劉蘭，周培華

(廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西玉林537000)

全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜法測定花生油中黃曲霉毒素B1

劉蘭，周培華

(廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西玉林537000)

目的建立花生油中黃曲霉毒素B1的快速準(zhǔn)確檢測方法。方法以四通道全自動(dòng)固相萃取儀(Automated Solid Phase Extraction Apparatus，ASPEA)對(duì)樣品提取液進(jìn)行自動(dòng)凈化，再通過高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)帶熒光檢測器，聯(lián)合柱后衍生儀對(duì)花生油樣品中所含有黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示黃曲霉毒素B1的工作曲線為：Y=531.92X-387.02；r=0.9991。方法的重復(fù)性RSD=2.18%；方法精密性RSD=1.58%。測定樣品黃曲霉毒素B1含量濃度為1.632μg/kg～81.6μg/kg；加標(biāo)回收率為90.3%～110.8%。結(jié)論所建立方法快速靈敏，綠色環(huán)保，9min完成分析，適合多批次食品中黃曲霉毒素B1的快速準(zhǔn)確檢測。

全自動(dòng)固相萃取儀；黃曲霉毒素B1；重復(fù)性；精密度；回收率

黃曲霉毒素為真菌黃曲霉菌和寄生曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其毒性在所有真菌毒素和化學(xué)毒物中為最強(qiáng)，是世界公認(rèn)的分布最廣，危害最大的一類毒素，可分為B1，B2，G1，G2和M1等18種，其中B1的毒性最強(qiáng)，是目前已知的毒性最強(qiáng)的致癌物，屬Ⅰ類致癌物[1，2]。對(duì)人體肝臟細(xì)胞有損害作用，可誘發(fā)肝癌的發(fā)生[3，4]。通過隨機(jī)抽樣及試驗(yàn)檢測，發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1易存在于霉變的堅(jiān)果、糧油中，如花生、玉米及其制品花生油、玉米粉，偶見于陳皮，少見于大米、米粉、腐竹等食品中。黃曲霉毒素B1的檢測方法包括薄層色譜法[2]、酶聯(lián)免疫吸附法[1，2，5]、高效液相色譜法[6，7]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]、以及基于核酸熒光的先進(jìn)測定方法[11，12]。本文改進(jìn)了高效液相色譜帶熒光檢測器及柱后衍生儀對(duì)黃曲霉毒素B1的含量進(jìn)行測定的方法[13]，采用了全自動(dòng)固相萃取裝置對(duì)樣品提取液通過免疫親和柱的自動(dòng)凈化。國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中黃曲霉毒素B1的含量限度大多在5～20μg/kg[14]。隨著新的食品安全法的頒布實(shí)施，對(duì)食品安全要求更加嚴(yán)格，國家對(duì)食品安全的監(jiān)管力度加強(qiáng)，抽檢范圍覆蓋廣，抽檢批數(shù)多，準(zhǔn)確和快速的測定方法是必須的。當(dāng)然隨著科技的發(fā)展，國內(nèi)近年來也涌現(xiàn)出一些控制產(chǎn)品中黃曲霉毒素的含量和對(duì)食品中存在的黃曲霉毒素的降解方面的相關(guān)研究[15，16]。本實(shí)驗(yàn)通過試驗(yàn)建立對(duì)花生油中黃曲霉毒素B1的含量進(jìn)行了測定的快速，高效，準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料黃曲霉毒素B1對(duì)照品為國家糧食局科學(xué)研究院，批號(hào)：GBW（E）090015a，濃度為1.02μg/ml；固相萃取免疫親和柱Beacon公司，規(guī)格為300ng，3ml；色譜純甲醇Thermo Scientific；水為超純水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備ML3002電子天平METTLER TOLEDO；GX-274 ASPEC四通道全自動(dòng)固相萃取儀GILSON；U3000高效液相色譜儀Thermo Scientific；柱后衍生儀Pickering Pinnacle；超純水系統(tǒng)Millipore Synergy；VXR B S25基本型振蕩器IKA；G560E漩渦震蕩儀。

1.3 樣品花生油(散裝和預(yù)包裝)樣品來自玉林、貴港市區(qū)及轄區(qū)各縣。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件高效液相色譜儀：Thermo C18反相色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相配比為甲醇：水=55：45，流速為0.8ml/min，柱溫為30℃；熒光檢測器激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為450nm；進(jìn)樣量為10μl。

柱后衍生儀：碘液濃度為0.05%，流速為0.2ml/min，衍生反應(yīng)溫度為70℃。

1.4.2 對(duì)照品溶液制備精密吸取黃曲霉毒素B1對(duì)照品溶液1ml置25ml容量瓶，用甲醇稀釋定容到刻度，搖勻，即得儲(chǔ)備液為40.8ng/ml。再分別精密吸取不同體積到10容量瓶，用甲醇稀釋定容到刻度，搖勻，得到系列濃度為0.408ng/ml到40.8ng/ ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。檢出限濃度為0.408ng/ml，折算為S/N=3時(shí)，方法實(shí)際檢出限為0.2μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)檢出限為1μg/kg。

1.4.3 供試品溶液制備樣品經(jīng)過260r/min回旋振蕩器振搖30min混勻，再取樣。準(zhǔn)確稱取經(jīng)上述方法處理樣品25.00g至250ml具塞錐形瓶中，加入氯化鈉5.00g，再準(zhǔn)確加入甲醇：水（7：3）125.0ml，經(jīng)過260r/min回旋振蕩器振搖提取35min，定量濾紙過濾，棄去初濾液，準(zhǔn)確移取續(xù)濾液15.0ml到50ml離心管中，加入30.0ml水稀釋，搖勻，即得。

1.4.4 供試品溶液凈化制備好的供試品溶液經(jīng)過全自動(dòng)固相萃取裝置按表1的條件，按上樣、淋洗雜質(zhì)、洗脫順序凈化后，2ml洗脫液收集于2ml容量瓶，經(jīng)過渦旋混勻后，再通過0.45μm的尼龍濾膜過濾，收集續(xù)濾液于進(jìn)樣小瓶，以備高效液相色譜儀分析。凈化過程中的淋洗液為水，洗脫液為甲醇。

表1 全自動(dòng)固相萃取儀萃取條件

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)

2.1.1 精密度取濃度為0.816ng/ml對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，黃曲霉毒素B1衍生后色譜峰保留時(shí)間RSD=0.75%及色譜峰響應(yīng)值按峰面積計(jì)算RSD=1.58%。數(shù)據(jù)顯示儀器的精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性在檢出黃曲霉毒素B1的花生油樣品中，選取同一批次的樣品，取6份平行樣，經(jīng)過提取，再經(jīng)過自動(dòng)固相萃取，凈化后的黃曲霉毒素B1衍生色譜峰保留時(shí)間RSD=1.03%及色譜峰響應(yīng)值按峰面積計(jì)算RSD=2.18%。數(shù)據(jù)顯示樣品按本實(shí)驗(yàn)條件處理重復(fù)性良好。

2.1.3 回收實(shí)驗(yàn)在花生油的檢測中，黃曲霉毒素B1國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定最高殘留限量（MRL）為20μg/kg[14]。選擇最低定量限，合適含量點(diǎn)，最高殘留限量3點(diǎn)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度分別為0.816ng/ml，4.08ng/ml， 10.2ng/ml做回收試驗(yàn)，各取兩份樣加標(biāo)。取樣量為25.00g，稀釋倍數(shù)為50倍。試驗(yàn)結(jié)果見表2顯示回收率范圍為90.3%～110.8%。表明試驗(yàn)方法可行性良好。

表2 回收率

2.2 樣品測定結(jié)果對(duì)所抽取的花生油205批次的樣品測定結(jié)果（見表3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)檢出批次及超過國家標(biāo)準(zhǔn)限度[14]的批次占所檢驗(yàn)樣品的比率還是比較低，檢測超限的樣品主要來源于少數(shù)小作坊的自制壓榨散裝花生油。產(chǎn)生原因由于南方潮濕氣候?qū)е略习l(fā)霉，以及壓榨器具長期使用沒有清洗。

表3 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相本實(shí)驗(yàn)所用流動(dòng)相為甲醇：水=55：45，流速為0.8ml/min，黃曲霉毒素B1保留時(shí)間為9min，且黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1之間達(dá)到所需分離度要求，主要是B1與相鄰的B2分離度達(dá)到要求（圖1、圖2）。在大批量檢測的時(shí)候，可以大量節(jié)約時(shí)間，保證結(jié)果的準(zhǔn)確和及時(shí)性。

圖1 黃曲霉毒素B1液相色譜圖

圖2 黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1液相色譜圖

3.2 檢測波長在GB/T 17909-2003中選擇熒光檢測器具有激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為420nm以上；在《中國藥典》中黃曲霉毒素檢測中選擇激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為450nm，通過實(shí)驗(yàn)，發(fā)射波長對(duì)測定結(jié)果數(shù)據(jù)影響不大。

3.3 實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新首先對(duì)照品溶液的配置及洗脫液選擇以甲醇代替苯乙腈，減少了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的危害，凈化過程選擇全自動(dòng)固相萃取裝置，可以提高效率，同時(shí)也減少試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的危害。最后，在得到的流動(dòng)相配比條件下黃曲霉毒素B1的保留時(shí)間為9min，可以快速準(zhǔn)確測定樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

最后，通過對(duì)多批次的花生油中黃曲霉毒素B1的測定，及結(jié)果數(shù)據(jù)分析，黃曲霉毒素B1的檢出率及不合格率是相對(duì)較低的，對(duì)于大多數(shù)市場生產(chǎn)和流通的花生油，可以放心食用，不必要對(duì)花生油中存在黃曲霉毒素B1產(chǎn)生恐慌。同時(shí)花生油的生產(chǎn)廠家應(yīng)該做好花生油原材料的選擇、保存和壓榨器皿的衛(wèi)生清潔工作。

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Determination of Aflatoxin B1 in Peanut Oil by High Performance Liquid Chromatography With Automated Solid Phase Extraction Apparatus

LIU Lan，ZHOU Peihua.
Yulin Institute for Food and Drug Contorl，Yulin Guangxi 537000，China.

Objective To establish a rapid and accurate method for detection of aflatoxin B1 in peanut oil.Methods This paper mainly introduces purifying aflatoxin B1 in the samples with the ASPEA(automated solid phase extraction apparatus).Then，test AFB1 with HPLC(high performance liquid chromatography)，the detector of HPLC is fluorescence detector which is linked with a post column derivatization which was installed before the detector.Results The results show the working curve of this experiment was as follows：Y=531.92x-387.02；r=0.9991.The repeatability and the precision expressed as RSD values were 2.18%and 1.58%.The concentration of AFB1 in the samples was range from 1.632μg/kg to 81.6μg/kg；rates of recovery were in the range of 90.3%to 110.8%for AFB1 in food.Conclusions This method can complete analysis within 9 min，and is suitable for fast，accurate and environmental friendly determination of AFB1 in multi-batch food.

∶Automated solid phase extraction；Aflatoxin B1；Repeatability；Precision；Rate of recovery

R155.5，TS207.3

A

1674-1129(2017)03-0312-03

2017-02-15；

2017-04-28)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.006

劉蘭，女，1986年生，工程師，工學(xué)碩士，主要從事食品藥品檢驗(yàn)研究分析。E-mail：ll43091003@126.com