肖芳，施勇，李健雄，龔甜，劉師文，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

·論著·

基于SH片段的中國(guó)腮腺炎病毒疫苗株與野毒株鑒別方法的建立

肖芳，施勇，李健雄，龔甜，劉師文，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

目的研究建立一種簡(jiǎn)便快速的鑒別中國(guó)腮腺炎病毒疫苗株與野毒株方法。方法在已擴(kuò)增出的小疏水蛋白基因（small hydrophobic gene）（SH基因）上，尋找能將中國(guó)腮腺炎病毒疫苗株區(qū)別于野毒株的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并對(duì)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）的方法進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)證明。結(jié)果非腮腺病毒RT-PCR結(jié)果均未見(jiàn)陽(yáng)性條帶，說(shuō)明RT-PCR方法特異。PCR產(chǎn)物經(jīng)BclI酶切作用后，腮腺炎野毒株將會(huì)被酶切為170bp和340bp兩個(gè)片段，而疫苗株則被酶切為270bp和240bp兩個(gè)片段。結(jié)論新建立的RT-PCR-RFLP是一種快速、簡(jiǎn)便的鑒別中國(guó)腮腺炎病毒疫苗株與野毒株的方法。

腮腺炎病毒；疫苗株；野毒株；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

腮腺炎病毒是一種不分節(jié)段、單負(fù)鏈的RNA病毒，它屬于副粘病毒科腮腺炎病毒屬。腮腺炎病毒基因組結(jié)構(gòu)為：3’N-P-M-F-SH-HN-L-5’，分別編碼以下蛋白：核殼蛋白（N），磷酸化蛋白（P），膜蛋白（M），融合蛋白（F），小疏水蛋白（SH），血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）及大蛋白（L）。其中SH基因是整個(gè)腮腺炎病毒基因組中變異最大的部分，它常常被用作腮腺炎毒株型別及毒株間同源性分析[1]。2008年，我國(guó)將腮腺炎減毒活疫苗納入國(guó)家免疫規(guī)劃，18～24月齡接種1劑麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗或麻疹-腮腺炎聯(lián)合減毒活疫苗。2009年江西省將腮腺炎納入擴(kuò)大免疫規(guī)劃項(xiàng)目[2]?，F(xiàn)階段，中國(guó)使用的腮腺炎疫苗均為減毒活疫苗，且為A基因型，主要是S79株和Jeryl-lynn株[3]。目前，全球發(fā)現(xiàn)的腮腺炎病毒有12個(gè)基因型，但只有一個(gè)血清型[4]。通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)無(wú)法鑒定腮腺炎病毒的基因型別，也無(wú)法區(qū)分是疫苗株還是野毒株感染。江西省目前腮腺炎病毒流行株的基因型為F基因型[5]，這與中國(guó)目前的優(yōu)勢(shì)基因型是一致的[6～9]。大多數(shù)國(guó)家都是依靠測(cè)序后序列分析的方法來(lái)鑒定腮腺炎病毒的基因型別及區(qū)分疫苗株還是野毒株[10]。但序列分析的方法受條件限制很難廣泛開(kāi)展，因此建立一種快速簡(jiǎn)便易操作的鑒別腮腺炎疫苗株與野毒株的方法非常必要。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction FragmentLength Polymorphism，RT-PCRRFLP）技術(shù)具有簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)、容易推廣的優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)所使用的流行性腮腺炎（腮腺炎）病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、流感病毒、水痘病毒均分離于江西省疾病預(yù)防控制中心病毒實(shí)驗(yàn)室，麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗（Measles，Mumps，Rubella Combined Attenuated Live Vaccine；MMR）（上海生物制品有限公司）為現(xiàn)在江西省預(yù)防接種所使用。

1.2 試劑QIAGEN RNeasy Mini Kit(生產(chǎn)批號(hào)：151042932)；QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：151046825)；BclI限制性?xún)?nèi)切酶(New England Biolabs公司，生產(chǎn)批號(hào)：6121305)。

1.3 方法

1.3.1 腮腺炎毒株的分離將抗生素處理過(guò)的腮腺炎病人咽拭子標(biāo)本接種于已長(zhǎng)成單層的Vero-Slam細(xì)胞上，每天觀察細(xì)胞病變（CPE），連續(xù)觀察7d，當(dāng)＞75%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，凍融后-80℃冰箱保存。未產(chǎn)生CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融，如前培養(yǎng)盲傳3代。

1.3.2 病毒核酸的提取提取所獲得的出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物核酸。取病毒細(xì)胞培養(yǎng)液200μl，采用德國(guó)QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取，具體步驟參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.3.3 腮腺炎SH基因序列的擴(kuò)增與測(cè)定

1.3.3.1 RT-PCR擴(kuò)增SH基因及序列測(cè)定采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒對(duì)提取的培養(yǎng)物核酸進(jìn)行MuV SH基因RT-PCR擴(kuò)增。所用引物序列為[11]：SH 5-1 AATATCAAGTAGTGTCGATGA，SH 5-2 AGGTGCAAAGGTGGCATTGTC。反應(yīng)條件為：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，逆轉(zhuǎn)錄；94℃變性45s，55℃退火40s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min[12]。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物(約長(zhǎng)500bp)，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)定。

1.3.3.2 序列整理及分子生物學(xué)信息分析已測(cè)序的序列用DNAStar 5.0的Seqman進(jìn)行序列的拼接，從GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)下載MuV各基因型的參考序列進(jìn)行序列比對(duì)分析。采用Mega 4.0軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建及遺傳距離的分析。

1.3.4 腮腺炎病毒野毒株與疫苗株鑒別RT-PCRRFLP方法

1.3.4.1 酶切反應(yīng)的條件取上述PCR產(chǎn)物3μl、BclI限制性?xún)?nèi)切酶(New England Biolabs公司)0.45 μl、10×NEB緩沖液1μl、H2O 5.55μl。對(duì)照管為10μl PCR產(chǎn)物。將酶切管與對(duì)照管同時(shí)置于50℃水浴2h，腮腺炎野毒株將會(huì)被酶切為170bp和340bp兩個(gè)片段，而疫苗株則被酶切為270bp和240bp兩個(gè)片段。見(jiàn)圖1。

圖1 酶切圖譜分析

1.3.4.2 電泳One-step RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及RFLP酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與鑒定咽拭子標(biāo)本接種到Vero-Slam細(xì)胞上經(jīng)盲傳3代后，90%細(xì)胞出現(xiàn)融合病變，經(jīng)RT-PCR方法鑒定為腮腺炎病毒，分離的腮腺炎毒株在約500bp處有一條清晰的條帶，見(jiàn)圖2。

圖2 RT-PCR結(jié)果

2.2 SH基因片段的序列測(cè)定結(jié)果將所獲得的腮腺炎毒株SH基因的316個(gè)核苷酸片段與WHO提供的12個(gè)基因型的17株參考株相對(duì)應(yīng)的核苷酸片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示所分離的腮腺炎毒株與WHO提供的MuV F基因型參考株Z77160-WSH1-CNA96-F、Z77158-WLZ1-CNA95-F最為接近，并形成獨(dú)立的分支，故分離株為F基因型。見(jiàn)圖3。

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 腮腺炎病毒特異性檢驗(yàn)對(duì)腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、流感病毒、水痘病毒進(jìn)行RNA或DNA提取，經(jīng)RT-PCR或PCR擴(kuò)增，腮腺炎病毒核酸擴(kuò)增為陽(yáng)性，在500bp處呈現(xiàn)陽(yáng)性電泳條帶；非腮腺炎病毒的病毒核酸擴(kuò)增為陰性，與之前預(yù)期的結(jié)果一致。見(jiàn)圖4。

圖4 腮腺炎病毒特異性檢驗(yàn)結(jié)果

2.4 RFLP方法鑒別腮腺炎野毒株與疫苗株的結(jié)果經(jīng)BclI限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，分離到的腮腺炎病毒野毒株能被該酶切成170bp和340bp兩個(gè)片段，而疫苗株則被酶切為270bp和240bp兩個(gè)片段，由此來(lái)提示該毒株為腮腺炎野毒株。見(jiàn)圖5。

圖5 BclI酶切前后的電泳圖

3 討論

兒童腮腺炎疫苗常規(guī)免疫在2008年以麻風(fēng)腮三聯(lián)苗的形式引入中國(guó)。如今使用的麻風(fēng)腮疫苗中的腮腺炎疫苗株為S79株和Jeryl-lynn株。腮腺炎疫苗的使用大大降低了我國(guó)腮腺炎病毒的發(fā)病率，但也有研究顯示，Jeryl-lynn疫苗株可引起與腮腺炎野毒株類(lèi)似的中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)[13]。目前中國(guó)對(duì)MuV未形成系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)體系，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道由于接種腮腺炎疫苗導(dǎo)致的腦膜炎，但在國(guó)外已有相關(guān)的報(bào)道[14，15]。因此，在接種腮腺炎疫苗后證明腮腺炎感染是疫苗株還是野毒株導(dǎo)致尤為重要。本研究中，根據(jù)我國(guó)現(xiàn)有腮腺炎野病毒基因型分布情況，建立了適用于我國(guó)的對(duì)腮腺炎病毒野毒株與疫苗株RT-PCR-RFLP快速鑒別方法。

小疏水蛋白SH基因在整個(gè)腮腺炎病毒的基因組蛋白中變異最大，全長(zhǎng)316bp，編碼57個(gè)氨基酸，功能尚不清楚，對(duì)病毒的復(fù)制是一種非必須蛋白，是腮腺炎病毒分型的依據(jù)[16]。有一項(xiàng)最新的研究認(rèn)為SH蛋白可以作為一種信號(hào)途徑特異性的阻斷由腫瘤壞死因子-（TNF-）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，是一種涉及逃逸宿主抗病毒反應(yīng)的膜內(nèi)蛋白[17]。目前，除了遼寧、福建、陜西在2011年發(fā)現(xiàn)了G基因型的腮腺炎病毒外，其余有文獻(xiàn)報(bào)道的省份腮腺炎病毒的優(yōu)勢(shì)基因型仍是F基因型[18，19]。所以我們要區(qū)別腮腺炎野毒株和疫苗株主要是要區(qū)別F基因型與A基因型。許多作者都報(bào)道過(guò)Urabe株或Jeryl Lynn株的P、F、SH和HN基因處的核苷酸序列與野毒株不同[20-23]。我們?cè)赟H基因片段處用RFLP，一種簡(jiǎn)單、靈敏的方法從野毒株中區(qū)分疫苗株。腮腺炎病毒SH基因的核苷酸變異比較大，為316bp，本研究所利用的一步法RT-PCR具有較好特異性。利用所建立的RFLP方法對(duì)分離的MuV株與腮腺炎疫苗株SH片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行BclI酶切作用后，分離到的MuV毒株能被該酶切成170bp和340bp兩個(gè)片段，而疫苗株則被酶切為270bp和240bp兩個(gè)片段。腮腺炎病毒疫苗株與野毒株鑒別方法的建立，對(duì)腮腺炎疫苗納入免疫規(guī)劃后腮腺炎樣病例的監(jiān)測(cè)具有實(shí)際意義，對(duì)科學(xué)區(qū)分由接種MuV疫苗引起的相關(guān)病例和MuV野病毒感染引起的腮腺炎病例具有指導(dǎo)意義。本研究所建立的RT-PCR-RFLP方法是一種快速、簡(jiǎn)便，又經(jīng)濟(jì)實(shí)用的鑒別MuV株與腮腺炎野病毒株的方法，容易推廣和普及。

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The establishment of method for identifying China vaccine strains and wild strains of Mumps virus based on the SH fragment

XIAO Fang，SHI Yong，LI Jianxiong，GONG Tian，LIU Shiwen，XIONG Ying.
Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective To establish a simple and quick method for identifying China vaccine strains and wild strains of Mumps Virus.Methods To search the enzyme site in Small Hydrophobic gene of mumps virus for different domestic vaccine strains and wild strains of mumps virus and then to confirm the specificity of the RT-PCR method，and then to identify the RT-PCR product by RFLP.Results No positive bands can be found in the non-mumps virus strains，it means that the RT-PCR method has good specificity，the PCR products of China mumps vaccine strains of S79 and Jeryl-lynn were all cut into two fragments(270bp and 240bp)by BclI，but mumps wild virus strains were all cut into two fragments(170bp and 340bp)by BclI.Conclusion The RTPCR-RFLP method we established is a rapid and simple method for identifying China vaccine strain and wild strain of mumps virus.

∶Mumps virus；Mumps vaccine virus strain；Mumps wild virus strain；Reverse transcription-polymerase chain reaction；Restriction fragment length polymorphism

R373.1+6，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0297-04

2016-10-31；

2017-04-20)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.002

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃(20111522)

肖芳，女，1984年生，碩士研究生，主管技師，從事病毒檢驗(yàn)工作，E-mail：181272013@qq.com。

熊英，女，1968年生，碩士研究生，主任技師，研究方向?yàn)榉肿硬《緳z測(cè)，E-mail：18079125868@163.com。