梅朝陽，胡 康，張 玉，朱正軍，陳茂彬

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

薏仁酒糟水解工藝的研究

梅朝陽，胡 康，張 玉，朱正軍，陳茂彬

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

為確定蛋白酶水解薏仁酒糟的最佳工藝條件，以多肽得率及水解度為指標對4種蛋白酶進行篩選，確定最佳蛋白酶為堿性蛋白酶，并通過單因素實驗及正交實驗確定其最佳的水解條件底物濃度為6%（m/V），蛋白酶用量為1200 U/g，溫度為55℃，pH值為8.5，反應時間為6 h。在此條件下多肽得率68.12%，溶解氮指數(shù)為94.02%，水解度為22.05%。

薏仁酒糟； 堿性蛋白酶； 水解條件

薏仁作為我國首批公布的藥食同源的食物之一，營養(yǎng)價值極高。薏仁是一種營養(yǎng)平衡的谷物，具有鎮(zhèn)痛消炎、清熱排濕、消腫利尿、健脾潤肺等多種功效[1-4]。薏仁提取物薏仁油具有抗癌活性，其抗癌活性取決于其含有的棕櫚酸、月桂酸、硬脂酸以及亞油酸等不飽和脂肪酸[5-9]。有研究表明，植物蛋白的水解產物多肽具有抑菌[10]、抗氧化[11-12]的特性。薏仁中，蛋白含量豐富，且比例與人體協(xié)調。田曉等[13]用響應面法考察了料液比、溫度和pH值對薏仁蛋白提取的影響，發(fā)現(xiàn)料液比對浸提率影響最大。肽作為薏仁蛋白經蛋白酶部分水解的產物，也是人體的重要功能性成分。董紅艷等[15]以氮溶解指數(shù)(NSI)和水解度(DH)為指標對中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶進行篩選，確定堿性蛋白酶為最佳水解用酶,并確定最佳工藝條件為堿性蛋白酶在底物質量濃度39.95 g/L，酶用量1201.75 U/g，溫度54.61℃，pH值7.99,反應時間4 h。在此條件下，水解后的氮溶解指數(shù)可達95.79%。岳文明等[16]將薏仁蛋白進行酶解后，用不同樹脂吸附，其中DA201-C大孔樹脂吸附率最高，為46.06%，純化后的肽相對分子質量為278.61～943.32。薏仁發(fā)酵酒具有其特有的香氣及較高營養(yǎng)價值，但蛋白質利用極低。酒糟作為薏仁發(fā)酵酒的副產物，蛋白含量在37%左右，具有一定的利用價值。通過對蛋白酶進行初步篩選，得到堿性蛋白酶為最佳蛋白酶，并通過單因素及正交實驗分析了各因素對水解多肽得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

脫脂薏仁酒糟：本實驗室自制；蛋白酶：堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶及復合蛋白酶（諾維信）；其他試劑為分析純。

儀器設備：數(shù)顯恒溫水浴鍋，精宏；FE20實驗室pH計，梅特勒-托利多；TG16-WS臺式高速離心機，湘儀；AP-01P無油真空泵，奧特賽恩斯；K110OF凱氏定氮儀，海能；L-8900氨基酸分析儀，安捷倫；SOX500脂肪測定儀，海能；TB-204分析天平，賽多利斯；ZXFD-B5250鼓風干燥箱，智誠；移液槍，大龍。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶的初步篩選

稱取一定量的脫脂薏仁酒糟，加入適量去離子水進行調漿，分別按照蛋白酶的消解條件（表1）進行水解。在水解過程中不斷加入NaOH（HCl）溶液，保持反應過程中的pH值不變（±0.1）。反應6 h后，85℃水浴10 min使蛋白酶失去活性。

表1 蛋白酶的水解條件

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 底物濃度對水解效果的影響

酶添加量為1000 U/g，pH值為8.5，時間為5 h，溫度為55℃，底物濃度控制為3%、4%、5%、6%、7%、8%，待水解完成后，以多肽得率為指標，確定最佳的底物濃度。

1.2.2.2 酶添加量對水解效果的影響

底物濃度為5%，pH值為8.5，時間為5 h，溫度為55℃，酶添加量控制為600 U/g、800 U/g、1000 U/g、1200 U/g、1400 U/g、1600 U/g，待水解完成后，以多肽得率為指標，確定最佳的酶添加量。

1.2.2.3 溫度對水解效果的影響

底物濃度為5%，酶添加量為1000 U/g，pH值為8.5，時間為5 h，溫度控制為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，待水解完成后，以多肽得率為指標，確定最佳的水解溫度。

1.2.2.4 pH值對水解效果的影響

底物濃度為5%，酶添加量為1000 U/g，溫度為55℃，pH值為8.5，時間控制為3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，待水解完成后，以多肽得率為指標，確定最佳的水解pH值。

1.2.2.5 時間對水解效果的影響

底物濃度為5%，酶添加量為1000 U/g，溫度為55℃，時間為5 h，pH值控制為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，待水解完成后，以多肽得率為指標，確定最佳的水解時間。

1.2.3 正交實驗

由于水解過程受底物濃度、酶添加量、水解溫度、水解時間及水解pH值5個因素的影響，為了全面考慮5個因素對水解工藝的影響，利用水解工藝單因素實驗為依據，設計L16(45)正交實驗，見表2。

表2 薏仁酒糟酶解工藝正交實驗因素與水平

1.2.4 理化指標的檢測

水分含量按GB 5497—1985測定；脂肪的測定按GB/T 14772—2008；蛋白質含量按GB 5009.5—2010測定；水解液中多肽的測定按GB/T 22492—2008。

1.2.5 多肽得率的測定

1.2.6 水解度的測定

式中：C——水解過程中，所加NaOH的濃度（mol/L）；

V——水解過程中，所加NaOH的體積（mL）；

Mp——底物蛋白質的總質量（g）；

α——氨基酸的平均解離度；

htot——底物蛋白質的肽鍵總數(shù)（mmol/g蛋白質，薏仁酒糟蛋白為8.15 mmol/g）。

1.2.7 溶解氮指數(shù)的測定

2 結果與討論

2.1 蛋白酶的初步篩選（圖1）

圖1 蛋白酶種類對水解效果的影響

有研究表明，多肽相對于蛋白質及氨基酸，更容易為人體所吸收。為了提高蛋白質的利用率，在水解過程中，一般多肽的得率越高越好。由圖1可知，堿性蛋白酶的水解效果較佳。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 底物濃度對水解效果的影響（圖2）

圖2 底物濃度對水解效果的影響

薏仁蛋白的水解在不同底物濃度下存在一定的差異，根據酶的特性，在一定底物濃度范圍內，底物濃度越高，酶與底物接觸越充分，水解效果好；超過一定的范圍，底物濃度越高，酶與底物越無法充分接觸，水解效果差。由圖2可知，當?shù)孜餄舛葹?%時，多肽得率最高，底物濃度高于6%，多肽得率急劇下降，因此，較優(yōu)的底物濃度為6%。

2.2.2 酶添加量對水解效果的影響（圖3）

圖3 酶添加量對水解效果的影響

蛋白酶的水解在不同的酶添加量下存在一定的差異，根據酶的特性，在一定的添加范圍內，添加量越高，酶與底物接觸越充分，水解效果越好，超過一定的范圍，過量酶無法與底物充分接觸，造成酶的浪費，甚至抑制水解。由圖3可知，當酶的添加量為1000 U/g時，多肽得率最高；高于1000 U/g時，多肽得率趨于穩(wěn)定，有細微的下降趨勢。因此，較優(yōu)的酶添加量為1000 U/g。

2.2.3 溫度對水解效果的影響（圖4）

圖4 溫度對水解效果的影響

根據酶的特性，一方面，隨著溫度的升高，反應速度越快，另一方面，酶的化學本質為蛋白質，溫度過高會使蛋白質變性。由圖4可知，當溫度小于55℃時，隨著溫度的升高，多肽得率不斷增大；當溫度大于55℃，多肽得率不斷減小。因此，較優(yōu)的水解溫度為55℃。

2.2.4 pH值對水解效果的影響（圖5）

圖5 pH值對水解效果的影響

根據酶的特性，酶受pH值的影響極為顯著，低于或者高于最適pH值，酶的活性迅速降低。由圖5可知，當pH值小于8.5時，隨著pH值的減小，蛋白酶的活性急劇下降，多肽得率不斷減小，當pH值大于8.5時，隨著pH值的增大，蛋白酶的活性急劇下降，多肽得率不斷減小。因此，較優(yōu)的水解pH值為8.5。

2.2.5 時間對水解效果的影響（圖6）

圖6 時間對水解效果的影響

蛋白質的水解分為兩個階段，第一個階段，蛋白質被分解為小分子的多肽，第二個階段，小分子的多肽被分解為氨基酸。開始時，隨著水解的進行，多肽得率不斷增加，當時間達到6 h時，多肽得率達到最大值，繼續(xù)延長水解時間，多肽的得率有下降的趨勢。因此，較優(yōu)的水解時間為6 h。

2.3 正交實驗結果（表3、表4）

由表3極差分析可知，影響薏仁酒糟多肽得率的主次因素為C＞B＞E＞D＞A，即pH值對多肽得率影響最大，其次為酶添加量、時間、溫度，對多肽得率影響最小的是底物濃度，得出最佳水解條件組合為A3B3C3D3E3，即底物濃度為6%，酶添加量為1200 U/g，水解pH值為8.5，水解溫度為55℃，水解時間為6 h。在該最佳條件下進行水解的驗證試驗，多肽得率為68.12%。

表3 堿性蛋白酶酶解薏仁酒糟工藝優(yōu)化正交實驗結果

表4 正交實驗結果方差分析

由表4可知，在α=0.05的水平上，水解pH值的F值＞F臨界值，所以水解pH值對水解影響顯著。

3 結論

通過蛋白酶的初步篩選，確定最佳蛋白酶為堿性蛋白酶，通過單因素及正交實驗，確定堿性蛋白酶的最佳水解條件：底物濃度6%，酶添加量為1200 U/g，水解pH值為8.5，水解溫度為55℃，水解時間為6 h。在此水解條件下，多肽得率為68.12%，溶解氮指數(shù)為94.02%，水解度為22.05%。

一般來說，內切蛋白酶容易產生苦味，外切蛋白酶可以降低苦味。為了降低苦味，可以考慮堿性內切蛋白酶和風味外切蛋白酶結合使用，這樣可以得到低苦味值的生物活性肽。再根據生物活性肽的相應性質，將其添加到食品中，制成具有一定功效的功能食品，這樣既可以為酒廠酒糟的利用提供新的途徑，為企業(yè)帶來附加值，又可以開發(fā)新的產業(yè)鏈。

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Hydrolysis of Spent Grains of Coixseed Wine

MEI Zhaoyang,HU Kang,ZHANG Yu,ZHU Zhengjun and CHEN Maobin
(Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,School of Biological Engineering, Hubei University of Technology,Wuhan,Hubei 430068,China)

In order to determine the best hydrolysis conditions of spent grains of coixseed wine lees by protease,four kinds of protease were screened with peptide yield and hydrolysis degree as the evaluating indicators.As a result,alcalase was the best protease. The best hydrolysis conditions of alcalase were determined by single factors test and orthogonal test as follows:substrate concentration was 6%(m/V),the use level of alcalase was 1200 U/g,temperature was at 55℃,pH was 8.5,and hydrolysis time was 6 h.Under above conditions,the yield of peptide and nitrogen solubility index were 68.12%and 94.02%,and the degree of hydrolysis reached up to 22.05%.

spent grains of coixseed wine;alcalase;hydrolysis conditions

TS262.3；TS261.4；X797

A

1001-9286（2017）06-0103-05

10.13746/j.njkj.2017025

香溢城活性肽酒新產品開發(fā)與生產關鍵技術；國家重點研發(fā)計劃重點專項(2016YFD0400500)。

2017-02-14

梅朝陽（1990-），男，在讀碩士研究生，主要從事食品發(fā)酵研究工作，E-mail：592277301@qq.com。

陳茂彬（1965-），男，教授，博士，主要從事食品發(fā)酵研究工作，E-mail：hgchenmaobin@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-05-26；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170526.1356.002.html。