒入500 mL棕色容量瓶中，并加入UP水至刻度線，配制成1 mol/L溴化鉀飽和溴水溶液，避光保存待用。

316.5 mmol/L高錳酸鉀溶液：稱取25.00 g高錳酸鉀晶體于燒杯中，加入適量UP水溶解后，倒入500 mL棕色容量瓶中，并加入UP水至刻度線，配制成316.5 mM/L高錳酸鉀溶液，避光保存。

0.6 mol/L三氯乙酸溶液：稱取24.51 g三氯乙酸晶體于燒杯中，加入適量UP水溶解后，倒入250 mL容量瓶中，并加入UP水至刻度線，配制成0.6 mol/L三氯乙酸溶液4℃保存。

0.1 mol/L十水合四硼酸鈉水溶液： 稱取38.14 g十水合四硼酸鈉于燒杯中，加入適量UP水溶解后，放置于超聲波清洗機中超聲30 min～50 min后倒入1000 mL容量瓶中，并加入UP水至刻度線，配制成0.1 mol/L十水合四硼酸鈉水溶液，室溫保存。

0.53 mol/L硫脲十水合四硼酸鈉水溶液：稱取硫脲10.09 g于燒杯中，加入前面已配好的適量0.1 mol/L十水合四硼酸鈉水溶液溶解后，倒入250 mL容量瓶中，并加入0.1 mol/L十水合四硼酸鈉水溶液至刻度線，配制成0.53 mol/L硫脲十水合四硼酸鈉水溶液，室溫保存。

0.5 mol/L硫酸溶液：用移液管量取14.00 mL濃硫酸，用玻璃棒邊攪拌邊緩緩加到486 mL UP水中，混勻即成為0.5 mol/L硫酸溶液。

1 mg/mL檸檬酸標準溶液：經(jīng)過換算，稱取一水合檸檬酸0.2734 g于燒杯中，加入前面已配好的適量0.5 mol/L硫酸溶液溶解后，倒入250 mL容量瓶中，并加入0.5 mol/L硫酸溶液至刻度線，配成1 mg/mL檸檬酸標準溶液，保存在4℃環(huán)境中。

1.2 方法

1.2.1 試驗操作步驟 取1 mL尿樣，加入0.6 mol/L三氯乙酸溶液1 mL，混勻，靜置10 min后以2500 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液加0.5 mol/L硫酸溶液0.05 mL；在通風(fēng)櫥中加1 mol/L溴化鉀飽和溴水溶液0.1 mL，混勻；10 min后加入316.5 mM/L高錳酸鉀溶液0.25 mL，混勻；放置10 min后，邊滴加30%過氧化氫溶液邊搖動，使呈無色，消除多余的高錳酸鉀，靜置20 min；加石油醚(90℃～120℃)1.5 mL塞緊，充分振搖10min，離心5min；吸取上層醚液1 mL，加0.53 mol/L硫脲十水合四硼酸鈉水溶液5 mL，塞緊，充分振搖5 min，以2500 r/min離心5 min；棄去上層醚液及混濁物，吸取下層水液進行比色，波長435 nm，光程1 cm；同時測定空白(0.5 mol/L硫酸溶液1 mL)。測定操作均采用1×15 mL離心管。

1.2.2 試驗數(shù)據(jù)的處理 由檸檬酸標準溶液的直線方程為A=k·C+b，(A為吸光度，C為濃度)；可知Cx=N·(A﹣b)/k，(Cx為樣品中檸檬酸的濃度，N為樣品的稀釋倍數(shù)，A為樣品的吸光度)。

2 結(jié)果

2.1 最大吸收峰和最佳吸收波長的選擇

配制0.005、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mg/mL的檸檬酸標準溶液，分別精密量取上述濃度的檸檬酸標準溶液1 mL，按試驗操作方法開始操作，同時做空白對照(在分光光度上進行掃描時，空白試液作為校準背景)。取水溶性黃色復(fù)合物適量在UV-1800PC型紫外可見分光光度計上于波長350 nm～600 nm范圍內(nèi)掃描(如圖1)，可知最大吸收波長λmax=435 nm ±1 nm。根據(jù)比色原理，該最大吸收波長即為測定時所要選擇的最佳波長，故以435 nm作為測定波長。

2.2 標準曲線的繪制

精密量取1 mg/mL檸檬酸標準溶液0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08、0.04、0.02、0.01 mL，分置15 mL塑料離心管中，分別加入0.5 mol/L硫酸溶液1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、1.92、1.96、1.98、1.99 mL，搖勻。按試驗操作方法從加0.5 mol/L硫酸溶液0.05 mL開始操作，同時做空白對照(空白試液作為校準背景)，在435 nm處對每個濃度下的標準溶液所生成的水溶性黃色復(fù)合物的吸光度總共測3次，然后再取平均值，所得結(jié)果如表1和圖2。

由圖2可知，檸檬酸溶液濃度在0.005 mg/mL～0.25 mg/mL的范圍內(nèi)，吸光度與檸檬酸溶液的濃度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為OD435=1.8361C+0.0038，r=0.9996。

2.3 重復(fù)性試驗

2.4 回收率試驗

取10個15 mL塑料離心管，分為A和B兩組，每組5個。對于同一份比格犬尿樣，A組每個離心管中加入1 mL尿樣，B組每個離心管中先加入1mL尿樣，再依次分別加入1 mg/mL檸檬酸標準溶液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mL，按實驗操作方法測定兩組中每個尿樣中的檸檬酸的濃度(表2)。

圖1 檸檬酸標準溶液生成的水溶性黃色復(fù)合物的吸收光譜

表1 檸檬酸標準溶液濃度與吸光度的關(guān)系

圖2 檸檬酸標準溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系

表2 回收率試驗結(jié)果

*注：回收率=V·(CB-CA)/mB·100%；V為樣品的體積，CB為B組檸檬酸濃度，CA為A組檸檬酸濃度，mB為樣品中加入的檸檬酸的質(zhì)量。

Note:Recovery rate=V·(CB-CA)/mB·100%；V.Sample’s volume; CB.The concentration of B’s citric acid; CA.The concentration of A’s citric acid; mB.The mass of citric acid which was put into the corresponding sample.

3 討論

本試驗中所用的比格犬尿液，來源于湖北省食品藥品安全評價中心的Beagle犬GLP實驗室。該實驗室的溫度和濕度可控，飼養(yǎng)環(huán)境良好，動物用飼料專間貯存，排除了黃曲霉毒素[14]等有毒有害物質(zhì)對飼料的污染。試驗人員用收尿瓶收集尿液時盡量輕拿輕放，減少對犬造成一定的應(yīng)激反應(yīng)[15]?？傊?，本試驗盡可能地降低外部環(huán)境對犬生理生化指標的影響，所收集的尿液樣品基本滿足試驗要求。

本法開始時加入0.6 mol/L三氯乙酸溶液，混勻后離心并吸取上清液，可以去除尿液中混有的少量蛋白質(zhì)和某些無機成分，減少這些物質(zhì)與溴化鉀和高錳酸鉀發(fā)生反應(yīng)的可能性，提高測定結(jié)果的準確性。本法成敗的關(guān)鍵在于30%的過氧化氫溶液完全消耗掉過量的高錳酸鉀使反應(yīng)體系呈無色，避免高錳酸鉀本身的顏色對試驗結(jié)果造成干擾。值得注意的是，當樣品中的檸檬酸的濃度過低時，加入的30%的過氧化氫溶液的體積遠遠超過反應(yīng)體系的總體積，此時用石油醚(90℃～120℃)1.5 mL來萃取生成的五溴丙酮已非常困難。那么空白試驗中為什么加入很少量30%的過氧化氫溶液后，溶液很快會變成無色呢？這是因為空白試驗中加入的樣品是0.5 mol/L硫酸溶液1 mL，根據(jù)在酸性條件下，2KMnO4+5H2O2+2H2SO4=K2SO4+MnSO4+5O2↑+2H2O計算可知，此時硫酸對于高錳酸鉀來說是過量的，故只需加入少量的30%的過氧化氫溶液即可。

《中國藥典》2015版采用非水滴定法測定檸檬酸鉀溶液的含量[16]，但只適用于單一成份或樣品中雜質(zhì)含量較少，較難運用于Beagle犬尿液中檸檬酸濃度的測量。本試驗利用檸檬酸與溴化鉀、高錳酸鉀在酸性溶液中生成五溴丙酮，五溴丙酮經(jīng)石油醚(90℃～120℃)萃取后，與硫脲反應(yīng)生成水溶性黃色復(fù)合物，能進行比色測定的原理，建立了一種簡單的采用紫外分光光度計測定Beagle犬尿液中檸檬酸濃度的方法，對于尿石癥Beagle犬模型的建立與評價具有重要意義。

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Determination of Citric Acid in Urine of Beagle by Colorimetric Method

ZHAO Yu，CHEN Zhong-min
(CollegeofPharmacyandBioengineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing,400054,China)

The purpose of this study was to establish a method for measuring citric acid in urine of Beagle and evaluate application in non-clinical research.In this study,citric acid,bromatum kalium and potassium permanganate can act and generate pentabromoacetone in acid solution.The pentabromoacetone was extracted by petroleum ether and then reacted with thiourea to generate yellow compound of water solubility.And it can be measured by spectrophotometer in 435 nm wavelength.The final results in treated urine were determinated exactly.All the coefficients of variation were less than 5%.The recoveries for the five urine samples were all more than 95%.The methods is simple,accurate and fast.It is suitable for the determination of citric acid in the urine of Beagle.

Beagle ; urine; citric acid; colorimetric method

2016-09-25

趙 宇(1990-)，男，碩士研究生，主要從事基因工程藥物研究。*通訊作者

S852.2

B

1007-5038(2017)06-0124-04