史海蛟，楊可鑫

蘇木乙酸乙酯提取物對心臟移植模型大鼠LFA-1mRNA表達的影響

史海蛟1，楊可鑫2

目的 觀察蘇木乙酸乙酯提取物對同種異位心臟移植急性排斥反應模型大鼠移植心肌淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)mRNA表達的影響，探討其免疫抑制作用的機制。方法 采用改良的Ono術式，以Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，制備大鼠同種異位心臟移植模型，造模成功后，采用 Real Time-PCR法測定LFA-1mRNA的表達。結果 與模型對照組相比，蘇木組、CsA組及蘇木加半量CsA組均能明顯抑制LFA-1mRNA的表達，而蘇木乙酸乙酯提取物及蘇木乙酸乙酯提取物加半量CsA抑制LFA-1 mRNA的表達的作用相當，且在抗排斥反應時，蘇木乙酸乙酯提取物可以減少CsA的用量。結論 在大鼠心臟移植模型中，蘇木乙酸乙酯提取物具有抑制同種異位心臟移植模型大鼠心肌的LFA-1mRNA的表達，減輕移植心臟的急性排斥反應。

蘇木乙酸乙酯提取物；同種異體心臟移植；LFA-1mRNA

隨著科學技術的飛速發(fā)展，同種異位器官移植已經是治療終末期疾病器官移植相對有效的方法，而急性排斥反應是術后存活率和成敗最大的障礙之一，有研究證實，移植排斥的效應階段主要是宿主免疫細胞、炎癥細胞大量浸潤攻擊移植物[1]。目前臨床上已經應用了多種有顯著效果的免疫抑制劑，但其毒副作用很大。因此，現(xiàn)在最主要的任務是如何使急性排斥的嚴重程度大幅度降低，尋找高效低毒、廉價的免疫抑制劑，是非常必要的。蘇木為傳統(tǒng)中藥，具有祛瘀通經、活血療傷的功效。文獻有關于蘇木功效的記載?！短票静荨肥纵d：“主破血”?！洞竺鳌?：“消臃腫，撲損淤血，排膿止痛”。在器官移植術后發(fā)生的急性排斥反應的主要病理表現(xiàn)是在受體血管與供體血管血流開通后數(shù)分鐘內，供體血管迅速出現(xiàn)血栓形成，這與中醫(yī)學的血瘀癥較相似。中醫(yī)治法則為活血化瘀。因此，蘇木則應用于免疫抑制作用的研究。淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)是整合素家族中的一個成員，是細胞間黏附因子-1(ICAM-1)的配體，能增強細胞毒性T細胞和NK細胞的殺傷效應。研究發(fā)現(xiàn)黏附分子參與排斥反應中免疫系統(tǒng)的激活，阻斷黏附分子活性能明顯延長移植物的生存時間。因此，本文研究旨在通過建立大鼠心臟移植急性排斥反應模型，觀察蘇木乙酸乙酯提取物對同種異位心臟移植急性排斥反應模型大鼠移植心肌LFA-1mRNA表達的影響，探討其免疫抑制作用的機制，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及樣品采集

1.1.1 實驗動物 受體：健康、清潔級SD大鼠，雄性，體重(220±20)g。供體：健康、清潔級Wistar大鼠，雄性，體重(220±20)g。均由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗用藥 蘇木乙酸乙酯提取物：蘇木粗粉(80目)加入 75%乙醇回流提取2 h，提取液減壓回收乙醇，濃縮至膏狀，減壓干燥，得到干粉。將蘇木乙醇提取干粉倒入雙蒸水進行混懸，并用乙酸乙酯萃取、回收，從而獲得蘇木乙酸乙酯提取物。環(huán)胞素A(CsA)：將每粒含CsA 25 mg的環(huán)孢素軟膠囊(田可)溶解于橄欖油中，將其配制成3.5 mg/mL濃度的藥液，于4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 心臟移植模型的制備 大鼠同種異位心臟移植術，采用經改良的Ono術式，將供心的升主動脈與受體的腹主動脈，供心的肺動脈與受體的下式，將供心的升主動脈與受體的腹主動脈，供心的肺動脈與受體的下腔靜脈分別吻合，為供心提供血液循環(huán)。

1.1.4 實驗分組 大鼠隨機分為4組，每組8只。設為模型對照組、蘇木組、CsA組、蘇木加半量CsA組。術后每天09：00灌胃給藥，每天1次，模型對照組每天按10 mL/ kg灌服橄欖油，蘇木組給予蘇木乙酸乙酯提取物736 mg/kg溶于橄欖油后灌服給藥，CsA組給予按35 mg/kg溶于橄欖油后灌服給藥，蘇木加半量CsA組給予蘇木乙酸乙酯提取物736 mg/kg加CsA 17.5 mg/kg溶于橄欖油后灌服給藥，各組均以同體積橄欖油給大鼠灌胃。

1.1.5 標本的采集 術后大鼠腹腔移植心跳滿7 d者于當天取供心；不滿7 d者于腹腔心臟停跳時取供心。移植心臟存活時間以天為計算單位，手術當天按0 d計算，不足24 h者采用四舍五入法計算。術后第7天，給藥2 h后，將受體大鼠用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg體重)麻醉，常規(guī)固定、消毒、鋪巾處理。沿正中線切開腹壁，剝離出下腔靜脈?？焖儆檬中g剪(0.1 %DEPC 水處理后)剪取供心心肌組織，標本分為兩份：一份剪碎后置入凍存管中，迅速置于液氮罐中冷凍，-80 ℃低溫冰箱保存，待做Real-Time PCR檢測用。

1.2 Real Time PCR測定LFA-1mRNA

1.2.1 總RNA的提取 提取RNA按照美國QIAGEN公司RNeasy@ Mini Kit試劑盒的說明進行操作：取樣品100 mg放入預冷的研缽中，加入液氮研磨，將粉末移入1.5 mL EP管中，加入450 μL Buffer RLT；將樣品轉移至2 mL體積的RNeasy column中，大于8 000 g/min，離心15 s，棄上清。然后加700 μL Buffer RW1到RNeasy column中，大于8 000 g/min，離心15 s，棄上清。再加500 μL Buffer RPE到RNeasy column中，大于8 000 g/min，離心15 s，棄上清。加500 μL Buffer RPE到RNeasy column中，大于8 000 g/min，離心2 min。將RNeasy column移至一新的2 mL EP管中，10 000 g/min，離心1 min。將RNeasy column移至一新的1.5 mL EP管中加入30 μL～50 μL RNase-free水，大于8 000 g/min，離心1 min。棄柱子，溶液-20 ℃保存。將取提取的Total RNA，用紫外分光光度計檢測在260 nm和280 nm下的OD值，260 nm/280 nm 的比值應在1.8～2.0范圍內。小于1.8說明有蛋白污染，大于2.0則可能有機溶劑污染。

1.2.2 引物設計(見表1)

表1 引物設計

1.2.3 純度驗證 將提取的RNA進行甲醛變性凝膠電泳，對其純度加以驗證，方法如下：電泳槽用0.3%H2O2浸泡30 min，0.1%的DEPC水沖洗晾干后鋪膠(20 mL)∶1.2%的瓊脂糖0.24 g，無RNase水17.4 mL，10×MOPS 2.0 mL，37%甲醛0.6 mL，DNA Green 1.0 μL將瓊脂糖加水融化后，加10×MOPS，待膠冷卻至60°C左右，再加甲醛和DNA Green。加入2.0 mL甲醛凝膠上樣緩沖液(10×)進行上樣和電泳：穩(wěn)壓7.5 V/cm電泳。

電泳液為1×MOPS電泳緩沖液。直至溴酚藍遷移至膠下游的3/4處時，結束電泳，在紫外投射儀下，測量28S rRNA和18S rRNA至加樣孔的距離，用來確定RNA的完整性。完整的總RNA樣品應出三條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA條帶的亮度應為18S rRNA條帶亮度的3倍左右，這表明總RNA樣品比較完整，基本無降解。1.2.4 反轉錄反應 按照TaKaRa PrimeScript ? RT-PCR Kit反轉錄試劑盒使用說明進行操作。

1.2.5 Real Time PCR 反應 使用SYBR?Green I嵌合熒光法檢測各組基因的表達。按Power SYBR? Green PCR Master Mix： Performing Real-Time PCR Assays(For Applied Biosystems，ABI 7500，Invitrogen Tech-Line SM U.S.A. PN 4367218)和ROX Reference Dye (Invitrogen Tech-Line SM U.S.A. Cat. No. 12223-012)試劑盒的組分配制Real-time PCR反應液(在冰上進行反應液配制)

1.2.6 計算方法 在60 ℃、60 s步驟收集信號，調整最佳閾值，獲得Ct值；同時對Real-time PCR產物進行SYBR融解曲線分析，并用滅菌的去離子水代替模板作為陰性對照。以β-actin 作為內參照，用相對定量法2-ΔΔCt分析mRNA相對表達量。ΔΔCt=[對照組目的基因平均Ct值-對照組看家基因平均Ct值]-[待檢樣品目的目的基因平均Ct值-待檢樣品看家基因平均Ct值]。

2 結 果

從溶解度曲線可見看出，溶解曲線只有一個峰，說明PCR擴增特異性良好(見圖1)。從標準曲線可以看出，β-actin和LFA-1mRNA擴增效率基本一致，說明結果可靠(見圖2)。以模型對照組大鼠作為對照，其LFA-1mRNA表達量為1，隨著藥物的干預，各治療組LFA-1mRNA表達降低，與模型對照組比較，各治療組均能明顯抑制LFA-1mRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與CsA組比較，蘇木組作用效果較差，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而蘇木加半量CsA組作用效果相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。

圖1 Real Time-PCR擴增基因β-actin和LFA-1的溶解曲線

圖2 Real Time-PCR擴增基因β-actin和LFA-1的標準曲線

表2 移植心肌組織LFA-1mRNA相對表達(±s)

3 討 論

LFA- 1 最初是在CTL介導靶細胞殺傷實驗中發(fā)現(xiàn)的，功能與CTL相關的膜蛋白分子。LFA-1屬于整合素家族的一類黏附分子，能表達于淋巴細胞及中性粒細胞等表面，與細胞內黏附分子ICAM(1-3)結合(其中LFA-1與ICAM-1結合力最強)，引起細胞內產生一系列的信號轉導，從而介導白細胞的黏附、游走及吞噬等功能[2]。牛堅等[3]研究認為，VCAM-1參與單核/巨噬細胞和淋巴細胞向炎癥部位浸潤和NK細胞黏附與遷移，異種肝移植急性排斥反應時，LFA-1mRNA表達明顯升高，VCAM-1的表達明顯升高。若能明顯抑制異種肝移植排斥反應中LFA-1mRNA的表達，則可有效抑制移植排斥反應。研究表明，LFA-1mRNA參與中性粒細胞與血管內皮黏附并穿越血管內皮過程，參與T淋巴細胞的活化過程，并可調節(jié)多種細胞因子的分泌[4]。而介導白細胞向移植部位的浸潤是LFA-1mRNA參與排斥反應發(fā)生的機制之一，而且能啟動T淋巴細胞的黏附和活化，攻擊帶有移植物抗原的靶細胞，增強急性排斥反應程度[5]。此外，還有研究表明，阻斷LFA-1mRNA的結合位點可抑制移植排斥反應。而動物體內實驗[6]的研究表明，LFA-1mRNA單克隆抗體能明顯延長移植鼠的生存期，并且能顯著降低急性移植物抗宿主(graft-versus-host disease，GVHD)的發(fā)生。Dedrick 等[7]在腎移植方面的研究得到相似結果。歐洲多中心開展的Ⅱ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，應用LFA-1 mRNA抗體阻斷LFA-1/ICAM-1協(xié)同刺激信號雖然可降低GVHD的發(fā)生率，提高移植成功率，但同時造成了持續(xù)免疫抑制，增加嚴重感染率和白血病復發(fā)率，致使人類白細胞抗原(HLA)不相合異基因造血干細胞移植的遠期生存率無明顯增加[8]。

本實驗研究結果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，蘇木組和CsA均能降低移植心肌中LFA-1 mRNA 及蛋白的表達。蘇木加半量CsA組對LFA-1mRNA的降低作用好于蘇木組，略低于CsA組，但二者無明顯差異。因此，一方面說明LFA-1mRNA參與了SD大鼠的心臟移植排斥反應；另一方面也更進一步說明蘇木是通過調節(jié)LFA-1mRN發(fā)揮的作用，而在抗排斥方面，蘇木可減少CsA的用量?？梢姡K木乙酸乙酯提取物能明顯改善術后大鼠的一般狀態(tài)，其作用機制可能與蘇木乙酸乙酯提取物能抑制LFA-1mRNA的表達有關，但其抗免疫排斥作用的另一些機制還有待進一步研究。

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(本文編輯郭懷印)

國家重大科技專項(No.2009ZX09103-425)

1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(沈陽110032)，E-mail：80670335@163.com；2.遼寧中醫(yī)藥大學

信息：史海蛟，楊可鑫.蘇木乙酸乙酯提取物對心臟移植模型大鼠LFA-1mRNA表達的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(10)：1183-1186.

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.10.010

1672-1349(2017)10-1183-04

2017-01-06)